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1 平成 20 年度修士卒業論文 Pseudoalteromonas のヴィオラセイン合成酵素遺伝子 vioa のクローニングと発現 Cloning and expression of the violacein-synthesizing enzyme gene vioa from Pseudoalteromonas. 高知工科大学大学院 工学研究科基盤工学専攻 阿波連毅成 2009 年 3 月

2 目次 第一章 はじめに 1-1 要約 背景 3 第二章 実験材料および方法 2-1 vioa 塩基配列の検索 ゲノム DNA の抽出 プライマー設計 PCR 反応とゲル電気泳動 DNA シーケンス 組換え発現ベクターの調製 組換えベクターの確認 10 第三章 結果と考察 P1 株 vioa 遺伝子の塩基配列決定 組換えベクターの確認 16 第四章総括 18 第五章謝辞 文献 19 付録 20 2

3 第一章 はじめに 1-1. 要約青紫色素ヴィオラセイン (violacein) 産生に至るまでに酵素 vioa~vioe を必要とする事が分かっている そのため ヴィオラセイン産生細菌である Pseudoalteromonas sp. 520P1 株 vioa のクローニングと発現に取り組んだ まず vioa 塩基配列が決定されている violacein 産生細菌の Chromobacterium violaceum Janthinobacterium lividum Pseudoalteromonas tunicata の遺伝子間の相同性を元にプライマーを設計し 520P1 株のゲノムを鋳型として vioa を増幅する PCR を試みたが 目的の遺伝子を得る事が出来なかった 520P1 株の同属である P. tunicata の vioa 遺伝子を元にプライマーを設計し PCR を行った これにより 520P1 の vioa 遺伝子の一部が得られたので この PCR 産物の塩基配列を決定し この配列を元に再度プライマーを設計し 520P1 vioa の全塩基配列を決定した 次に vioa タンパク質の発現を調べるため ベクター pet28(a) に全塩基配列を決定した 520P1 株 vioa 遺伝子を組み込み 大腸菌 BL21(DE3) を形質転換した これにより得られた形質転換体を培養し イソプロピル 1-チオ-β-D-ガラクトシド (IPTG) による誘導を行いタンパク質の発現を SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた 1-2. 背景本研究室が室戸海洋深層水から得た青紫色素産生細菌 Pseudoalteromonas sp.520p1 株 (1) は青紫色素 violacein を産生する事が分かっている (2) ヴィオラセインは抗菌作用 抗腫瘍作用 抗トリパノソーマ作用をもつ事が知られている (3) ヴィオラセイン合成経路については遺伝子解析や酵素学的研究が行われてきた (4-6) C. violaceum のヴィオラセイン合成遺伝子群は vioa viob vioc viod vioe から構成され トリプトファンを基質として vioa viob vioe viod vioc が順次触媒する反応によりヴィオラセインが生合成されると推定されている (4)(Fig.1) 3

4 violacein Fig.1 ヴィオラセインの合成経路 Fig.1 に見られるとおり 酵素 vioa はトリプトファンを基質とするため 中間体を基質とする他の酵素 viob ~ vioe と比べ酵素活性の研究が容易である そのため まず Pseudoalteromonas sp. 520P1 株 vioa のクローニングとタンパク質発現に取り組んだ Balibar et al. (4) は C. violaceum の組み換え vioa 酵素を使ってトリプトファンを基質とする反応を試験管内で行い 生産物であるインドール-3-ピルビン酸 (IPA) が生じる事を HPLC による分析で示した しかし 520P1 株と C. violaceum ではアミノ酸の相同性がかなり低い事より 酵素の特性が違っていることが予想されるため 520P1 株の vioa のクローニングとタンパク質発現に取り組んだ 4

5 第二章 実験材料および方法 2-1. vioa 塩基配列の検索まず violacein 産生細菌の中で vioa 配列が決定されている Chromobacterium violaceum Janthinobacterium lividum Pseudoalteromonas tunicata の vioa 遺伝子の配列を NCBI の DNA データベースである GenBank により調べ DNA 塩基配列解析ソフトウェア GENETYX 用いて相同性を調べた 以下に C. violaceum J. lividum P. tunicata の vioa 遺伝子の配列の GenBank 登録番号を示す C.violaceum AB / J.lividum DQ / P.tunicata AAOH ゲノム DNA の抽出 PPES-Ⅱ 斜面培地にて保存してある青紫色素産生細菌 Pseudoalteromonas sp. 520P1 株から菌体の一部をかきとり PPES-Ⅱ 寒天プレート培地に塗布し 20 で培養した 形成されたコロニーを 5ml PPES-Ⅱ 液体培地に植菌し 2 日間 20 にて静置培養した 培養物 5ml を QIAamp DNA Mini Kit を用い このキットのプロトコールに従ってゲノム DNA の抽出を行った 2-3. プライマーの設計 C. violaceum J. lividum P. tunicata それぞれの vioa 塩基配列 ( 付録 [1] 参照 ) を比較し 前半と後半部分のこの 3 種の配列に共通する塩基配列を元に Fw1 Rv1 Fw2 Rv2 (Table 1) を設計した また P. tunicata の vioa 塩基配列 ( 付録 [2] 参照 ) の一部を選択し Ptu-Fw01 Ptu-Rv01 Ptu-Fw02 Ptu-Rv02 (Table 1) を設計した 5

6 この論文で使用したプライマーを Table 1 に示す Table 1 使用したプライマー 名称配列備考 Fw1 Fw2 Ptu-Fw01 Ptu-Fw02 520P1-Fw03 Ptu-Fw04 EcoRⅠ-Fw05 ATATCCATTGTAGGGGCTGG AGTTTCGGGA CTTGGCGCAGGTCGATACTC ACCGCAGCTG ATGTCGAATCAAGAAAATAT TATATCCATT CACACTGTGGCTGGATGGAA GGCGGTGTTA CGAATAACCCAAGGGGATAT GATCGTCACA ACCGCTCATGTACTTTTTAC CCAGCCTCAT CCGGAATTCATGTCGAATCA AGAAAATACT P. tunicata vioa の 塩基目 P. tunicata vioa の 塩基目 P. tunicata vioa の 1-30 塩基目 P. tunicata vioa の 塩基目 520P1vioA の 塩基目 P. tunicata vioa の前の-521~-491 塩基目 520P1vioA の 1-30 塩基目 名称配列備考 Rv1 Rv2 Ptu-Rv01 Ptu-Rv02 520P1-Rv03 Ptu-Rv04 HindⅢ-Rv04 HindⅢ-Rv05 GCCTTCCATCCAGCCGCAGT G AAACTCGACGCCATGCGGCC AATACTTGTG TAACACCGCCTTCCATCCAG CCACAGTGTG TCAACATCGCATTGAATTGC ATCAGCCATA AATAATATCGTAAGCAATAT TGGGGGTGAT TATCAAGCGTATTATTGATA TTTCTGTTTG CCCAAGCTTTATCAAGCGTA TTATTGATAT CGGGATCCTTATTCATGACT ATCGGTCATG P. tunicata vioa の 塩基目 P. tunicata vioa の 塩基目 P. tunicata vioa の 塩基目 P. tunicata vioa の 塩基目 520P1vioA の 塩基目 520P1vioA の配列より後の 塩基目上記のプライマーに HindⅢ 付加 520P1vioA の 塩基目 6

