原著中枢神経系感染症における Multiplex PCR 法と PCR ラテラルフロー法を用いた迅速遺伝子検査の臨床的評価櫻井慶造 1) 棟方伸一 1) 二本柳伸 2) 和山行正 3) 中崎信彦 1) 狩野有作 1) 4) 久松知子 1) 1) 北里大学病院臨床検査部 252-0

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もえりさくいし
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1 原著中枢神経系感染症における Multiplex PCR 法と PCR ラテラルフロー法を用いた迅速遺伝子検査の臨床的評価櫻井慶造 ) 棟方伸一 ) 二本柳伸 ) 和山行正 3) 中崎信彦 ) 狩野有作 ) 4) 久松知子 ) ) 北里大学病院臨床検査部神奈川県相模原市南区北里 -5- ) 北里大学病院感染管理室 3) 北里大塚バイオメディカルアッセイ研究所 4) 北里大学医学部臨床検査診断学要旨中枢神経系感染症は大きく髄膜炎と脳炎に大別され初期治療が患者の転帰に大きく影響するため迅速かつ正確な診断が重要である我々は同時スクリーニング検査の Multiplex PCR 法 M-PCR 法と PCR ラテラルフロー PCR-LF 法法を用いて髄液から 8 種類の細菌の S. pneumoniae H. influenzae N. meningitides L. Monocytogenes Group B Streptococcus S. aureus SA Coagulase-negative staphylococci species CoagNS methicillin-resistant Staphylococcus aureus と 7 種類のウイルスの VZV HSV- HSV- EBV CMV HHV-6 Enterovirus について臨床的評価を検討したその結果 M-PCR 法と PCR-LF 法を用いた 3 例の髄液から原因細菌が 4 例.4% ウイルスが 3 例 8.7% 検出されたしかし細菌培養が陰性の SA と CoagNS が 5 例認められ偽陽性が起こる可能性があるために検査結果の解釈には注意を要する M-PCR 法と PCR-LF 法は専用の PCR 装置を必要とせず従来法と比べて検出率が高く短時間で報告が可能なため中枢神経系感染症の迅速診断に有用と考えられたキーワード中枢神経系感染症 CNS infection 髄液 CSF Multiplex PCR 法 PCR ラテラルフロー法迅速遺伝子検査抗体検査の低力価の陽性判定は非特異反応や高はじめに抗体価の影響により困難なことがあるため診断に苦慮する場合が少なくないこれらを解決するため中枢神経系感染症は大きく髄膜炎と脳炎に大別さに感染症遺伝子検査が開発され臨床検査の場で活れ初期治療が患者の転帰に大きく影響するため用されている ) Seeplex meningitis kit は Multiplex 迅速かつ正確な診断が重要である髄膜炎は細菌性 PCR 法で細菌 5 菌種ウイルス 7 種類を同時検出す髄膜炎と無菌性髄膜炎に大別され前者には細菌ることが可能な市販キットであるまた我々が開後者にはウイルス結核真菌寄生虫および非感発した PCR ラテラルフロー法は検査材料検体染性髄膜炎などが含まれるなお脳炎はおもに無から直接 MRSA methicillin-resistant Staphylococcus 菌性でありその多くはウイルスによる髄膜炎にお aureus を検出することができる ) ける迅速診断は重要であり日常検査として細胞算今回我々は中枢神経系感染症における Multiplex 定検査分離培養検査および各種ウイルス抗体検査 PCR 法と PCR ラテラルフロー法を用いた迅速遺伝が行われているしかし分離培養検査は検査時間子検査の臨床的評価を行ったので報告するが長いことに加え検出感度が低くウイルス平成 7 年 0 月 6 日受付平成 8 年月 7 日受理医学検査 Vol.65 No

2 HI Neisseria meningitides NM C 群 / Escherichia I 対象および方法 coli K Neisseria meningitides A 群 C 群 Y/W35 群が検出可能であるなお操作法判定法は添付書の指示に従った対象平成 5 年 4 月日から平成 7 年 3 月 3 日に至るまでの期間に北里大学病院の神経内科を受診し ②各種ウイルス抗体検査各種ウイルス抗体検査のうち Varicella-zoster virus た中枢神経系感染症の疑い患者から採取した髄液 VZV Herpes simplex virus HSV - HSV- 3 検体と血液 64 検体を対象としたなお本研究 Cytomegalovirus CMV Human herpes virus-6 は北里大学医学部病院倫理委員会の承認を得て患 HHV6 のおよび抗体検査はウイルス抗者情報保護法の適応に準じた体 EIA 生研ウイルスデンカ生研試方法薬による検査を北里大塚バイオメディカルアッセイ分離培養検査研究所 KOBAL に委託しその判定法は添付書の滅菌スピッツで提出された髄液 3 検体は 3,000 指示に従った髄液の判定は抗体価 0.5 以上を陽性 rpm 0 分間遠心集菌後上澄みを捨てて全量 ml としたまた