274 コバス TaqMan48 を用いた液体培地からの抗酸菌検出澤村卓宏 1) 森部龍一 2) 社会医療法人大雄会第二医科学研究所 1) 社会医療法人大雄会総合大雄会病院 2) [ 目的 ] 我々はコバス TaqMan48( ロシュダイアグノステックス ) を用いた液体培地からの抗酸菌検出に関

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せせらしのしま
5 years ago
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1 274 コバス TaqMan48 を用いた液体培地からの抗酸菌検出澤村卓宏 1) 森部龍一 2) 社会医療法人大雄会第二医科学研究所 1) 社会医療法人大雄会総合大雄会病院 2) [ 目的 ] 我々はコバス TaqMan48( ロシュダイアグノステックス ) を用いた液体培地からの抗酸菌検出に関する基礎的検討を実施した [ 対象および方法 ] 対象はマイコアシッド ( 極東製薬工業 ) にて陽性と判定された 25 例を用い判定後の液体培地を生理食塩水にて 100 倍および 1000 倍に希釈し 100μL を g にて 5 分間の遠心後のペレットを解析に供した試料の調整はアンプリコアマイコバクテリウム検体前処理試薬セット ( ロシュ ) およびタックマンマイコ用検体処理試薬添加剤セット SOL-M ( ロシュ ) を用いて能書に従い実施した処理後の試料はコバス TaqMan MTB( ロシュ以下 MTB) およびコバス TaqMan MAI( ロシュ以下 MAI) を用いてコバス TaqMan 48 で増幅検出を行い AmpliLink ソフトウエア ( ロシュ ) にて判定しさらに TaqMan MYCO 内部コントロール ( ロシュ以下 IC) の Ct 値の解析を実施し得られた Ct 値と TaqMan MTB(+) コントロール ( 以下 MTB),TaqMan MAV(+) コントロール ( 以下 MAV) および TaqMan MIN (+) コントロール ( 以下 MIN) の Ct 値を比較した併せて direct sequence 法で得られた結果と判定とを比較した [ 結果 ] 判定は M. tuberculosis 1 例 M. avium 12 例 M. intracellulare 9 例および混合感染 1 例の陽性を示した MTB では 100 倍希釈で 6 例の IC の増幅不良 (Invalid) を示したが 1000 倍希釈およびコバス MAI ではいずれの希釈倍率においても IC の増幅を認めたコントロールにおける IC の Ct 値 (mean ± SD) は TB, MAV および MIN でそれぞれ 37.5 ± 0.4, 36.8 ± 0.4 および 37.4 ± 1.3 を示した試料における Ct 値は TB の 100 倍および 1000 倍で 38.7 ± 1.7 および 37.6 ± 1.0 となり MAV および MAI では 37.0 ± 1.4 および 36.7 ± 0.8 を示し MTB の 100 倍において高値傾向を示した direct sequence 法の結果よりコバス TaqMan48 の判定は妥当であった [ 考察およびまとめ ] コバス TaqMan48 による液体培地からの抗酸菌検出は可能であると考えられた TB における IC の増幅不良および IC の Ct 値の高値傾向から当院のシステムは試料の 1000 倍希釈が適切であると考えられた