7 2-4. PCR 反応とゲル電気泳動 下記の Table 2 に従い 試薬を 0.2ml PCR チューブに入れ Table 3 に示す方法で PCR 反応を行った KOD-Plus DNA ポリメラ-ゼは東洋紡から購入した Table 2 KOD PCR 反応液 超純水 39.25μl 10 PCR Buffer 5μl Template DNA <1μg 2mM dntp mix 4μl 25mM MgSO4 2μl Forward Primer (100μM) 0.5μl (final 0.2~1.0μM) Reverse Primer (100μM) 0.5μl (final 0.2~1.0μM) KOD-Plus 0.25μl (0.1~0.25μl) Table 3 KOD ポリメラーゼによる PCR 反応 計 50μl Step Temperature Time Cycle number min sec 3 ( 1) 30sec sec ( 2) min 使用するプライマーの Tm に応じて変更した ( 目安は Fw, Rv 両プライマーの Tm の平均値より 3 程度低く設定 ) 2 1,500bp 以上の DNA を増幅する場合は 120sec とした 各プライマーの組み合わせでのアニーリング温度は次の通りであった Fw1~Rv1 Fw2~Rv2:47 Ptu-Fw01~Ptu-Rv01 と Ptu-Fw02Ptu-Rv02 の組み合わせ :45 Ptu-Fw04~520P1-Rv03:51 520P1-Fw03~Ptu-Rv04:49 EcoRⅠ-Fw05 ~HindⅢ-Rv04:48.5 7

8 PCR 反応終了後 アガロース電気泳動により目的の長さの塩基配列が得られているか確認した この電気泳動は 0.8% のアガロースゲルプレート TAE 緩衝液を用いた アガロースゲルからの DNA の回収は QIAquick Gel Extraction Kit を用い プロトコールに従って行った コロニー PCR は Table 4 および Table 5 の方法で行った Table 4 コロニー PCR 反応液 超純水 39.25μl 10 Ex Taq Buffer 5μl Template DNA dntp mix 4μl Ptu-Fw01 (100μM) 0.5μl (final 0.2~1.0μM) Ptu-Rv01 (100μM) 0.5μl (final 0.2~1.0μM) TaKaRa Ex Taq 0.25μl (0.1~0.25μl) 計 50μl 滅菌済みの楊枝でコロニーを少々かきとり PCR チューブに入れた Table 5 コロニー PCR 反応 Step Temperature Time Cycle number min sec sec sec min プライマー Ptu-Fw01~Ptu-Rv01 を使用 PCR 反応終了後 アガロース電気泳動により目的の長さの塩基配列が得られているか上記の方法で確認した 8

9 2-5. DNA シーケンス DNA シーケンスはバイオマトリックス研究所 ( 千葉県流山市 ) で行った シーケンスのための一般的なサンプル調製は テンプレートとプライマー (3.2pmol) に超純水を加え 最終容量を 14μl とした テンプレートのサイズが 1000bp 未満の場合は 40ng 1000bp 以上の場合は 80ng のテンプレート DNA を用いた プライマーは PCR に用いたプライマーを使用した 2-6. 組換え発現ベクターの調製 520P1 vioa 全塩基配列を元に制限酵素を付加したプライマー EcoRⅠ-Fw05 HindⅢ-Rv05 HindⅢ-Rv04 を設計した (Table 1) ベクター pet28(a) の制限酵素処理反応は EcoRⅠ1μl HindⅢ1μl 1 M Buffer 2μl pet28(a) 63ng 超純水を加え最終容量 20μl とし 37 1h 行った EcoRⅠ-Fw05 と HindⅢ-Rv04 を用いた PCR で得られた vioa 遺伝子を含む PCR 産物の制限酵素処理 2-4. で示した Table 2 の条件と同様に PCR 反応液を調製し Table.3 の制限酵素部位を付加した vioa 遺伝子を得るため PCR を行った ( アニーリング温度 48.5 ) 0.8% アガロース電気泳動後 目的の PCR 産物のバンドをアガロースゲルから DNA を回収し 制限酵素 EcoR Ⅰ HindⅢの二種類で処理した 反応は EcoRⅠ1μl HindⅢ1μl 1 M Buffer 2μl PCR 産物 167ng 超純水を加え最終容量 20μl とし 37 1h 行った 制限酵素処理したベクター PCR 産物を TaKaRa DNA Ligation Kit Mighty Mix を用い プロトコールに従ってライゲーションを行った 反応は DNA 溶液と Ligation Mix の容量比が 1:1 になるように pet28(a) 1μl PCR 産物 4μl と Ligation Mix 5μl を加え最終容量 10μl とし 16 18h 行った ベクターとインサート DNA のモル比は 1:7 であった 次に 反応後のベクターを用いて E.coli BL21(DE3) コンピテントセルを用い Novagen pet System Manual に従い形質転換を行った 詳しい手順は付録 3 参照 9

10 2-7. 組換え発現ベクターの確認カナマイシン (30μg/ml) を含む 5ml の LB 培地で 2-6. で得られた BL21(DE3) の形質転換体を一晩培養し QIAprep Spin Miniprep Kit を用いキットのプロトコールに従い vioa 遺伝子を含む 520P1vioA/pET28(a) プラスミドを抽出し このプラスミドを鋳型として 520P1-Fw03 または 520P1-Rv03 をプライマーとしてシーケンスを行った 10