Epstein-Barr virus EBV のおよの沈渣とした得られた沈渣から染色標本を作製しび抗体検査は間接蛍光抗体法の VCA バーミー法武藤化学を用いてグラム染色によるテスト MBL による検査を KOBAL に委託顕微鏡検査を行ったさらに残りの沈渣を HK 半しその判定法は添付書の指示に従った髄液の判流動培地に摂取し 35 5 日間増菌培養を行った定は抗体価以上を陽性とした HK 半流動培地に菌の発育を認めた場合は 5%ヒツジ 3 遺伝子検査血液加寒天培地チョコレート寒天培地および BTB DNA は髄液 00 μl から QIAamp MiniKit QIAGEN 乳糖加寒天培地 BBL を用いてサブカルチャーをを用いて抽出した RNA は髄液 00 μl から QuickGene 行った RNA tissue Kit S KURABO を用いて抽出したなまた血液培養検査で提出された血液培養ボトル好気用嫌気用各本の血液 64 検体は Bact ALERT 3D Sysmex を使用して 35 5 日間培養しお各操作法は添付書の指示に従った ①Multiplex PCR 法 M-PCR 法 Seeplex Meningitis ACE Detection V.0 Seegene たそのうち培養陽性となった血液培養ボトルかは Dual Priming Oligonucleotides 技術を活用したら 3 ml 程度培養液を採取しグラム染色による顕高感度で特異性が高い M-PCR 法である 4) DNA を微鏡検査を行ったさらに 5%ヒツジ血液加寒天培材料とする細菌 5 菌種は SP HI NM GBS および地チョコレート寒天培地 BTB 乳糖加寒天培地お LM ウイルス 6 種類は VZV HSV- HSV- よび BHK 寒天培地極東を用いてサブカルチャー HHV-6 EBV CMV を添付書の指示に従い測定を行った培地上に発育した集落は CLSI Clinical した Enterovirus EV は抽出した RNA を and Laboratory Standards Institute に準拠 PrimeScriptTM Revers transcriptase TAKARA を使用 3) した MicroScan WalkAway-96SI SIEMENS を使用しし添付説明書に従い cdna を作製した cdna を各菌種用専用パネルを用いて菌種同定薬剤感受性 M-PCR 法で増幅後 %アガロースゲル電気泳動を行い操作法判定法は添付書の指示に従ったエチジウムブロマイドにて染色を行い各特異バン抗原抗体検査ドを目視判定した ①脳脊髄膜炎起炎菌膜多糖抗原キット ②PCR ラテラルフロー法 PCR-LF 法による MRSA 迅速検査法における髄膜炎起炎菌の検出はの検出 PASTOREX メニンジャイティスメニンゴ検査 PCR-LF 法は Staphyloccus aureus SA が保有す BIO RAD を用いた本法は Streptcoccus pneumoniae る fema 遺伝子と MRSA の meca を同時に増幅し SP Listeria monocytogenes LM Group B probe スティックに金コロイド液で染色を行いそ Streptcoccus GBS Haemophilus influenzae b 型の各バンドを陽性対照と比較して目視判定した ) 60 櫻井他中枢神経系感染症における MultiplexPCR 法と PCR ラテラルフロー法を用いた迅速遺伝子検査の臨床的評価

3 8.% であったが顕微鏡検査とメニンゴ検査は II 結果すべて陰性であった遺伝子検査 M-PCR 法と PCR-LF 法の検出率遺伝子検査を用いた微生物の検出率は細菌が患者背景および細胞数算定検査髄液 3 検体に由来した患者の背景および細胞数.4% 4/3 ウイルスが 8.7% 3/3 であっ算定検査を Table に示す髄液 3 検体の内訳はた Figure 一方分離培養法は全体で男性 63 検体女性 60 検体であり検査依頼時の 8.% 9/3 であったが遺伝子検査法の対象菌で年齢は中央値 53. 歳 5 88 歳細胞数の中央は 4.% 5/3 と遺伝子検査法の検出率が.8 倍高値が 88.3 cell/μl <,300 cell/μl 単核球の中央かった遺伝子検査法で検出された細菌は SA が値が 87.% 0 00% 多核球の中央値が 5 検体 35.7 % Coagrase-negative Staphylococci.5% 0 00% であった蛋白の中央値が 83.7 mg/dl mg/dl 糖の中央値が 65.7 mg/dl MRSA mg/dl であったなお分離培養検査の陽性は遺伝子検査の対象 5 検体の他に対象外の n 4 SP 7 4 菌 Propionibacterium acnes: n =, Enterococcus faesium: n =, Bacillus subtilis: n = を含む 9 例 SA GBS 4 Table Patient characterstics (n = 3) Cases [mean (min max)] All Male Female Age CSF cells (cell/μl) Mononuclear cell (%) Polynuclear cell (%) CSF protein (mg/dl) CSF glucose (mg/dl) (5 88) 88.3 (<,300) 87. (0 00).5 (0 00) 83.7 (4 670) 65.7 (9 64) CSF: Cerebrospinal fluid Bact n 4 Virus 9 n 3 n 3 70 n 86 LM 4 CoagNS Figure Detection of causative bacterial in clinical CSF samples Detection of causative bacterial in clinical cerebrospinal fluid (CSF). SA: Staphylococcus aureus (n = 5), MRSA: methicillin-resistant Staphylococcus aureus (n = ). CoagNS: Coagrase-negative Staphylococci (n = 3). LM: Listeria monocytogenes (n = ). GBS: Group B Streptococcus (n = ). SP: Streptococcus pneumonia (n = ). HHV6 3 EV 9 VZV 30 HSV 3 HSV 3 Figure Detection of causative microorganism by multiplex PCR method and PCR lateral flow method in clinical CSF samples Bact: Bacterial central nervous system infection. Virus: Viral central nervous system infection. : Negtive. 医学検査 Vol.65 No. 06 n 3 EBV Figure 3 Detection of causative virus in clinical CSF samples Detection of causative virus in clinical cerebrospinal fluid (CSF). VZV: Varicella-zoster virus (n = 7). EBV: Epstein-Barr virus (n = 5). HSV: Human simplex virus (n = 3). HSV: Human simplex virus (n = 3). HHV6: Human herpes virus 6 (n = 3). EV: Entero-virus (n = ). 6

4 Table Comparison between the detection of Bacteriological test and M-PCR, PCR-LF methods (n = 3) Bacteriological Test LM GBS SA MRSA CoagNS other 09 (4*) LM GBS M-PCR/ PCR-LF SP SP SA 3 ** MRSA CoagNS ** ** SP: Streptcoccus pneumonia, LM: Listeria monocytogenes, GBS: Group B Streptococcus, SA: Straphylococcus aureus, CoagNS: Coagrase-negative Staphylococci, MRSA: methicillin-resistant Staphylococcus aureus. *The frequency of non-target bacteria using M-PCR method and PCR-LF method: Propionibacterium acnes (n = ), Enterococcus faesium (n = ), Bacillus subtilis (n = ). **Detect in cerebrospinal fluid with M-PCR method positive or PCR-LF method positive, Bacteral culture test negative and Blood clture test positive: SA (/5), MRSA (/), CoagN (/3). Table 3 Comparison between the detection of Virus Antibody (EIA FA) test and Multiplex PCR method (n = 3) Anitbody (EIA FA) test with CSF M-PCR VZV EBV HSV HSV HHV6 00 VZV 4* EBV * HSV * HSV 3 HHV6 3** EV *** VZV: Varicella-zoster virus, EBV: Epstein-Barr virus, HSV: Herpes simplex virus, HSV: Herpes-simplex virus, HHV6: Human herpes virus 6, EV: Enterovirus. *VZV, EBV and HSV; M-PCR : anti-,. **HHV6; M-PCR : anti-, not tested. ***EV; M-PCR : antiev antibody not tested. CoagNS が 3 検体.4 % LM GBS が各検液 64 検体を加えると LM が株中株 GBS が体 4.