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そうかやぬま
5 years ago
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1 上原記念生命科学財団研究報告集, 25 (2011) 152. 慢性脳低潅流モデルマウスを用いたアドレノメデュリンの血管新生および血管保護効果による認知機能改善効果についての検討猪原匡史 Key words: アドレノメデュリン, 認知症, 血管京都大学大学院医学研究科臨床神経学緒言認知症の患者数は, 寿命の延長に伴い年々増加し現在, 日本で約 200 万人いるとされており, 今後さらに増加していくと予測されている. 認知症は, 患者本人の QOL を低下させるのみではなく, 長期にわたる介護者の負担, 医療費, 福祉サービスの需要の増大など, 社会的に大きな問題となっている. 動脈硬化に伴う脳血管障害, 脳血流低下に基づく虚血性白質病変は, 認知機能障害に密接に関わることから, 脳血管機能を保持し脳血流低下を改善するような治療法が虚血性白質病変および認知機能障害を軽減することが期待される. しかし, 現時点でそのような治療法は存在しない. アドレノメデュリン (adrenomedullin, AM) は 1993 年に血小板内環状アデノシン一リン酸 (camp) を上昇させる物質としてヒト褐色細胞腫から同定された 52 個のアミノ酸からなる血管作動性ペプチドホルモンである.AM は多彩な生理活性をもち, 血管に対しても, 血管拡張, 血管透過性調節, 血管内皮のアポトーシス酸化ストレス抑制, 血管平滑筋増殖調節, 血管新生など多くの作用を示すことが報告されている. そのため本研究では, 皮質下血管性認知症モデルである慢性脳低灌流モデルマウスにおいて,AM が血管新生および血管保護作用により白質病変および認知機能障害を軽減するかを検討した. 方法結果および考察皮質下血管性認知症モデルである慢性脳低灌流モデルマウスは, 両側総頚動脈に 0.18 mm の微小コイルを装着する (bilateral common carotid artery stenosis, BCAS) ことにより作成した (Fig. 1A). 循環血漿中の AM が過剰に発現しているマウスと同腹仔の野生型マウスに対して BCAS 手術および偽手術を行い,AM の作用について検討した 1). また, 血管内皮増殖因子 (VEGF) は, 血管新生に関わる主要因子の一つであり,AM は in vivo,in vitro ともに VEGF の発現を亢進すると報告されている 2) ことから,AM の作用機序について検討する目的で,VEGF 中和抗体を用いた阻害実験を行った 3). まず, 脳血流の経時的変化をレーザースペックル脳血流画像化法により解析した. 虚血手術を施行した AM 過剰発現マウスでは, 手術後 7 日目の時点から同手術を施行した野生型マウスと比較して有意な脳血流の改善がみられ, その効果は 7 日目以降も持続した. この作用は VEGF 中和抗体投与により 14 日目以降, 有意に抑制され,AM による血流増加作用は一部 VEGF を介していることが示唆された (Fig. 1B, 1C). 1

Fig. 1 Adrenomedullin facilitates recovery of cerebral blood flow after bilateral common carotid artery stenosis (BCAS) partially through VEGF induction.