11 第三章 結果と考察 P1 株 vioa 遺伝子の塩基配列決定 C. violaceum J. lividum P. tunicata の vioa 塩基配列の相同性を調べたが高い相同性は見られなかった これより 3 種のアミノ酸配列を比較し比較的相同性の高い配列を元に Fw1 Rv1 Fw2 Rv2 を設計した 上記のプライマーを用い Fw1~Rv1 Fw2~Rv2 の組み合わせで 520P1 のゲノム DNA を用い PCR を行ったが 目的の遺伝子産物を得る事が出来なかった これより 同属である P. tunicata vioa 配列のみを用い新たにプライマー設計を試み Ptu-Fw01(vioA の 1-30 塩基目 ) Ptu-Fw02(vioA の 塩基目 ) Ptu-Rv01(vioA の 塩基目 ) Ptu-Rv02(vioA の 塩基目 ) を作成した 520P1 株ゲノム DNA をテンプレートとし プライマー Ptu-Fw01~Ptu-Rv01 Ptu-Fw02~Ptu-Rv02 Ptu-Fw01~Ptu-Rv02 Ptu-Fw02~Ptu-Rv01 の組み合わせで 2-4 で述べた方法に従い PCR を行った 今回確認のため 4 つの組み合わせ同時に PCR を行ったのでアニーリング温度は低めの 45 に設定した その結果 目的付近に (Ptu-Fw01~Ptu-Rv01 約 1200bp Ptu-Fw02~Ptu-Rv02 約 800bp Ptu-Fw01~Ptu-Rv02 約 1000bp Ptu-Fw02~Ptu-Rv01 約 1000bp) バンドを確認する事が出来たので 2-4. の方法にて目的のバンドをゲル抽出し精製した これよりゲル精製した Ptu-Fw01~Ptu-Rv01 のサンプルのシーケンスを行い 520P1 株中程の塩基配列 ( 塩基目 ) を決定した 次に決定した 520P1 株 vioa 塩基配列を元に vioa の前半 後半の塩基配列を決定するために 塩基配列の中から新たに 520P1-Fw03(vioA の 塩基目 ) 520P1-Rv03(vioA の 塩基目 ) を設計した ( 付録 4 参照) さらに P. tunicata vioa 配列の外側の塩基配列を元に Ptu-Fw04(vioA の前の-521~- 491 塩基目 ) Ptu-Rv04(vioA の配列より後の 塩基目 ) を設計した (Fig.2) 新たに設計したプライマーを用い Ptu-Fw04~520P1-Rv03 520P1-Fw03~Ptu-Rv04 の組み合わせで PCR を行った Fig.2 の1 2の目的産物 ( それぞれ 約 1000bp 約 700bp) のバンドが得られた これより目的のバンドをゲル抽出し精製した 11

12 Fig.2 プライマー 520P1-Fw03 520P1-Rv03 Ptu-Fw04 Ptu-Rv04 の設計 Ptu-Fw04 520P1-Fw P1-Rv03 vioa Ptu-Rv04 viob ゲル精製したサンプルのシーケンスを行い 520P1 株 vioa の塩基配列全長を決定した 以下に示すのは今までに決定している塩基配列と今回のシーケンスにより決定した 520P1 株 vioa の塩基配列全長と P. tunicata の vioa 塩基配列全長を比較したものである (Fig.3) Fig.3 vioa 塩基配列全長 520P1 vioa 1:ATGTCGAATCAAGAAAATACTATATCCATTGTAGGGGCTGGAGTTTCAGGGATTATGTGC 60 P.tunicata vioa 1:ATGTCGAATCAAGAAAATATTATATCCATTGTAGGGGCTGGAGTTTCGGGAATTATATGT 60 ******************* *************************** ** ***** ** EcoRⅠ-Fw05 520P1 vioa 61:GCGCTTACGCTCGCTAATTTCCATCTAGGTAGCAAAAAAGTAATTAAAGTTTTTGAACAT 120 P.tunicata vioa 61:GCACTCACGCTCGCTAATTTTCATTTAGGTAGCAAAAAGACAATTCGTGTTTTTGAACAT 120 ** ** ************** *** ************* **** ************ 520P1 vioa 121:AAAAAACGTGTCGGCGGCAGAGCGCATGCAATTAAAGTTCAAGAACAGTTTATTGATCTT 180 P.tunicata vioa 121:AAAAGGCGTGTTGGTGGTAGAGCCCATGCAATAAAAATTCAAGAACAATTTATCGATCTT 180 **** ***** ** ** ***** ******** *** ********** ***** ****** 520P1 vioa 181:GGGGCTGGTCGATTTTCACCACAACTTCATAAAAATATTAATGAATTGATAGCACATTTT 240 P.tunicata vioa 181:GGGGCAGGTCGGTTTTCACCACAACTTCATAAAAATATTAATGAACTAGTTGCACATTTT 240 ***** ***** ********************************* * * ********* 520P1 vioa 241:AATATTGAACATGAAAGTTTTCCTTTTACACAATTAACACGACCACAAGAACTTCATAGT 300 P.tunicata vioa 241:AATATTGAAAATGAAAGCTTTCCTTTTACGCAATTAACCAGACCACAAGAGCTACATAGT 300 ********* ******* *********** ******** ********** ** ****** 520P1 vioa 301:GAATTAAAGGAGATTTTAAACAAATTAAAGCCTTTGTGTGCTGAACACAAAGATGAATCC

