108 細胞分化因子刺激および RNA 干渉による PAR-2 発現機構の検討米田祐也楢原真二 1) 田野尻玲華 2) 松岡美優 2) 松原未波 2) 宇都宮すず 2) 原口紗弥佳 2) 前田絵莉華 2) 熊本保健科学大学 1) 熊本保健科学大学学生 2) はじめに : ヒト消化器系がん細胞株で

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あきおかたづ
5 years ago
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1 108 細胞分化因子刺激および RNA 干渉による PAR-2 発現機構の検討米田祐也楢原真二 1) 田野尻玲華 2) 松岡美優 2) 松原未波 2) 宇都宮すず 2) 原口紗弥佳 2) 前田絵莉華 2) 熊本保健科学大学 1) 熊本保健科学大学学生 2) はじめに : ヒト消化器系がん細胞株では Protease 細胞内にシグナル伝達する受容体である PAR-2(Protease-activated-receptor-2) の発現増加が報告されている全身性炎症反応症候群 (SIRS) は活性化好中球から種々の Protease が遊離されまた悪性腫瘍から TNF-α(Tumor Necrosis Factor: 腫瘍壊死因子 ) が出て癌悪液質が進行する本研究ではヒト結腸腺癌由来の COLO201 細胞株を用いて RNA 干渉を行い PAR-2mRNA と TNF-αmRNA の発現及び関連性の検討を行った材料方法 : ヒト結腸腺がん由来の COLO201 細胞株を用いて好中球エラスターゼ (HNE) 刺激をし RNA を抽出し RT-PCR 法にて cdna を増幅した後電気泳動により PAR-2mRNA の発現を確認したさらにエレクトロポレーション法による RNA 干渉を行い PAR-2m RNA と TNF-αmRNA の発現及び関連性の検討を行った COLO201 の細胞刺激は 6 時間で行い 0ng/mL(Brank) 10ng/mL の2 濃度を用いて行っている RNA の抽出は QIAGEN RNeasy Mini kit を使用し RT-PCR は TaKaRa 社の PrimeScript RT-PCR kit で行った 2 の変化と HNE 刺激後の干渉で PAR-2 を抑制した時の TNF-α の発現の有無を研究中であるまとめ : COLO201 細胞における PAR-2 遺伝子の発現を RT-PCR 法にて増幅し電気泳動によって検討した HNE 刺激をしていない COLO201 細胞における PAR-2 遺伝子の発現は電気泳動によって確認できたが再現性に問題があり実験を継続中である HNE 刺激での PAR-2 の変化と干渉で PAR-2 を抑制した時の TNF-α の発現の有無についても研究中である ( 連絡先 ) 結果 : HNE 刺激なしの COLO201 細胞で PAR-2 の発現がみられた現在のところ COLO201 細胞を HNE で刺激した時の PAR-