2 Fig. 1 Adrenomedullin facilitates recovery of cerebral blood flow after bilateral common carotid artery stenosis (BCAS) partially through VEGF induction. (A) Representative photographs of common carotid arteries (CCAs; left panel) and FITC-perfused CCAs (right panel) of pre-bcas and post-bcas mouse (immediately after BCAS). Arrows indicate carotid bifurcation. (B) Representative images showing temporal changes of CBF in wild-type (WT) and adrenomedullin (AM)-Tg mice after BCAS. (C) Temporal profile of CBF after BCAS in wild-type (WT) (n=16 on days 0 14, n=8 on day 28), adrenomedullin (AM)-Tg (n=16 on days 0 14, n=8 on day 28), WT injected with anti-vegf antibody (WT/anti-VEGF; n=10), AM-Tg injected with anti-vegf antibody (AM-Tg/anti-VEGF; n=15), where the pre-bcas value of CBF is adjusted to 100. Values are expressed as means ± SEM. I, immediately. 次に血管形成の評価として細小動脈以上のレベルで再構築される動脈新生 arteriogenesis と毛細血管レベルでの血管新生 angiogenesis について解析した Arteriogenesis の評価として致死量のパパベリンを投与し血管平滑筋を最大限に弛緩させた後一定の圧 150 mmhg で carbonblack/latex を上行大動脈から灌流させ脳表と脳底部における血管を描出した BCAS 後 7 日目の AM 過剰発現マウスにおいてウィリス動脈輪軟髄膜血管吻合の有意な血管径の増加がみられた (Fig. 2A-2D) さらに arteriogenesis において重要とされる血管平滑筋の増殖と血管への単球/マクロファージの動員を観察するために α-smooth muscle actin 平滑筋マーカーと Ki-67 増殖マーカー F4/80 単球/マクロファージマーカーのそれぞれについて免疫蛍光二重染色を行い脳表部で評価した BCAS 後 7 日目の AM 過剰発現マウスにおいて Ki-67 陽性となる血管平滑筋の比率は BCAS 後 7 日目の野生型マウスと比較して有意に多く周囲に F4/80 陽性細胞がみられる血管平滑筋の比率は偽手術後 7 日目の野生型マウスと比較して有意に多いことが示された 2

3 Fig. 2. Adrenomedullin enhances arteriogenesis after bilateral common carotid artery stenosis (BCAS). (A, B) Representative images of the dorsal cerebral angioarchitecture by postmortem latex perfusion method of wild-type or AM-Tg mouse that is subjected to BCAS operation (WT BCAS or AM BCAS) on day 7. Scale bars, 1 mm. (C) Diagram showing the diameter of the leptomeningeal anastomoses (WT sham, n=4; AM sham, n=4; WT BCAS, n=6; AM BCAS, n=6; AM BCAS/anti-VEGF, n=5). Values are expressed as means ± SEM. (D) Diagram showing the diameter of the anterior, middle, and posterior cerebral arteries (ACA, MCA, and PCA) and the posterior communicating artery (Pcom; WT sham, n=4; AM sham, n=4; WT BCAS, n=6; AM BCAS, n=6; AM BCAS/anti-VEGF, n=5). Values are expressed as means ± SEM. また,angiogenesis の評価は,PECAM-1 による免疫組織染色を行い,3-8μm の毛細血管密度を定量した. 大脳皮質, 脳梁, 基底核の領域で, 毛細血管密度の有意な増加がみられた (Fig. 3A-3C). これらの作用は VEGF 中和抗体投与により一部抑制された (Fig. 2C, 2D, 3C). 以上より,AM による arteriogenesi/angiogenesis 促進作用は一部 VEGF を介していることが示唆された. 脳血管内皮における酸化ストレスを 8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン (8-OHdG) をマーカーとして評価した.BCAS 後 3 日目の AM 過剰発現マウスにおいて, 血管内皮細胞における酸化ストレスは野生型マウスと比較して有意に軽減していた. この作用は VEGF 中和抗体投与によっても有意な差はみられず,AM による酸化ストレス抑制作用は VEGF に依存しないと考えられた (Fig. 3D). 3

Fig. 3. Adrenomedullin enhances angiogenesis and attenuates the oxidative damage in brain microvessels after bilateral common carotid artery stenosis (BCAS).