13 P.tunicata vioa 301:CAATTAAAAGAAATTTTAAACAAATTAAAGCCCATGTGTGACGAACATAAAGATGACTCA 360 ******* ** ******************** ****** ***** ******** ** 520P1 vioa 361:TTTTTGGATTTTTTAACCTCTTATTTAGGTGAAGAACAAAGTAAAGATATTATCAATGCG 420 P.tunicata vioa 361:TTCATCAACTTTTTAACGGCTTATTTAGGTGAAGATCAAAGTAAAGACATCATTAACGCG 420 ** * * ******** **************** *********** ** ** ** *** 520P1 vioa 421:CTTGGATATGATTCTTTATCCTTGCCATTTATCACCCCCAATATTGCTTACGATATTATT 480 P.tunicata vioa 421:CTTGGATATGATTCTTTAGCCCTGCCCTTTATAACCCCTAATATTGCATACGACATAATA 480 ****************** ** **** ***** ***** ******** ***** ** ** 520P1 vioa 481:GAAAAGCACCCTGAGATCCAAGGGTTCTCTGATAACGCGGGATATACATGGCGAAACCTT 540 P.tunicata vioa 481:GAAAAACATCCAGAGATCCAAGGGTTTTCTGATAATGCAGGCTATACCTGGCGAAACCTT 540 ***** ** ** ************** ******** ** ** ***** ************ 520P1 vioa 541:AAGGCCGGATTTTGCACTTTACCTCAAATCTTATATAAAAAAGCAGTTGAATTAGGTGTT 600 P.tunicata vioa 541:AAAGAAGGGTTTTGTACTCTTCCACAAATATTGTATGACCGCGCAGTCGAATTAGGCGTT 600 ** * ** ***** *** * ** ***** ** *** * ***** ******** *** 520P1 vioa 601:GAGTTTCATTTTGATTATGAGCTTATTACAATTGATACCCATATAAAAAAACCGGCTTTA 660 P.tunicata vioa 601:GAATTCCATTTTGATTATGAACTCATCACTATCGATAACCATGAAAAAACGCCCGCTTTA 660 ** ** ************** ** ** ** ** **** **** ***** ** ****** 520P1 vioa 661:ACTTTAAAAAATAGTGATGATGAGATTATTCGAATAACCCAAGGGGATATGATCGTCACA 720 P.tunicata vioa 661:ACTTTAAAAACCAGTAATGATGATATTGTACGCATCACTCAAGGTGACATGATAGTCACA 720 ********** *** ******* *** * ** ** ** ***** ** ***** ****** 520P1 vioa 721:TTGCCACCAACAGCAATGAGCAGGCTCAATTGTAACTTTCCGCAAGATTGGACCCATTAT 780 P.tunicata vioa 721:TTACCTCCTACAGCCATGAGCAGGCTTAATTGTAATTTCCCACAAGATTGGACCCACTAC 780 ** ** ** ***** *********** ******** ** ** ************** ** 520P1 vioa 781:ACTTATGGTTCTATTCCTCTCTTCAAAGGTTTTCTTTTCTACGATACATCATGGTGGCAA 840 P.tunicata vioa 781:ACATATGGCTCAATTCCACTTTTTAAAGGCTTTCTTTTTTATGAAAAGCCTTGGTGGCAA 840 ** ***** ** ***** ** ** ***** ******** ** ** * * ********* 520P1 vioa 841:GAATTATCATTAACAGATCATGTCATCATCACCAATAACCCAATACGAAAGCTGTACTTT

14 P.tunicata vioa 841:GATTTATCTTTAACAGATCATGTGATTATTACCAATAACCCAATCAGAAAACTCTACTTT 900 ** ***** ************** ** ** ************** **** ** ****** 520P1 vioa 901:AAAGATAATAGATACATCTTTTTTTACACTGATAGTGAATACGCTAATTTCTGGCAAGAA 960 P.tunicata vioa 901:AAAGATAATCGATATATCTTTTTTTACACAGATAGTGATTTCGCTAATTACTGGCAAGAA 960 ********* **** ************** ******** * ******** ********** 520P1 vioa 961:ACCAGTCAACATGGCGAAGAACATTACTTAAAAACAGTAAAAGAATTGATGGCTGAAGCA 1020 P.tunicata vioa 961:ACGAGTCAACATGGCGAAGCCCATTATTTAAAAACAATAAAAGAATTTATGGCTGATGCA 1020 ** **************** ***** ********* ********** ******** *** 520P1 vioa 1021:ATTCAGTGCCACATAGATCAAATTCCAGATCCAATTGAACAGACTCATAAATATTGGATA 1080 P.tunicata vioa 1021:ATTCAATGCGATGTTGATCACATACCCGACCCGATAGAGCATACACATAAATATTGGATA 1080 ***** *** * * ***** ** ** ** ** ** ** ** ** *************** 520P1 vioa 1081:CATGGTGTTGAATTTTCCAAAGAGTGTAGTCCAACCCACCCTCTGAGTTTTGTACACAAA 1140 P.tunicata vioa 1081:CATGGCGTTGAGTTTTCTAAAGAGTGTAGCCCTACTCACCCACTAAGTTTTGTCCATAAG 1140 ***** ***** ***** *********** ** ** ***** ** ******** ** ** 520P1 vioa 1141:AAAAGTAAAATAATTTCCGCTTCTGATGCTTATACACCCCACTGTGGTTGGATGGAAGGA 1200 P.tunicata vioa 1141:AAAAGTAAAATCATCTCTGCTTCAGATGCTTATACACCACACTGTGGCTGGATGGAAGGC 1200 *********** ** ** ***** ************** ******** *********** 520P1 vioa 1201:GGCATTATGGCTGGTAAAAGTGCGGCCTTAAAACTTCTAAAACGGATTGAAGCTGAAGAA 1260 P.tunicata vioa 1201:GGTGTTATGGCAGGAAAGAGTGCAGCGTTAAAGTTACTCAAACGTCTTGAGGCTGAAGAA 1260 ** ******* ** ** ***** ** ***** * ** ***** **** ********* 520P1 vioa 1261:GAAAGCATGACCGATAGTCATGAATAA 1287 P.tunicata vioa 1261:GAAAGCCAAACAGATAATCACAAATAA 1287 ****** ** **** *** ***** HindⅢ-Rv05 Fig.3 に示すように 520P1vioA 配列は P. tunicata vioa 配列とかなりの相同性があった P. tunicata J. lividum C. violaceum と 520P1 の塩基配列 アミノ酸配列の相同性を以下に示す (Table 6) 14

15 Table 6 P. tunicata J. lividum C. violaceum と 520P1 の塩基配列 アミノ酸配列の相同性比較 P. tunicata J. lividum C. violaceum 520P1 vioa 塩基 83% 48% 43% 520P1 vioa アミノ酸 90% 30% 31% 15

