耳鼻61(補)2015

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1 耳鼻 61( 補 1 ):S66 S71,215 EBV 関連バイオマーカーによる上咽頭癌の治療効果 予後判定 脇坂 尚宏 平井 信行 近藤 悟 吉崎 智一 ほとんどの上咽頭癌で Epstein-Barr ウイルス (EBV) が発癌や進行に関与している 欧米での標準治療は 化学放射線同時併用療法 + 補助化学療法であるが 補助化学療法まで含めた治療完遂率は 55% と低くメタアナリシスにおいてもその有効性は示されてはいない 一方で EBV-DNA(BamHI-W 断片 ) をバイオマーカーとして再発リスクが高い症例にのみ補助化学療法を施行する臨床試験が海外で進行中である 近年 エクソソームと呼ばれる小胞が細胞中の RNA やタンパク質を内包し 細胞外へ放出され細胞間メッセンジャーとして機能していることが判明した エクソソームは生きた細胞から放出され 内包されている RNA は血液中でも安定に存在することができる そこで 上咽頭癌患者血清のエクソソーム中に EBV に特異的な RNA である EBV-encoded small RNAs (EBERs) が内包されているか検討し さらに 上咽頭癌治療後の効果判定 予後予測に関して既存の画像診断やバイオマーカーと比較し鋭敏な指標となるか話題提供することにした Key words: 上咽頭癌 バイオマーカー Epstein-Barr ウイルス リキッド バイオプシー 治療効果判定 はじめに上咽頭は顔面深部にあり 周囲には内頸動脈や海綿静脈洞 頭蓋底 脳神経など狭い領域に重要臓器がひしめいているため 一般に外科的アプローチは困難である 病理組織学的には角化を伴わない癌や未分化癌が大多数を占めるため 放射線への感受性が高い 初期には症状が乏しく リンパ節転移や脳神経症状を呈してから医療機関を受診するため進行癌の状態で診断されることが多い また 治療後の遠隔転移の頻度は約 25% と高く そのため化学療法の放射線増感作用による局所制御の向上と十分な強度の化学療法による遠隔転移の制御が肝要である 1) 上咽頭癌の欧米での標準治療は Al-Sarraf らの Intergroup Study 99(IGS 99) に準じた治療 である ( 図 1 ) 2) 本プロトコールの補助化学療法を含めた治療完遂率は 55% と低く また 化学放射線療法を補助化学療法の有無で検討した比較試験では補助化学療法は生存率を改善しないことが示された 3) この結果は 全症例に補助化学療法を行うことは臨床的に意義がなく 少なくとも治療後に再発リスクが高い症例にのみ補助化学療法を行うことが経済的 時間的にも治療毒性からみても患者の負担軽減に繋がる可能性があることを示しており 治療後に再発リスクが高い症例を確実に抽出することには大きな意義がある 上咽頭癌は大多数で Epstein-Barr ウイルス (EBV) の潜伏感染が発癌に密接に関与する腫瘍である そのため上咽頭癌では EBV-encoded small RNAs(EBERs) を始め いくつかの EBV 関連因子が発現しており 血清中では EBV 関連 金沢大学医学部耳鼻咽喉科 頭頸部外科別刷請求 : 石川県金沢市宝町 13-1 金沢大学医学部耳鼻咽喉科 頭頸部外科脇坂尚宏