4 Fig. 3. Adrenomedullin enhances angiogenesis and attenuates the oxidative damage in brain microvessels after bilateral common carotid artery stenosis (BCAS). (A, B) Representative images of the PECAM-1-positive capillaries in sections from the corpus callosum of wild-type or AM-Tg mouse that is subjected to BCAS operation (WT BCAS or AM BCAS) on day 7. Scale bar, 50μm. (C) Histogram showing capillary densities within the cortex, the corpus callosum (CC), and the caudoputamen (CP) of the five groups of the mice (WT sham, n=4; AM sham, n=4; WT BCAS, n=6; AM BCAS, n=6; AM BCAS/anti-VEGF, n=5). Error bars indicate SD. *P<0.05, **P<0.01 in AM BCAS vs. WT BCAS; #P<0.05, ##P<0.01 vs. WT sham; $P<0.05 in AM BCAS vs. AM BCAS/anti-VEGF. (D) Histogram showing the oxidative damage in microvessels of the corpus callosum of the three groups of the mice (n=4 each). Error bars indicate SD. *P<0.05 vs. WT BCAS. さらに, 白質変化を免疫組織化学法と Klüver-Barrera 染色法により評価した. 手術後 28 日目の時点で,BCAS 後の AM 過剰発現マウスにおいて, 白質における星状膠細胞小膠細胞の活性化は有意に抑制され, 乏突起膠細胞の減少は阻止された. また, 白質粗鬆化は有意に抑制され,AM による白質保護効果が示された. 最終的な表現型である認知機能を, 手術後 28 日目の時点で Y 迷路試験と放射状迷路試験の 2 つの方法で評価した. いずれの試験においても,AM 過剰発現マウスにおいて BCAS 後の作業記憶障害の有意な軽減がみられた. この改善効果は VEGF 中和抗体投与により部分的に抑制され,AM による認知機能改善作用には,VEGF の直接作用や VEGF を介する血管新生血流増加作用が一部寄与していることが示唆された (Fig. 4). 4

5 Fig. 4. Adrenomedullin prevents working memory deficits after bilateral common carotid artery stenosis (BCAS) partially through VEGF induction. (A) Histogram showing spontaneous alternation in the Y maze test of WT or adrenomedullin (AM)- Tg mice at 1 month after the sham operation (WT sham, n=17; AM sham, n=10) or BCAS operation (WT BCAS, n=26; AM BCAS, n=17). Error bars indicate SD. **P<0.01 in AM BCAS vs. WT BCAS; ##P<0.01 vs. WT sham. (B) Histogram showing spontaneous activity in the Y maze test. Error bars indicate SD. (C) The number of revisiting errors in the 8-arm radial maze test at 1 month after BCAS of WT, AM-Tg mouse, and WT or AM-Tg mouse injected with anti-vegf antibody (WT BCAS, n=19; WT BCAS/anti-VEGF, n=10; AM BCAS, n=17; AM BCAS/anti-VEGF, n=15). Values were expressed as means ± SEM. AM の作用機序を検討する目的で, 脳組織中の camp の発現量を放射免疫測定法により,VEGF と塩基性線維芽細胞増殖因子 (bfgf) の発現量をリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法とウェスタンブロット法により定量した.BCAS 後 5 日目の AM 過剰発現マウスにおいて, 脳組織中の各因子の有意な上昇をみとめた (Fig. 5A-5C). また, 脳組織における受容体活性調節タンパク質 (RAMP2) の発現は,AM 過剰発現マウスにおいて偽手術群では, 野生型マウスと比較して有意に低下し,BCAS 後には発現が上昇した.RAMP2 は, カルシトニン様受容体とともに AM 受容体複合体を形成し,AM-RAMP2 系は血管新生維持のために重要であると報告されている 4). この結果から,AM 過剰発現マウスにおいて偽手術群では効果を発 5

6 揮しなかった理由として,ligand である AM が過剰に循環しているため RAMP2 が downregulate され AM-RAMP2 系が cancel out されていた可能性が考えられた. さらに AM 過剰発現マウスに虚血負荷がかかると, この downregulation が解除され,AM-RAMP2 系が亢進し,AM が効果を発揮するという可能性が考えられた. Fig. 5. Adrenomedullin increases camp, VEGF, and bfgf levels in the brain after bilateral common carotid artery stenosis (BCAS). (A) Histogram showing camp levels in the brain of wild-type or AM-Tg mice on day 5 after the sham operation or BCAS operation (WT sham, n=4; AM sham, n=5; WT BCAS, n=5; AM BCAS, n=5). Error bars indicate SD. *P<0.05 in AM BCAS vs. WT BCAS; ##P<0.01 vs. WT sham. (B, C) Histogram showing the mrna levels of VEGF (B) and bfgf (C) in the brains of WT or AM-Tg mice on days 1 and 5 (n=5 7 each). Error bars indicate SD. #P<0.05 vs. WT sham; P<0.05 in AM sham vs. AM BCAS. (D) Histograms showing the mrna levels of adrenomedullin receptor, RAMP2 in the brain of WT or AM-Tg mouse that is subjected to sham or BCAS operation (WT sham, n=7; AM sham, n=5; WT BCAS, n=7; AM BCAS, n=7) on day 5. The mrna levels were presented as ratios relative to the levels of 18S rrna. Error bars indicate SD. #P<0.05 vs. WT sham. 6