16 3-2. 組換えベクターの確認 520P1vioA 塩基配列の全長が決定出来たので pet28(a) ベクターに組み込むため 520P1 vioa を元に制限酵素を付加した新たなプライマーを設計した (Fig.4) 制限酵素 EcoRⅠを付加した EcoRⅠ-Fw05(vioA の 1-30 塩基目 ) 制限酵素 HindⅢを付加した HindⅢ-Rv05(vioA の 塩基目 ) を設計した 上記のプライマーを用い EcoRⅠ-Fw05~HindⅢ-Rv05 の組み合わせで PCR を行ったが目的の遺伝子を得る事が出来なかった しかし EcoRⅠ-Fw05 ~Ptu-Rv04 の組み合わせでは目的の遺伝子の長さ 1400bp 付近にバンドを確認する事が出来たので先に設計したプライマー Ptu-Rv04 に制限酵素 HindⅢを付加したプライマー HindⅢ-Rv04 を設計した (Fig.4) Fig.4 プライマー EcoRⅠ-Fw05 HindⅢ-Rv05 HindⅢ-Rv04 の設計 EcoRⅠ-Fw05 520P1 vioa viob HindⅢ-Rv05 HinⅢ-Rv04Ⅲ EcoRⅠ-Fw05 ~HindⅢ-Rv04 の組み合わせで 520P1 株ゲノム DNA をテンプレートとし 2-4 に述べた方法で PCR を行った結果 目的産物約 1400bp のバンドが得られた これより 目的のバンドをゲル抽出し精製した pet28(a) ベクターとプライマー EcoRⅠ-Fw05~HindⅢ-Rv04 で得られた PCR 産物を別々に制限酵素 EcoRⅠ HindⅢで処理した このベクターとインサート DNA をライゲーションし E.coli BL21(DE3) のコンピテントセルを形質転換を行った結果 150 個程のコロニーを得た このコロニーの中にインサート DNA が入っているコロニーを選択するために プライマー Ptu-Fw01~Ptu-Rv01 の組み合わせで TaKaRa Ex Taq TM を用いコロニー PCRを行った 上記のとおり PCR を行った後 0.8% のアガロース電気泳動により 1200bp 付近にバンドが確認できるコロニーを選択した 約 150 個のコロニーのうち 70 個のコロニーを PCR で確認したが 形質転換効率は良い方ではなく インサート DNA が入っている可能性があるコロニーは 70 個中 3 個であった 16

17 pet28(a) ベクターに 520P1 vioa が組み込まれているか確認するために E.coli BL21(DE3) の形質転換体から抽出したプラスミドを用いシーケンスを行った 今回のシーケンスでは 520P1vioA の前半部と後半部がベクターに完璧に組み込まれているか確認した そのため プライマーは Ptu-Fw03 520P1-Rv03 を用いシーケンスを行った (Fig.5) Fig.5 Ptu-Fw03 520P1-Rv03 によるシーケンス 520P1-Fw03 520P1-Rv03 vioa 前半部のシーケンス 後半部のシーケンスの結果より 520P1vioA 塩基配列を確認する事が出来たが pet28(a) ベクターとのつなぎ目部分のシーケンスが予想と一致せず ベクターに正常に組み込まれているとの確証は得られなかった 17

18 第四章 総括 Pseudoalteromonas sp. 520P1 の産生する青紫色素 violacein の合成遺伝子 vioa 塩基配列を P. tunicata の vioa 配列を元にプライマー設計し その全長を決定する事が出来た しかし 制限酵素処理した pet28(a) ベクターに組み込む事が出来なかったことより 今回調べた形質転換体における発言を確かめることは出来なかった 今後 正常に組み込まれたプラスミドを得るために他の形質転換体を調べる必要がある vioa 塩基配列の全長からタンパク質は 49kDa 程度の大きさと推定出来ることより SDS-PAGE によりタンパク質発現を調べることができる 仮にタンパク質の発現量が少ない場合は 520P1 と大腸菌のコドン使用頻度の違いで発現が弱い可能性があるので 大腸菌で使用頻度の低いコドンを認識する t-rna を持つロゼッタなどの大腸菌株を用いてタンパク質発現を確認する必要がある 18

19 第五章 謝辞 文献 < 謝辞 > 本研究を進めるにあたり御指導 助言を下さった榎本恵一教授 細川覚司さん 森本浩行さんに 心より感謝の気持ちを申し上げます < 参考文献 > (1) 矢田修一, 大場雅行, 榎本恵一 (2003) 室戸海洋深層水 中の細菌種の分析, 海洋深層水研究 4,47-56 (2)S. Yada, Y. Wang, Y. Zou, K. Nagasaki, K. Hosokawa, I. Osaka, R. Arakawa and K. Enomoto(2007) Isolation and characterization of two groups of novel marine bacteria producing violacein Mar. Biotechnol. 10, (3)N. Duran and C. F. Menck (2001) Chromobacterium violaceum: A review of pharmacological and industrial perspectives Crit. Rev. Microbiol. 27, (4)C. J. Balibar and C. T. Walsh(2006) In Vitro Biosynthesis of Violacein from L-Tryptophan by the Enzymes VioA-E from Chromobacterium violaceum Biochemistry,45, (5)R. V. Antonio and T. B. Creczynski-Pasa (2004) Genetic analysis of violacein biosynthesis by Chromobacterium violaceum Genet. Mol. Res. 3, (6) P. R. August, T. H Grossman, C. Minor, M. P. Draper, I. A. MacNeil, J. M. Pemberton, K. M. Call, D. Holt, M. S. Osburne(2000) Sequence analysis and functional characterization of the violacein biosynthetic pathway from Chromobacterium violaceum J. Mol. Microbiol. Biotechnol < 参考 Web> (1)NCBI (2)GenBank 19