2 脇坂他 = EBV 関連バイオマーカーによる上咽頭癌の治療効果 予後判定 S67 図 1 上咽頭癌の治療 ( 欧米の標準治療 :Intergroup Study 99) 抗体価が高値となる 4) 本稿では 上咽頭癌治療後の腫瘍遺残のスクリーニングについて EBV 関連バイオマーカーの視点から現状を述べ さらに われわれが現在取り組んでいる EBERs 核酸 (DNA + RNA) のコピー数定量について話題提供する 対象と方法 1.EBV 抗体価と予後に関する検討当科で加療した EBERs 陽性上咽頭癌 24 例について治療後の EBV 抗体価 (VCA-IgG VCA-IgA) と腫瘍の再発 遺残の有無について Mann-Whitney U-test で検討した FDG-PET と予後に関する検討 11 例について治療後の腫瘍原発巣の SUV (standard uptake value) の最大値 (SUVmax) 関心領域内の閾値以上の容積 MTV(metabolic tumor volume) MTV と関心領域内の SUV の平均値 (SUVnean) の積 TLG(total lesion glycolysis) を算出し 腫瘍再発の有無と再発部位について検討した 3. 血清 EBV-DNA(BamHI-W EBERs) と EBV- 核酸 (EBERs-DNA + RNA) コピー数の定量血清 5 μl から核酸 (DNA および RNA) を 抽出した EBV-DNA の定量には BamHI-W EBER1 EBER2 にそれぞれ特異的なプライマーを用いて定量的リアルタイム PCR による解析を行った EBV- 核酸の定量には逆転写処理をして RNA を cdna に変換した上で EBER1 EBER2 について解析した 当科で治療した上咽頭癌症例 8 例について 血清 1ml あたりの EBV-DNA (BamHI-W EBERs) と EBV- 核酸 (EBERs) コピー数として定量した 6 例については治療前後のコピー数を示した 結果 1.EBV 抗体価と予後に関する検討 24 例中 11 例で再発 遺残を認めた 再発 遺残の有無で EBV 抗体価に有意差は認めなかった ( 図 2) FDG-PET と予後に関する検討 SUVmax MTV TLG の計測結果を図 3 に示す 完全寛解 (CR) を維持している症例で各指標が高値のものがあり 治療後の 18 FDG-PET は予後の有意な指標とはならないことが判明した 3. 血清 EBV-DNA(BamHI-W EBERs) と EBV- 核酸 (EBERs) コピー数の定量患者の TNM 分類と計測結果 治療結果を表 1 に示す 治療後 CR を継続している症例では い

3 S68 耳鼻と臨床 61 巻補 1 号 図 2 EBV 抗体価と予後 24 例について再発 遺残の有無と治療後の VCA-IgG IgA について検討した 11 例で再発 遺残を認めた 両者に明らかな相関は認めなかった 図 3 治療後の 18 FDG-PET の指標による予後評価 SUV max MTV TLG ともに有意な関連性は認めなかった

4 脇坂他 = EBV 関連バイオマーカーによる上咽頭癌の治療効果 予後判定 S69 症例 1 病期 T1N3M1 表 1 上咽頭癌症例の血清における EBV-DNA 核酸コピー数 治療前後 DNA DNA + RNA BamHI-W EBER1 EBER2 EBER1 EBER2 治療前 治療後 治療結果 遠隔残存 2 T2N2M 治療前 治療中 3 T4N2M 治療後 CR 継続中 4 T1N1M CR 継続中 6 T1N3M 遠隔再発 7 T3NM CR 継続中 8 T3N1M 遠隔再発 図 4 われわれが想定する上咽頭癌治療後のフローチャート ずれも治療後の EBV-DNA EBV- 核酸のコピー数は であった 腫瘍が明らかに残存した 3 例のうち 症例 1 では治療後も EBV-DNA EBV- 核酸は同定されていた ただし 遠隔再発した症例 6 は EBER2-DNA EBER2- 核酸が同定されず 同じく遠隔再発した症例 8 では EBV-DNA EBV- 核酸ともに治療後は同定されなかった 考察上咽頭癌は欧米では IGS 99 に準じて 化学放射線療法後に補助化学療法を行うのが標準的である 2) しかし 長期にわたる入院が必要であり