2 275 長期療養型病院における耐性菌の解析基質拡張型 β ラクタマーゼ (ESBL) とメタロ β ラクタマーゼ (MBL) 大竹京子 1) 松村充 2) 医療法人社団富家会富家病院 1) 帝京大学医療技術学部 2) 目的近年各種抗菌薬に対し耐性を獲得した菌株が出現し院内感染の問題となっている当院から第 3 世代セファロスポリン耐性の Escherichia coli Proteus mirabilis Klebsiella pneumoniae イミペネム耐性の Pseudomonas aeruginosa が検出されそれらの株について解析を行った方法 2013 年 11 月 ~2014 年 2 月に提出された検体 56 件を対象とした第 3 世代セファロスポリン耐性 E.coli P.mirabilis K.pneumoniae およびイミペネム耐性 P.aeruginosa について基質拡張型 β ラクタマーゼ (ESBL) メタロ β ラクタマーゼ (MBL) の確認試験を武蔵臨床検査所に依頼した ESBL が陽性と判定された株については PCR 法による耐性遺伝子解析を実施した結果セファロスポリン耐性 3 菌種のすべての株は ESBL 陽性と判定された検体材料は喀痰尿がほとんどを占めた菌種は P.mirabilis が半数を占め次いで E.coli が多かった耐性遺伝子は CTX-M1 型 16 株 CTX-M2 型 21 株 CTX- M9 型 7 株 SHV 型 2 株不明 6 株であった材料別にみると喀痰では P.mirabilis が大半を占め全て CTX-M2 型であった尿は E.coli が半数以上を占め CTX-M1 型が多かったイミペネム耐性 P.aeruginosa は 32 株主に喀痰から検出されそのうち 3 株が多剤耐性緑膿菌 (MDRP) であった 3 株のうち 1 株から MBL 陽性菌が検出されたが材料は尿であった考察とまとめ本邦では CTX-M9 型が最も多く検出されるが当院では CTX-M2 型次いで CTX-M1 型が多かった現在 MBL 陽性菌および MDRP は検出されていない当院の患者は半数が気管切開大半がオムツを使用するため人の手を介する患者が多いそのため医療従事者が菌の伝搬をしている可能性が示唆される医療従事者のみならず全職員が知識の共有周知が必要と考える今後臨床検査技師ができることとして薬剤感受性結果のチェックや耐性遺伝子の解析をすることはますます重要になると考えられる

3 276 Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 法を利用した GyrA 遺伝子変異の検出梅谷昌司 1) 松永洋 1) 中嶌雅信 1) 馬場義広 1) 国立療養所沖縄愛楽園 1) はじめに :Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 法は一定温度で DNA を増幅できるため特別な機器を必要とせず簡易迅速精確な検査法で感染症の簡易迅速診断が可能となり臨床検査の現場にも多く導入されている LAMP 法は 6 つ領域にプライマーを設定することにより感度特異性に優れ LAMP プライマーの設計は専用ソフトを使用し比較的簡単にプライマーの設計が可能であるそこで耐性遺伝子解析に LAMP 法の適用を図った目的方法 : 本研究では Escherichia coli の GyrA 遺伝子を標的 DNA としてプライマーを設計し LAMP 法により増幅するその増幅産物から標的 DNA の塩基配列の確認ができることを検討する対象は当園で分離した株を使用した結果 :65 40 分の反応において LAMP 産物の増幅を確認した今回はループプライマーを使用していないので増幅曲線の立ち上がりが 32 分前後から認められため 60 分に反応時間を変更した LAMP 産物を電気泳動にて確認した LAMP 産物はループ状に増幅されるため泳動像はラダーパターンを示したまた DNA シークエンス解析は読み始めの 10~30 塩基はエラーが起こり 80 塩基前後からシグナルの減少が起こった塩基を読めたのは 180 塩基前後までとなった 3 つの株 (E4,18,21) の塩基配列を解析すると GyrA 83,87 に塩基配列の変異を確認したまとめ : 今回我々は LAMP 法を用いて任意の DNA 領域を増幅し DNA シークエンスを解析することができた LAMP 法ではプライマー設計が大きな壁となるがプライマーエクスプローラーにより比較的簡単に設計することができた LAMP 法の使用目的のほとんどが検出用であると思われるがプライマーをどの領域に設定するのかによって検出だけに留まらない今後は使用目的が広がり応用範囲は拡大するものと考える連絡先国立療養所沖縄愛楽園研究検査科梅谷昌司