20 付録 [1] C. violaceum J. lividum P. tunicata の vioa 配列比較 C.violaceum VioA 1:---ATGAAGCATTCTTCCGATATCTGCATTGTCGGCGCCGGCATCAGCGGCCTGACCTGC 57 J.lividum VioA 1:---ATGAGTACGTATTCTGACATTTGCATCGTTGGCGCCGGCATCGGAGGCTTGATTTGC 57 P.tunicata VioA 1:ATGTCGAATCAAATATCCATTGTAGGGGCTGGAGTTTCGGGAGAAAATATTATTATATGT 60..**......** *.***.** **.**.**..*.. **. *.*. **. Fw1 C.violaceum VioA 58:GCCAGCCATCTGCTCGACTCGCCCGCTTGCCGCGGCCTGTCGCTGCGCATCTTCGACATG 117 J.lividum VioA 58:GCCAACCGCCTGATCGACGCCGCCGCCAACAGGAACCTGCGCATCCGGGTATTCGACCTG 117 P.tunicata VioA 61:GCACTCACGCTCGCTAATTTTCATTTAGGTAGCAAAAAGACAATTCGTGTTTTTGAACAT 120 **.. *. **....* *...*..* **.* **.**... C.violaceum VioA 118:CAGCAGGAGGCGGGCGGCCGCATCCGCTCGAAGATGCTGGATGGCAAGGCGTCGATAGAG 177 J.lividum VioA 118:AATGCCAGCGTAGGCGGCCGCATCCAGTCGCGGAAAATAGATGGAGAGGAAATCGCCGAA 177 P.tunicata VioA 121:AAAAGGCGTGTTGGTGGTAGAGCCCATGCAATAAAAAT---TCAAGAACAATTTATCGAT 177.*.. *. **.**..*...**..*...*...*..*...*......** C.violaceum VioA 178:CTGGGCGCGGGGCGATACTCCCCGCAGCTGCACCCGCAT-TTCCAGAGCGCGATGCAGCA 236 J.lividum VioA 178:CTCGGCGCCGCCCGCTACTCGCCGCAGCTGCATCCGCAT-TTCCAGCAACTCATGCAGGG 236 P.tunicata VioA 178:CTTGGGGCAGGTCGGTTTTCACCACAACTTCATAAAAATATTAATGAACTAGTTGCACAT 237 ** **.** *. ** *..** **.**.**.**...** **...*.....****. Fw2 C.violaceum VioA 237:TTACAGCCAGAAGAGCGAGGTGTATCCGTTCACCCAGCTGA-AATTCAAGAGCCATGTCC 295 J.lividum VioA 237:CAGCGGACTGCCGCATGCGGTCTACCCCTTCACCGAGGTCG-TCTCCCACGATAGCGCGC 295 P.tunicata VioA 238:TTTAATATTGAA-AATGAAAGCTTTCCTTTTACGCAATTAACCAGACCACAAGAGC-TAC *...*...*..** **.**..*. *... *.* * C.violaceum VioA 296:AGCAGAAGCTGAAGCGGGCGATGAACGAGTTGTCGCCCAGGCTGAAAGAGCATGGCAAGG 355 J.lividum VioA 296:TGGAAGAGCTGAAGGCAACGCTGGATGAGCTGAGTCCGATGGTGAAAGAGCATCCGCAAG 355 P.tunicata VioA 296:ATAGTCAATTAAAAGAAATTTTAAACAAATTAAAGCCCATGTGTGACGAACATAAAGATG *..*.**..... *..*..*..*...**.*.*...*.**.*** * * C.violaceum VioA 356:AATCCTTTCTCCAGTTCGTCAGCCGCTACCAGGGCCATGACAGCGCGGTGGGCATGATCC 415 J.lividum VioA 356:ACTCCTTCCTCGAGTTCTTCAGCCATTACCTGGGCGCCACCAAGGCCACCCACATCATCA 415 P.tunicata VioA 356:ACTCATTCATCAACTTTTTAACGGCTTATTTAGGTGAAGATCAAAGTAAAGACATCATTA 415 *.**.**..** *.**..*.*....**...** ***.**.. 20

21 C.violaceum VioA 416:GCTCCATGGGCTACGACGCGCTGTTCCTGCCCGACATCTCGGCCGAGATGGCCTACGACA 475 J.lividum VioA 416:AGGCGACCGGCTATGACGCCTTGATGCTGCCGATGGTGTCGGCGGCCATGGCCTACGACA 475 P.tunicata VioA 416:ACGCGCTTGGATATGATTCTTTAGCCCTGCCCTTTATAACCCCTAATATTGCATACGACA *... **.**.**..*.*...*****...*.*..*.. **.**.******* C.violaceum VioA 476:TCGTCGGCAAGCACCCGGAAATCCAGAGCGTGACCGATAACGACGCCAACCAGTGGTTCG 535 J.lividum VioA 476:TCATCAAGAAGCATCCGGAAACGCAGCACTTTACGGAAAACGCCGCCAACCAGTGGCGCT 535 P.tunicata VioA 476:TAATAGAAAAACATCCAGAGATCCAAGGGTTTTCTGATAATGCAGGCTATACCTGGCGAA 535 *..*... **.**.**.**.*..**....*..* **.**.*..*.*.*...***... C.violaceum VioA 536:CGGCGGAAACGGGCTTTGCGGGCCTGATCCAGGGCATCAAGGCCAAGGTCAAGGCTGCCG 595 J.lividum VioA 536:ATGCCACCGACGGCTACCACGAATTGCTAAGCCAGTTGCAGCACAAGGCCCAGGCCGCCG 595 P.tunicata VioA 536:ACCTTAAAGAAGGGTTTTGTACTCTTCCACAAATATTGTATGACCGCGCAGTCGAATTAG **.*....*....*. *...*...*....*....* C.violaceum VioA 596:GCGCGCGCTTCAGCCTGGGTTACCGGCTGCTGTCGGTGAGGACGGACGGCGACGGCTACC 655 J.lividum VioA 596:GGGTGGAATTCCAGCTTGAACATCGTTTGCTGTCCGTTGAAAAATCCGGCGCAGACCATG 655 P.tunicata VioA 596:GCGTTGAATTCCATTTTGATTATGAACTCATCACTATCGATAA--CCATGAAAAAACGCC 653 *.*...***...*.*...*....*..*..*.*.. *..*... C.violaceum VioA 656:TGCTGCAAC-TGGCCGGCGACGACGGCTGGAAGCTGGAACACCGGAC-CCGCCATCTGAT 713 J.lividum VioA 656:TGCT-CGCC-T--TCAGCCACCATGGCGACACGCAGATGCACCGCAC-ACGCCATCTGGT 710 P.tunicata VioA 654:CGCTTTAACTTTAAAAACCAGTAATGATGATATTGTACGCATCACTCAAGGTGACATGAT 713.***...* *...*.*. *.* **.*...*..*..*..**.* C.violaceum VioA 714:CCTGGCCATTCCTCCGTCGGCGATGGCCGGGCTCAATGTCGACTTCCCCGAGGCGTGGAG 773 J.lividum VioA 711:GATGACCATCCCGCCGTCCGCCATGCCGCGCCTGAACCTGGATTTCCCGAATGCCTGGAG 770 P.tunicata VioA 714:AGTCACATTACCTCCTACAGCCATGAGCAGGCTTAATTGTAATTTCCCACAAGATTGGAC 773 *..*..* **.**..* **.***.. *.** **...*.***** * *. ****. C.violaceum VioA 774:CGGCGCGCGCTACGGCTCGCTGCCGCTGTTCAAGGGTTTCCTCACCTACGGCGAGCCATG 833 J.lividum VioA 771:TCCGTTCCAGTACGACTCGCTGCCCCTGTTCAAGGGATTCCTCACGTTCGACACGGCCTG 830 P.tunicata VioA 774:CCACTACACATATGGCTCAATTCCACTTTTTAAAGGCTTTCTTTTTTATGAAAAGCCTTG **.*.***..*.** **.**.**.** **.**... *..*...*.* ** C.violaceum VioA 834:GTGGCTGGACTACAAGCTGGACGACCAGGTGCTGATCGTCGACAACCCGCTGCGCAAGAT 893 J.lividum VioA 831:GTGGGATGCGCTCGGGCTGACCGACAAGGTGCTGATGGCTGCCAATCCCCTGCGCAAGAT 890 P.tunicata VioA 834:GTGGCAAGATTTATCTTTAACAGATCATGTGATTATTACCAATAACCCAATCAGAAAACT 893 ****.. *......*...**..*.***.*.**...**.**.*..*.**..* C.violaceum VioA 894:CTACTTCAAGGGCGACAAGTACCTGTTCTTCTACACCGACAGCGAGATGGCCAATTACTG 953 J.lividum VioA 891:CTACTTCAAGAGCGACAAGTATGTGCTGTTCTACACCGACAGCAAAAGTGCCACCTACTG 950 P.tunicata VioA 894:CTACTTTAAAGATAATCGATATATCTTTTTTTACACAGATAGTGATTTCGCTAATTACTG 953 ******.**...*...**. *..* **.*****.**.**..*.. **.*..***** 21