5 S7 耳鼻と臨床 61 巻補 1 号 また 補助化学療法の治療完遂率が低いことや 補助化学療法を施行するかしないかで生存率に差がなかったとする報告があり 補助化学療法を全症例に施行することが疑問視されている 3) しかし 上咽頭癌では転移再発が他の頭頸部癌と比較して多く IGS 99 に準じた補助化学療法が不要とは言い難い そこで バイオマーカーを用いて上咽頭癌治療後に再発リスクが高い症例を抽出し 症例を選んで補助化学療法を行うことにすれば 患者の治療侵襲軽減の面からも医療経済面からも有意義である 上咽頭癌はほとんどの症例が EBV 関連疾患である よって EBV-DNA やその転写産物 ウイルス関連蛋白は バイオマーカーとして期待されており 実際に EBV の BamHI-W 領域 DNA をバイオマーカーとして化学放射線療法後の補助化学療法の適応を決める臨床研究が進行中である 5) 本稿では 治療後の再発リスクを評価する指標として まず EBV 抗体価 (VCA-IgG VCA-IgA) について検討した 従来の報告では EBV 抗体価は上咽頭癌の補助診断法としては有用であるが 治療後では EBV 抗体価が高値のまま推移する症例があり 腫瘍遺残や再発の指標としては不適切と報告されている 6) 本稿でも EBV 抗体価について 再発 転移の有無と治療後の抗体価について有意な傾向は認めず これまでの報告と同様 補助化学療法の適応を決めるバイオマーカーには適さないと思われた 上咽頭癌と 18 FD G-PET について 治療前の SUVmax MTV TLG などの腫瘍の活動性を示す指標は 腫瘍の再発率 生存率 治療効果と有意に相関することが報告されている 7),8) しかし 治療後のこれらの指標について 腫瘍の再発 遺残との関連についての報告はない 本稿では CR を維持している症例でも原発巣の集積が維持される症例や遠隔再発した症例でも原発巣に集積した症例があり 予後との明らかな相関は認めなかった 化学放射線療法後に上咽頭照射野の炎症や線維化により 18) FDG の集積が長期間継続する症例があるた めと思われた 現在 病勢を反映する最も信頼性が高い指標は EBV-DNA 定量である 6),9),1) 血清( 血漿 ) 中の EBV-DNA コピー数は病期を反映し 治療後の再発 転移を鋭敏に捉えることができる また 治療後の EBV-DNA コピー数は再発 転移を予測するための因子となる 近年 EBV 感染細胞が分泌するエクソソームに EBERs や BARTs などの RNA が内包されていることが判明した 11)-13) BARTs については上咽頭癌患者血清中からも検出されることが明らかになった 14) 上咽頭癌患者血清中の EBV-DNA は 壊死 アポトーシス 溶解感染による細胞死に伴って血液中に放出されるのに対して EBV-RNA は生きた細胞からエクソソームを介して安定して放出されるため より鋭敏に生きた上咽頭癌細胞の活動性を反映すると思われる そこで 本稿では病理組織からは in situ hybridization 法により EBERs-RNA が同定された症例 8 例について EBERs-DNA と EBERs のコピー数を合わせて計測した 現在 EBV-DNA の中でも最も鋭敏といわれる BamHI-W DNA の定量とほぼ平行した結果が得られたため EBERs- 核酸の定量が BamHI-W 定量と比較してより鋭敏に病状を反映しているのか今後 検討を要する われわれが想定している上咽頭癌診療のフローチャートを図 4 に示す 化学放射線療法後に明らかな腫瘍残存所見がない症例について Liquid Biopsy を行い 腫瘍残存リスクが高い症例を選択して補助化学療法を行うのが妥当と思われる 今後は BamHI-W DNA と EBERs- 核酸の定量についてさらに症例を増やして検討し EBERs- 核酸の定量がより鋭敏に腫瘍残存リスクを判定できるか 解析していきたい 文 献 1) Ueno T et al:factors affectingoutcomes of alternatingchemoradiotherapy for nasopharyngeal cancer. Ann Otol Rhinol Laryngol 123:59-516, 214.