7 以上の結果より, 慢性脳低灌流モデルマウスにおいて,AM が脳血流回復, 血管新生促進, 血管内皮の酸化ストレス抑制性に作用し, 白質病変および認知機能障害を軽減することが示された.AM は, 皮質下血管性認知症の治療法となり得る. 共同研究者本研究の共同研究者は, 京都大学医学部付属病院内分泌代謝内科の中尾一和, 慶応義塾大学医学部付属病院腎臓内分泌代謝内科の伊藤裕, 京都大学生命科学系キャリアパス形成ユニット放射線腫瘍学の原田浩, 三重大学医学部附属病院神経内科の冨本秀和である. また, 本研究は, 京都大学大学院医学研究科臨床神経学の眞木崇州による実験全般にわたる多大なる貢献と, 同臨床神経学の高橋良輔の助言があり完遂し得たことを申し添える. 本稿を終えるにあたり, 本研究を御支援いただきました上原記念生命科学財団に深謝申し上げます. 文献 1) Maki, T., Ihara, M., Fujita, Y., Nambu, T., Miyashita, K., Yamada, M., Washida, K., Nishio, K., Ito, H., Harada, H., Yokoi, H., Arai, H., Itoh, H., Nakao, K., Takahashi, R. & Tomimoto, H. : Angiogenic and vasoprotective effects of adrenomedullin on prevention of cognitive decline after chronic cerebral hypoperfusion in mice. Stroke, 42 : , ) Iimuro, S., Shindo, T., Moriyama, N., Amaki, T., Niu, P., Takeda, N., Iwata, H., Zhang, Y., Ebihara, A. & Nagai, R.:Angiogenic effects of adrenomedullin in ischemia and tumor growth. Circ. Res., 95 : , ) Maki, T., Ihara, M., Fujita, Y., Nambu, T., Harada, H., Ito, H., Nakao, K., Tomimoto, H. & Takahashi, R. : Angiogenic roles of adrenomedullin through vascular endothelial growth factor induction. NeuroReport, 22: , ) Ichikawa-Shindo, Y., Sakurai, T., Kamiyoshi, A., Kawate, H., Iinuma, N., Yoshizawa, T., Koyama, T., Fukuchi, J., Iimuro, S., Moriyama, N., Kawakami, H., Murata, T., Kangawa, K., Nagai, R. & Shindo, T.:The GPCR modulator protein RAMP2 is essential for angiogenesis and vascular integrity. J. Clin. Invest., 118:29-39,

日本標準商品分類番号カリジノゲナーゼの血管新生抑制作用カリジノゲナーゼは強力な血管拡張物質であるキニンを遊離することにより高血圧や末梢循環障害の治療に広く用いられてきた最近では糖尿病モデルラットにおいて増加する眼内液中 VEGF 濃度を低下させることにより血管透過性を抑制す

日本標準商品分類番号カリジノゲナーゼの血管新生抑制作用カリジノゲナーゼは強力な血管拡張物質であるキニンを遊離することにより高血圧や末梢循環障害の治療に広く用いられてきた最近では糖尿病モデルラットにおいて増加する眼内液中 VEGF 濃度を低下させることにより血管透過性を抑制す日本標準商品分類番号 872491 カリジノゲナーゼの血管新生抑制作用カリジノゲナーゼは強力な血管拡張物質であるキニンを遊離することにより高血圧や末梢循環障害の治療に広く用いられてきた最近では糖尿病モデルラットにおいて増加する眼内液中 VEGF 濃度を低下させることにより血管透過性を抑制することが示されたが血管新生に対するカリジノゲナーゼの影響を評価した報告はないそこで今回網膜血管新生に対するカリジノゲナーゼの役割を同定するため