% MRSA が検体 7.% SP が検体株中株 SP が株中株 SA が 5 株中株 7.% であった Figure また抗体検査法は MRSA が株中株 CoagNS が 3 株中株で陽性 8.% 0/3 M-PCR 法は 8.7% 3/3 からウであった Table 髄液のウイルス抗体は VZV がイルスを検出し検出率は M-PCR 法が.3 倍高かっ 7 例中 3 例 EBV が 5 例中 3 例 HSV- が 3 例中た M-PCR 法で検出されたウイルスは VZV が 7 例 HSV- が 3 例中 3 例で陽性であったこれら髄検体 30.4% EBV が 5 検体.7% HSV- 液の抗体検査が陰性の 7 例あるいは医師からの検 HSV- および HHV-6 が各 3 検体各 3.0% EV が査オーダがない HHV-6 の 3 例 EV の例から M- 検体 8.7% であった Figure 3 PCR 法でウイルスが検出された Table 3 3 遺伝子検査と分離培養検査および抗原抗体検査との比較 III 考察遺伝子検査法で対象遺伝子が検出された検体のうち LM が株中株 GBS が株中株 SP が中枢神経系感染症は迅速な感染診断と治療が患者株株で分離培養検査が陽性であったさらに血の転帰に大きく影響する疾患であり特に急性化膿 6 櫻井他中枢神経系感染症における MultiplexPCR 法と PCR ラテラルフロー法を用いた迅速遺伝子検査の臨床的評価

5 性髄膜炎や HSV 脳炎は迅速的な病態の鑑別, 病原体の同定を行い適切な治療が重要である中枢神経系感染症が疑われる患者の日常検査では, 髄液検査と血液培養検査が行われる髄液は可能な限り抗菌薬投与前に採取することが重要で, 髄液からの起炎菌の検出が髄膜炎の確定診断となる髄液の白血球が増加しているにもかかわらず, 原因菌が検出されない場合は, 無菌性髄膜炎, 特にウイルス性髄膜炎が疑われる感染診断の Gold standard は髄液検査で特に, 細胞数増多, 細菌顕微鏡検査, ウイルス抗体検査での抗体の有無が重要である一方, 臨床現場において, 髄液の細菌顕微鏡検査の感度は低く, 細菌培養, 薬剤感受性試験に加えてウイルスの特異抗体, ペア血清の抗体価変動による感染ウイルスの特定は迅速性に問題があるまた,HSV 脳炎や細菌性髄膜炎の診療ガイドラインが諸学会から報告されているが 5 )~ 7 ), 診療の現場においては感染診断に苦慮する場合が少なくない 8 ) また,HSVE(herpes simplex virus encephalitis) の診断では, 高感度 PCR 法でも急性期に陰性を呈する場合もあり, 臨床的に HSVE を疑う場合にはアシクロビル治療は継続し, 5 本邦 ) 6 ), 7 および欧州 ) では繰り返し検査することがガイドラインでも推奨されている近年, 遺伝子診断技術の向上により, ウイルス感染症は迅速に診断されるようになってきた ) 我々は, 病因微生物の細菌とウイルスについて臨床材料から分離培養することなく直接, 微生物に特異的な遺伝子を検出する M-PCR 法と PCR-LF 法を用いて, 従来法との比較検討を行った中枢神経系感染症が疑われた髄液 3 検体から細菌が 4 例 (.4%), ウイルスが 3 例 (8.7%) 検出された国立感染症研究所感染症情報センターの感染症発生動向調査 (ISDW) では,006 年から 0 年の細菌性髄膜炎の起炎菌は, HI, SP に次いで,Streptcoccus agalactiae,sa,lm,coagns が上位を占めている一方, 今回は HI や SP はほとんど認めず,LM,GBS や SA が検出されたこの原因として ISDW サーベーランスは, 対象患者の 80% が 0~9 歳であるが, 今回の調査では, 平均が 53 歳 (5~83 歳 ) であり, 対象年齢の差異が影響していると考えられたまた, 無菌性髄膜炎に関しては, 対象患者の約 70% が 0~ 歳の ISDW サーベーランスでは, 原因ウイルスとして EV と Mumpus virus(mv) が報告されているさらに,Hosoya ら 9 ) は福島県内の小児無菌性髄膜炎 45 例の髄液を解析した結果,PCR 法では EV が 5 例,MV が 4 例,VZV が例,CMV が例検出され,EV と MV が多くを占めていたことを報告している我々の調査では EV や MV がほとんど認めず, ヘルペス属の VZV,EBV,HSV,HSV,HHV6 が検出され, 対象年齢の違いが影響していると考えられたまた,Gregoire ら 0 ) は VZV の中枢神経系感染症との関係について,PCR 法を用いることにより陽性が 44% であったが, 主に発疹後の最初の 7 日間以内に採取された検体では 6.5% で陽性であったと報告されたこれらより, 中枢神経感染症を感染診断する際には, 急速な高齢化社会における中高年層の宿主側の変化に繋がっていると考えられた今回の検討では, 中枢神経系感染症が疑われる症例で顕微鏡検査およびメニンゴ検査が陰性で, 