6 脇坂他 = EBV 関連バイオマーカーによる上咽頭癌の治療効果 予後判定 S71 2) Al-Sarraf M et al:chemoradiotherapy versus radiotherapy in patients with advanced nasopharyngeal cancer Phase III randomized Intergroup study 99. J Clin Oncol 16: , ) Chen L et al:concurrent chemoradiotherapy plus adjuvant chemotherapy versus concurrent chemoradiotherapy alone in patients with locoregionally advanced nasopharyngeal carcinoma A phase 3 multicentre randomised controlled trial. Lancet Oncol 13: , ) Yoshizaki T et al:current understandingand management of nasopharyngeal carcinoma. Auris Nasus Larynx 39: , ) Chan ATC et al:a multicenter randomized controlled trial of adjuvant chemotherapy in nasopharyngeal carcinoma with residual plasma EBV DNA followingprimary radiotherapy or chemoradiotherapy [abstract]. J Clin Oncol 3 (suppl):5511, ) Yip TT et al:application of circulatingplasma/serum EBV DNA in the clinical management of nasopharyngeal carcinoma. Oral Oncol 5: , ) Lai V and KhongPL:Updates on MR imaging and 18 F-FDG PET/CT imaging in nasopharyngeal carcinoma. Oral Oncol 5: , ) Yen TC et al: 18 F-FDG-PET for evaluation of the response to concurrent chemoradiation therapy with intensity-modulated radiation technique for Stage T4 nasopharyngeal carcinoma. Int J Radiat Oncol Biol Phys 65: , 26. 9) Kondo S et al:diagnostic value of serum EBV-DNA quantification and antibody to viral capsid antigen in nasopharyngeal carcinoma patients. Cancer Sci 95: , 24. 1) Lin JC et al:quantification of plasma Epstein-Barr virus DNA in patients with advanced nasopharyngeal carcinoma. N Engl J Med 35: , ) Ahmed W et al:epstein-barr virus-encoded small RNAs (EBERs) are present in fractions related to exosomes released by EBV-transformed cells. PLoS One 9:e99163, ) Lo AK et al:the pathological roles of BART mirnas in nasopharyngeal carcinoma. J Pathol 227: , ) Ruf IK et al:epstein-barr virus small RNAs potentiate tumorigenicity of Burkitt lymphoma cells independently of an effect on apoptosis. J Virol 74: , 2. 14) WongAM et al:profilingof Epstein-Barr virus-encoded micrornas in nasopharyngeal carcinoma reveals potential biomarkers and oncomirs. Cancer 118:698-71, 212. Analysis of treatment efficacy and prognosis associated with nasopharyngeal carcinoma using EBV-related biomarkers Naohiro WAKISAKA, Nobuyuki HIRAI, Satoru KONDO and Tomokazu YOSHIZAKI Division of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Kanazawa University, Kanazawa , Japan Epstein-Barr virus (EBV) is involved in carcinogenesis and progression in most cases of nasopharyngeal carcinoma (NPC). Standard treatment in Western countries is concurrent chemoradiotherapy (CCRT) followed by adjuvant chemotherapy (AC). However, the treatment completion rate is only 55%, and a meta-analysis failed to show the advantage of addingac followingccrt. Now, clinical trials addingac only to high-risk patients accordingto high copy numbers of EBV-DNA (BamHI-W fragment) as biomarker are in progress internationally. In recent years, vesicles called exosomes that enclose RNA and/or protein in cells were found to function as intercellular messengers, and they are released into extracellular fluids. Exosomes are released from living cells, and RNAs that are encapsulated in them can be present stably even in blood. Therefore, we examined whether EBV-encoded small RNAs (EBERs) are present in the serum of NPC patients. In addition, we compared this new candidate biomarker and existingmarkers such as EBV antibody titers and imagingdiagnosis, with respect to the response to treatment and prognostic assessment.

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