2 109 K562 細胞における PAR-2 発現について北村りさ子楢原真二 1) 宇都宮すず 2) 田野尻玲華 2) 原口紗弥佳 2) 前田絵莉華 2) 松岡美優 2) 松原未波 2) 熊本保健科学大学 1) 熊本保健科学大学学生 2) はじめに PAR-2(protease-activated receptor-2) は生体内に広く分布し種々の機能の制御に関与していると報告されている膵癌細胞増殖おいて PAR-2 activation が認められ Tissue Factor で PAR-2 の活性化とそれによる血管増殖作用が行われ腫瘍細胞が増殖されると報告されているまた K562 細胞 ( ヒト慢性骨髄性白血病 ) では PAR-2 の発現が認められるとのごく少数の報告もあるが発現してないとの多くの報告がなされている今回我々は K562 細胞に PAR-2 が発現しているかを RT-PCR 及び nested PCR 法にて検討を行った方法細胞培養した K562 細胞と positive control として COLO201 細胞 ( ヒト結腸腺癌 ) を用いた RNA 抽出は QIAGEN RNeasy Mini kit を使用し cdna および PCR は Prime Script RT- PCR Kit (TaKaRa) を用い指示書に従って作製したなお cdna 作製に RNA 量は 1000ng 用いた PAR-2 1st PCR は forward primer 5 - AGAAGCCTTATTGGTAAGGTT-3 Reverse primer 5 -AACATCATGACAGTTCGTGAT-3 にて増幅を行った Nested PCR はプライマー設計支援ソフトウェア primer3 で設計し Forward primer 5 -CTGCATCTGTCCTCACTGGA-3 Reverse primer 5 -CAGAGAGGAGGTCAGCCAAG-3 にて増幅した結果 1st PCR で Positive control である COLO201 細胞では mrna の発現が認められたが K562 細胞から mrna の発現は確認できなかった Nested PCR では K562 細胞から mrna の発現が確認できたさらに同時再現性を高めるために研究を行っている考察白血病細胞株 K562 は種々の化学物質により赤芽球系細胞や巨赤芽球系細胞に分化することが知られているしかし培養を続けるうちに本来の形質が変化し正常に分化しなくなることがある同様に PAR-2 mrna 発現にも形質変化による差などが原因として考えられる通常 K562 細胞では PAR-2 発現は認められないがごく微量であり nested PCR など感度の良い検出法が求められる今回確立させた nested PCR 検出法を行うことで発現量と TNF などのサイトカインとの関連性などの解明が期待できる PAR-2 はがん細胞などで高率に発現しがんの成長に関与しているとの報告がされている最近の PARs に関する研究で炎症での関与の理解が急速に進み PAR- 2 は様々な腫瘍において血管新生を誘導し腫瘍の増殖や進展に関わっていると考えられている ( 連絡先 )

3 110 子宮体癌細胞株より分取した side population 細胞の生物学的特性解析富安聡 1) 国際医療福祉大学福岡保健医療学部医学検査学科 1) はじめに癌幹細胞とは幹細胞特性である自己複製能分化能に加え高い造腫瘍能を有しており極少数の細胞により癌を形成することができ癌組織の維持増大に関与している細胞であるさらに癌幹細胞は薬剤排出能を有すると共に DNA 修復能が亢進しているそのため化学療法や放射線療法に高い抵抗性を示し治療後に残存することにより癌の再発に関与している従って癌幹細胞が存在する限り癌の根治は困難であり癌幹細胞を標的とする新規治療法の開発が望まれているまた浸潤転移においても癌幹細胞が関与していると考えられていることから癌幹細胞は治療標的としてだけではなく浸潤転移の機序を解明する上でも重要な知見を与えるものと考えられる近年本邦における子宮体癌の罹患率は生活習慣の変化により著しい増加傾向を示している全子宮体癌の組織型のうち類内膜腺癌が 80% 以上を占めており分化度により高分化型から低分化型に分類される分化度が高いほど予後は良く estrogen receptor (ER) および progesterone receptor (PgR) の発現が高いことが知られている子宮体癌の治療は外科的療法が主体となっており化学療法や放射線療法は再発の危険性が高い症例に対する補助療法として行われることが多い子宮体癌幹細胞を同定しその特性を解明することは子宮体癌の発癌機構の解明新規治療法の開発に繋がると考えられるしかし子宮体癌幹細胞は同定されておらず早急に解決すべき課題となっている目的本研究ではヒト子宮体部類内膜腺癌細胞株より薬剤排出能を指標として side population (SP) 細胞を分取しその生物学的特性解析を行うことで癌幹細胞を同定することを目的とした対象および方法ヒト子宮体部類内膜腺癌細胞株 Ishikawa 3-H-12 ( 高分化型 ) を対象として fluorescence activated cell sorting (FACS) 解析により薬剤排出能を有する SP 細胞と薬剤排出能を持たない main population (MP) 細胞を分取し癌幹細胞特性である自己複製能分化能造腫瘍能を比較解析したまた ER および PgR 発現解析浸潤能解析を行った結果 SP 細胞および MP 細胞を分取後 3 週間培養し再度 FACS 解析を行ったところ SP 細胞は SP 細胞の維持と共に MP 細胞への分化を示した一方 MP 細胞から SP 細胞の出現は認められなかった造腫瘍能解析では SP 細胞は MP 細胞と比較して少数の細胞数においても高い腫瘍形成率を示した ER および PgR 発現解析では SP 細胞は ER PgR 発現ともに MP 細胞と比較して低値を示したさらに浸潤能解析を行ったところ SP 細胞は MP 細胞と比較し高い浸潤能を示した考察結果より薬剤排出能を指標として分取した SP 細胞は癌幹細胞特性である自己複製能分化能造腫瘍能を有する細胞であることから SP 細胞中には癌幹細胞が存在することが示唆されたまた癌幹細胞は MP 細胞を構成する非癌幹細胞よりも低分化な細胞であり浸潤能が高いことから浸潤転移に関与していることが示唆された連絡先 :