22 C.violaceum VioA 954:GCGCGGCTGCGTGGCCGAAGGAGAGGACGGCTACCTGGAGCAGATCCGCACCCATCTGGC 1013 J.lividum VioA 951:GCGGGACAGCCTGGAACTCGGTGAAGACGTGTACCTGGAGCGTGTCCGCAGCCACCTGGA 1010 P.tunicata VioA 954:GCAAGAAACGAGTCAACATGGCGAAGCCCATTATTTAAAAACAATAAAAGAATTTATGGC 1013 **. * ** **.*.*. **..*..*...*......***. C.violaceum VioA 1014:CAGCGCGCTGGGCATCGTTCGCGAGCGCATTCCCCAGCCCCTCGCCCATGTGCACAAGTA 1073 J.lividum VioA 1011:AGAAGTCCTGCCGCTCGATGGCCAGCCGCTGCCGCAGATCAAGGCGCACTTCCACAAGTT 1070 P.tunicata VioA 1014:TGATGCAATTCAATGCGATGTTGATCACATACCCGACCCGATAGAGCATACACATAAATA *..*...**.*...*.*..* **..*... *..**.. **.**.*. C.violaceum VioA 1074:TTGGGCGCATGGCGTGGAGTTCTGCCGCGACAGCGATATCGACCATCCGTCCGCGCTCAG 1133 J.lividum VioA 1071:CTGGCCGCATGGCGTCGAGTTTTGCGTGGAGCCGGAAGCCGAGCACCCGGCCGTCCTGCT 1130 P.tunicata VioA 1074:TTGGATACATGGCGTTGAGTTTTCTAAAGAGTGTAGCCCTACTCACCCACTAAGTTTTGT 1133.***..******** *****.*.. ** **.**.....*. Rv2 C.violaceum VioA 1134:CCACCGCGACAGCGGCATCATCGCCTGTTCGGACGCCTACACCGAGCACTGCGGCTGGAT 1193 J.lividum VioA 1131:GCACCGGGA---CGGCATCATTTCCTGCTCGGATGCCTATACCGCGCATTGCGGCTGGAT 1187 P.tunicata VioA 1134:CCATAAGAAAAGTAAAATCATCTCTGCTTCAGATGCTTATACACCACACTGTGGCTGGAT 1193.**...*...*****..*...**.**.**.**.**...**.**.******** C.violaceum VioA 1194:GGAGGGCGGCCTGCTCAGCGCCCGCGAAGCCAGCCGT-CTGCTGCTGCAGCGCATCGCCG 1252 J.lividum VioA 1188:GGAAGGCAGCCTGATCAGCGCCCAGCAAGCCAGCGGC-CTGTTGCTGCAACGGCTAGATC 1246 P.tunicata VioA 1194:GGAAGGCGGTGTTAT-GGCAGGAAAGAGTGCAGCGTTAAAGTTACTCAAACGTCTTGAGG 1252 ***.***.*..*..*..**....*...****.....*.*.**..*.**.* *.. Rv1 C.violaceum VioA 1253:CGTGA J.lividum VioA 1247:AACGGGAGGACGTCGCCGCCGCGAACGATACATTCATCACTTCCTCGACCGAGCGCGCAT 1306 P.tunicata VioA 1253:CTGAAGAAGAAAGCCAAACAGATAATCACAAATAA C.violaceum VioA 1257:-- J.lividum VioA 1307:GA P.tunicata VioA 1287:-- 22

23 [2] P.tunicata vioa 全塩基配列 1 atgtcgaatc aagaaaatat tatatccatt gtaggggctg gagtttcggg aattatatgt 60 Ptu-Fw01 61 gcactcacgc tcgctaattt tcatttaggt agcaaaaaga caattcgtgt ttttgaacat aaaaggcgtg ttggtggtag agcccatgca ataaaaattc aagaacaatt tatcgatctt ggggcaggtc ggttttcacc acaacttcat aaaaatatta atgaactagt tgcacatttt aatattgaaa atgaaagctt tccttttacg caattaacca gaccacaaga gctacatagt 300 Ptu-Fw caattaaaag aaattttaaa caaattaaag cccatgtgtg acgaacataa agatgactca ttcatcaact ttttaacggc ttatttaggt gaagatcaaa gtaaagacat cattaacgcg cttggatatg attctttagc cctgcccttt ataaccccta atattgcata cgacataata gaaaaacatc cagagatcca agggttttct gataatgcag gctatacctg gcgaaacctt aaagaagggt tttgtactct tccacaaata ttgtatgacc gcgcagtcga attaggcgtt gaattccatt ttgattatga actcatcact atcgataacc atgaaaaaac gcccgcttta actttaaaaa ccagtaatga tgatattgta cgcatcactc aaggtgacat gatagtcaca ttacctccta cagccatgag caggcttaat tgtaatttcc cacaagattg gacccactac acatatggct caattccact ttttaaaggc tttctttttt atgaaaagcc ttggtggcaa gatttatctt taacagatca tgtgattatt accaataacc caatcagaaa actctacttt aaagataatc gatatatctt tttttacaca gatagtgatt tcgctaatta ctggcaagaa acgagtcaac atggcgaagc ccattattta aaaacaataa aagaatttat ggctgatgca

24 1021 attcaatgcg atgttgatca catacccgac ccgatagagc atacacataa atattggata 1080 Ptu-Rv catggcgttg agttttctaa agagtgtagc cctactcacc cactaagttt tgtccataag aaaagtaaaa tcatctctgc ttcagatgct tatacaccac actgtggctg gatggaaggc ggtgttatgg caggaaagag tgcagcgtta aagttactca aacgtcttga ggctgaagaa 1260 Ptu-Rv gaaagccaaa cagataatca caaataa