4 277 当院における POT 法を用いた MRSA の分子疫学解析の検討森崎隆裕 1) 中井依砂子 1) 黒田亜里沙 1) 幸福知己 1) 川口正彦 1) 一般財団法人住友病院 1) はじめに MRSA は院内感染対策上最も重要な耐性菌のひとつであり当院では 2003 年より入院時術前化学療法前血液内科病棟および ICU 入室時などを対象とした鼻腔による MRSA アクティブサーベイランスを行っている 2014 年 8 月から POT 法を導入し入院外来問わず新規検出 MRSA 全例の POT 型を解析したので報告する対象当院にて 2014 年 8 月以降に検出された新規 MRSA 60 株を対象とした方法菌株をヒツジ血液寒天培地( 日本 BD) にて 24 時間培養後シカジーニアス分子疫学解析キット ( 関東化学 ) を用いて POT 値を測定し POT 型を決定した結果新規検出 MRSA60 株は 34 の POT 型に分けられ 60 株中 28 株は 1 株ずつ独立した POT 型を示した同一株が複数見られた型は 6 種で POT 型が 20 株と最も多く次いで POT 型 POT 型が 3 株 POT 型 POT 型 POT 型が 2 株であった考察 POT 型の 20 例の内入院 48 時間以降に検出された 2 例は院内伝播が疑われる事例であった残り 18 例の内 17 例は外来または入院時の鼻腔スクリーニングからの検出でその内 10 例は当院への入院歴があり入院中に院内伝播した可能性が否定できず残り 7 例は当院への入院歴はなく市中での流行株の可能性が考えられたまとめ POT1 が 106 の MRSA は市中感染型と言われているが今回解析した結果 POT 型の株は市中での流行株もしくは院内での定着伝播の両方の可能性が示唆された今後症例数を増やし院内や地域における MRSA の POT 値の分布などを解析し POT 法の有用性についてさらに検討していきたい連絡先 : ( 内線 6040)

5 278 当院における外来患者由来 MRSA 株の POT 法による解析について小川将史 1) 奥田和之 1) 笠井香里 1) 大畑加恵 1) 西本瑛紀子 1) 東良子 1) 角坂芳彦 1) 高橋伯夫 2) 関西医科大学附属枚方病院臨床検査部 1) 関西医科大学臨床検査医学講座 2) はじめにメチシリン耐性ブドウ球菌(MRSA) は代表的な院内感染の原因菌であり感染制御上重要な菌である Phage Open Reading Frame Typing 法 (POT 法 ) はマルチプレックス PCR により MRSA クローンを簡便に同定できるため MRSA の院内伝播を把握する上で非常に有用であるしかし健常者においても MRSA 保菌者は散見されるため検出された株が院内感染によるものかを同定することはしばしば困難である近年院内型 MRSA(HA-MRSA) と比較して非常に強い病原性を持つ市中感染型 MRSA(CA- MRSA) が問題となっているそこで今回我々は市中における MRSA クローンの実態を把握するため新規に外来患者より検出された MRSA 株について POT 法ならびに毒素産生遺伝子解析を行ったので報告する対象および方法対象は 2013 年 7 月 ~2014 年 11 月までの外来患者より新規に検出された MRSA89 株 POT 法は鈴木らの方法に従いまた PCR により各種毒素産生遺伝子 (PVL TSST- 1 ETA ETB) の有無を調べた結果外来患者由来株について POT 法を実施した結果 59 種類の MRSA クローンが検出されそのうち複数クローンは 10 種類検出された数種類のクローンにおいては同時期における入院患者からも複数検出されたまた毒素産生遺伝子についても検討したが POT ナンバーとの関連性はなかったまた CA-MRSA において特に問題となっている PVL 産生遺伝子についても調べたが今回測定した株では認められなかった考察外来患者より検出された MRSA 株を用いて POT 法を実施した結果院内でも検出されたクローンが複数検出されたまた POT1 の数値は MRSA クローンと相関しておりいわゆる院内感染型と言われる株も多数検出されたため入院時におけるスクリーニングや入院歴の把握が重要であると考えられた今回の検討では PVL 産生遺伝子を持つ MRSA は認めなかったが本邦においても CA- MRSA による症例は報告されており今後増加することが予想されるため毒素産生株について詳細に把握することは非常に重要と考える連絡先 (072) ( 内線 3259)

浜松地区における耐性菌調査の報告

浜松地区における耐性菌調査の報告平成 28 年度浜松地区感染対策地域連携を考える会 2017 年 2 月 22 日浜松地区耐性菌サーベイランス報告浜松医科大学医学部附属病院感染対策室概要平成 19 年 4 月に施行された改正医療法によりすべての医療機関において管理者の責任の下で院内感染対策のための体制の確保が義務化されました本サーベイランスは静岡県浜松地区 ( 浜松市湖西市 ) における薬剤耐性菌の分離状況や薬剤感受性の状況を調査し