4 111 当館における HER2-FISH 法導入後の現状中村朱 1) 坂井真一 1) 平野敬之 1) 阿部美智 1) 地方独立行政法人佐賀県医療センター好生館検査部 1) はじめに分子標的薬の出現進歩により遺伝子染色体解析を用いた分子病理学的診断が注目される中当館においても平成 26 年 11 月より遺伝子検査室を立ち上げた肺癌の EGFR 遺伝子変異 UGT1A1 遺伝子多型 JAK2 遺伝子変異 HER2- FISH(Fluorescence in situ hybridiza tion) 法の導入を行った今回体外診断薬として認可されたのち胃癌にも適応範囲が広がり薬剤投与に重要な検査となっている HER2- FISH 法の当館における現状を報告する方法 HER2-FISH 法館内導入前 2 年間 (2013 年 2 月 ~2015 年 2 月 ) の外部委託時の結果 (IHC(Immuno histochemistry) 法 2+ のみ HER2- FISH 法を検査センターへ外部委託 ) と比較した館内導入後は HER2 遺伝子キット :HER-2 FISH( パスビジョン HER-2 DNA プローブキット ) を用い 10% 中性緩衝ホルマリンで 4~ 72 時間固定した FFPE ( ホルマリン固定パラフィン包埋 ) を使用した FISH 法は 5μm IHC 法は 4μm に薄切し同時に検査を行った HER2- FISH 法における判定は HER2 検査ガイド第 3 版に従い浸潤部で 20 細胞シグナルをカウントしシグナル比 2.2 以上を増幅あり 1.8 以下を増幅なしとした 1.8 から 2.2 のものについては 20 細胞追加でカウントを行い最終的にシグナル比 2.0 以上を増幅ありの結果とした 2015 年 4 月から 2016 年 5 月までの乳癌 90 件 ( 切除 76 件生検 14 件 ) を対象とした結果館内導入前の外部委託時 HER2 遺伝子増幅陽性率 14% に対し導入後は 90 件中 17 件 ( 切除 12 件生検 5 件 ) の 18% と増加した IHC 法 2+ 以上のものに限ると 38 件中 17 件の 44.7% であった IHC 法 1+ 以下ではすべてにおいて増幅なしの結果であった IHC 法と FISH 法で乖離のみられたものが 1 件存在したまた IHC 法 2+で FISH 法は増幅なしとなったが HER2 遺伝子コピー数の平均が 1 細胞あたり 6.0 を上回るものが 1 件あった組織型別に検討をしてみると硬癌 14 件 /49 件乳頭癌 2 件 /10 件が増幅ありの結果であった増幅ありとなった 17 検体中 16 件が MIB1index14% 以上のものであった結語 HER2-FISH 法を館内導入後陽性率が 4% 増加した乳癌症例の 15%~25% で HER2 遺伝子の増幅と HER2 タンパクの過剰発現が認められると言われており当館においても 18% で相違ない結果であった免疫染色 3+, FISH 増幅なしの症例 ( 乳腺小細胞癌 ) を 1 例経験した FISH 法 2.0 以下で HER2 遺伝子コピー数の平均が 1 細胞あたり 6.0 を上回るものを経験し HER2 検査ガイド乳癌編の第 3 版と第 4 版での解釈に問題性を感じた HER2-FISH 法の結果により患者の治療選択が左右されるため的確な結果の解釈ができることが患者に貢献できると考える連絡先 ( 内線 :1682)