25 3 形質転換 E.coli BL21(DE3) のコンピテントセル 20μl を氷中で 2~5min 静置し 融解した 上記の懸濁液にライゲーション液を 1μl 加えた チューブを氷中で 5min 静置した チューブを 42 の水槽に浸し 30sec 熱処理した ( 振盪厳禁 ) チューブを氷中に 2min 置いた 室温の SOC 培地 80μl を添加した rpm 1h 振盪培養した LB 培地カナマイシン (30μg/ml) 入りに塗布した 37 終夜培養 4 決定した 520P1 株 vioa 塩基配列 520P1 vioa 1: TATGTGC 7 P.tunicata vioa 1:ATGTCGAATCAAGAAAATATTATATCCATTGTAGGGGCTGGAGTTTCGGGAATTATATGT 60 *** ** 520P1 vioa 8:GCGCTTACGCTCGCTAATTTCCATCTAGGTAGCAAAAAAGTAATTAAAGTTTTTGAACAT 67 P.tunicata vioa 61:GCACTCACGCTCGCTAATTTTCATTTAGGTAGCAAAAAGACAATTCGTGTTTTTGAACAT 120 ** ** ************** *** ************* **** ************ 520P1 vioa 68:AAAAAACGTGTCGGCGGCAGAGCGCATGCAATTAAAGTTCAAGAACAGTTTATTGATCTT 127 P.tunicata vioa 121:AAAAGGCGTGTTGGTGGTAGAGCCCATGCAATAAAAATTCAAGAACAATTTATCGATCTT 180 **** ***** ** ** ***** ******** *** ********** ***** ****** 520P1 vioa 128:GGGGCTGGTCGATTTTCACCACAACTTCATAAAAATATTAATGAATTGATAGCACATTTT 187 P.tunicata vioa 181:GGGGCAGGTCGGTTTTCACCACAACTTCATAAAAATATTAATGAACTAGTTGCACATTTT 240 ***** ***** ********************************* * * ********* 520P1 vioa 188:AATATTGAACATGAAAGTTTTCCTTTTACACAATTAACACGACCACAAGAACTTCATAGT 247 P.tunicata vioa 241:AATATTGAAAATGAAAGCTTTCCTTTTACGCAATTAACCAGACCACAAGAGCTACATAGT 300 ********* ******* *********** ******** ********** ** ****** 520P1 vioa 248:GAATTAAAGGAGATTTTAAACAAATTAAAGCCTTTGTGTGCTGAACACAAAGATGAATCC 307 P.tunicata vioa 301:CAATTAAAAGAAATTTTAAACAAATTAAAGCCCATGTGTGACGAACATAAAGATGACTCA 360 ******* ** ******************** ****** ***** ******** ** 25

26 520P1 vioa 308:TTTTTGGATTTTTTAACCTCTTATTTAGGTGAAGAACAAAGTAAAGATATTATCAATGCG 367 P.tunicata vioa 361:TTCATCAACTTTTTAACGGCTTATTTAGGTGAAGATCAAAGTAAAGACATCATTAACGCG 420 ** * * ******** **************** *********** ** ** ** *** 520P1 vioa 368:CTTGGATATGATTCTTTATCCTTGCCATTTATCACCCCCAATATTGCTTACGATATTATT 427 P.tunicata vioa 421:CTTGGATATGATTCTTTAGCCCTGCCCTTTATAACCCCTAATATTGCATACGACATAATA 480 ****************** ** **** ***** ***** ******** ***** ** ** 520P1-Rv03 520P1 vioa 428:GAAAAGCACCCTGAGATCCAAGGGTTCTCTGATAACGCGGGATATACATGGCGAAACCTT 487 P.tunicata vioa 481:GAAAAACATCCAGAGATCCAAGGGTTTTCTGATAATGCAGGCTATACCTGGCGAAACCTT 540 ***** ** ** ************** ******** ** ** ***** ************ 520P1 vioa 488:AAGGCCGGATTTTGCACTTTACCTCAAATCTTATATAAAAAAGCAGTTGAATTAGGTGTT 547 P.tunicata vioa 541:AAAGAAGGGTTTTGTACTCTTCCACAAATATTGTATGACCGCGCAGTCGAATTAGGCGTT 600 ** * ** ***** *** * ** ***** ** *** * ***** ******** *** 520P1 vioa 548:GAGTTTCATTTTGATTATGAGCTTATTACAATTGATACCCATATAAAAAAACCGGCTTTA 607 P.tunicata vioa 601:GAATTCCATTTTGATTATGAACTCATCACTATCGATAACCATGAAAAAACGCCCGCTTTA 660 ** ** ************** ** ** ** ** **** **** ***** ** ****** 520P1 vioa 608:ACTTTAAAAAATAGTGATGATGAGATTATTCGAATAACCCAAGGGGATATGATCGTCACA 667 P.tunicata vioa 661:ACTTTAAAAACCAGTAATGATGATATTGTACGCATCACTCAAGGTGACATGATAGTCACA 720 ********** *** ******* *** * ** ** ** ***** ** ***** ****** 520P1-Fw03 520P1 vioa 668:TTGCCACCAACAGCAATGAGCAGGCTCAATTGTAACTTTCCGCAAGANTNGGACCCATTA 727 P.tunicata vioa 721:TTACCTCCTACAGCCATGAGCAGGCTTAATTGTAATTTCCCACAAGA-TTGGACCCACTA 779 ** ** ** ***** *********** ******** ** ** ***** * ******* ** 520P1 vioa 728:TACTTATGGTTCTATTCCTCTCTTCAAAGGTTTTCNTTTCTACGATACATCNTGGTGGNN 787 P.tunicata vioa 780:CACATATGGCTCAATTCCACTTTTTAAAGGCTTTCTTTTTTATGAAAAGCCTTGGTGGCA 839 ** ***** ** ***** ** ** ***** **** *** ** ** * * ****** 520P1 vioa 788:AGAATTATCATTTANCAGATCATGTCNTCNTCNCCNATAACCCANTACNAAAGNNGNACT 847 P.tunicata vioa 840:AGATTTATC-TTTAACAGATCATGTGATTATTACCAATAACCCAATCAGAAAACTCTACT 898 *** ***** **** ********** * * ** ******** * *** *** 26

27 520P1 vioa 848:TTNAAANATAATANATACATCNTTTTTTACA P.tunicata vioa 899:TT-AAAGATAATCGATATATCTTTTTTTACACAGATAGTGATTTCGCTAATTACTGGCAA 957 ** *** ***** *** *** ********* 27