5 112 Loop-Mediated Isothermal Amplification による抗酸菌群の検出松永佳奈恵 1) 宮地侑耶 1) 佐藤謙一 1) 真藤和弘 2) 船島由美子 1) 原田哲太 2) 永沢善三 1) 梅村創 2) 国際医療福祉大学福岡保健医療学部医学検査学科 1) 医療法人社団高邦会高木病院 2) はじめに Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) 法は最も代表的な核酸増幅法である Polymerase Chain Reaction(PCR) のような温度変化サイクルを行わない等温下における核酸増幅反応であるこの方法は増幅効率がよく感度特異性が高くかつ反応時間が短い迅速な方法であるため臨床検査において主に感染症の原因となる微生物の検出法として重用されている本邦では特に肺結核症の原因となる Mycobacterium tuberculosis(mtb) の検出のために LAMP 法を利用している施設が多いしかしながら内部コントロールの設定がないため塗抹鏡検スクリーニング陽性で LAMP 法による MTB 検出が陰性の場合材料からの核酸抽出が失敗したためか非定型抗酸菌が存在するためかを区別できないそこで当研究では抗酸菌群全般を検出するユニバーサルプライマーと臨床上同定が望まれる肺 MAC 症の原因となる M. avium(mav) および M. intracellulare(min) それぞれを検出する特異的プライマーを用いた LAMP 法による検出系を確立し臨床的有用性を評価することを目的とした方法対象 : 臨床検体から分離培養された抗酸菌株 35 例を対象試料とした核酸抽出 : 小川培地培養コロニーを滅菌精製水に懸濁し 95 で 10 分間のインキュベート後 15,000rpm にて 1 分間遠心した上清を DNA 試料とした塩基配列決定および相同性検索 :LAMP 法の対照法として抽出した DNA 試料の 16SrRNA 遺伝子 gyrb 遺伝子および rpob 遺伝子の塩基配列を決定し相同性検索によりそれぞれの種を同定した塩基配列決定は BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit と Genetic Analyzer 3500( 共に Thermo Fisher scientific) を用い相同性検索は相同性検索サイト (Blast : EzTaxon-e: および le BIBI: にて実施した LAMP 法 : ユニバーサルプライマーは 16SrRNA 遺伝子の保存領域 MAV と MIN の特異的プライマーはそれぞれ gyrb 遺伝子をターゲットとして設計した増幅反応は Bst DNA Polymerase( ニッポンジーン ) を用いリアルタイム濁度測定装置 LoopampEXIA ( 栄研化学 ) にて分の条件で行なった結果塩基配列決定および相同性検索結果より 35 例の分離株から 13 種の抗酸菌が同定されたこれら 35 例について LAMP 法においてユニバーサルプライマーの抗酸菌群に対する感度特異度と MAV および MIN 特異的プライマーの MAV または MIN に対する感度特異度について検討しているところでるまとめ LAMP 法による MTB 同定は陰性の場合の判断に苦慮する場合があるユニバーサルプライマーによる LAMP 法が陽性であれば非定型抗酸菌群の存在が確認できさらに MAV および MIN 特異的プライマーによって MAC あるいは MIN の同定が可能であり臨床的有用性が示されると考える連絡先 :

( 様式甲 5) 学位論文内容の要旨論文提出者氏名論文審査担当者主査教授大道正英髙橋優子副査副査教授教授岡田仁克辻求副査教授瀧内比呂也主論文題名 Versican G1 and G3 domains are upregulated and latent trans

( 様式甲 5) 学位論文内容の要旨論文提出者氏名論文審査担当者主査教授大道正英髙橋優子副査副査教授教授岡田仁克辻求副査教授瀧内比呂也主論文題名 Versican G1 and G3 domains are upregulated and latent trans ( 様式甲 5) 学位論文内容の要旨論文提出者氏名論文審査担当者主査大道正英髙橋優子副査副査岡田仁克辻求副査瀧内比呂也主論文題名 Versican G1 and G3 domains are upregulated and latent transforming growth factor- binding protein-4 is downregulated in breast