細胞数が正常な髄液から遺伝子検査法により 5 例のウイルスが検出された Hase ら ) は, 髄液細胞数増多がないというだけで髄膜炎を否定できるわけではなく, 敗血症や髄膜炎の兆候がある時は抗菌薬の開始が重要であると報告している ) 今回用いた遺伝子検査法は, 約 4 時間で報告が可能であり, 医師が感染性髄膜炎や脳炎を想起するが感染診断の判定が待てない時期の早期診断に役立つ可能性が示唆された培養法が陰性を示し,PCR-LF 法で SA,MRSA,CoagNS が検出された髄液では, 中枢神経感染症との関係が低いこと,PCR 法では死菌の遺伝子も検出してしまうことから, 採取時の検体コンタミネーションなどにより偽陽性結果が示唆された Richter ら 3 ) は, Corynebacteria, Propionibacterium sp., CoagNS, Streptcoccus viridians,bacillus sp. などの皮膚汚染菌が条件により重篤な感染症を引き起こし得ることもあるが, 血液培養セットのみで検出された場合は, 患者の皮膚, 検体採取時に使用した器具類, 採取者の手指, 環境から検出された臨床的に有意でないコンタミネーションと判断することが報告されているこのように高感度な遺伝子検査を用いて細菌性髄膜炎を判定する際は, 髄液採取時の皮膚汚染菌などのコンタミネーションによる偽陽性結果に注意して判定することが必要である医学検査 Vol.65 No

6 IV 結語 M-PCR 法と PCR-LF 法は専用の PCR 装置を必要とせず分離培養検査やウイルス抗体検査と比べて検出率が高く短時間で報告が可能なため中枢神経系感染症の迅速診断に有用と考えられたしかし偽陽性が起こる可能性があるために検査結果の解釈には注意を要する文献 ) 大楠清文他感染症診断における遺伝子解析技術の適応日本臨床微生物学会 008; 8: ) Nihonyanagi S et al.: Clinical usefulness of multiplex-pcr lateral flow in MRSA detection: A novel, rapid genetic testing method, Inflammation, 0; 35: ) Clinical and Laboratory Standards Institute: Performance Standards for Antimicrobial-Susceptibility Testing; Fifteenth Informational Supplement (M00-S0), CLSI, Wayne PA, 00. 4) Shin SY et al.: Evaluation of the Seeplex Meningitis ACE Detection kit for the detection of common bacterial and viral pathogens of acutebmeningitis, Ann Lab Med, 0; 3: ) 日本神経感染症会ヘルペス脳炎のガイドライン Neuroinfection, 005; 0: ) Cinque P et al.: The role of laboratory investigation in the diagnosis and manarement of patients with suspected herpes simplex encephalitis: A consensus report, The EU Concerted Action on Virus Meningitis and Encephalitis, J Neurol Neurosurg Psychiatry, 996; 6: ) Linde A et al.: Specific diagnostic methods for herpesvirus infections of the central nervous system, a consensus review by the European Union concerted Action on Virus Meningitis and Encephalitis, Clin Diabn Virol, 997; 8: ) Diederik van de B et al.: Clinical features and prognostic factors in adults with bacterial meningitis, N Engl J Med, 004; 35: ) Hosoya M et al.: Application of PCR for various neurotropic viruses on the giagnosis of viral meningitis, J Clin Virol, 998; : ) Gregoire SM et al.: Polymerase chain reaction analysis and oligoclonal antibody in the cerebrospinal fluid from 34 patients with varicella-zonster virus infection of the nervous system, J Neurol Neurosurg Psychiatry, 006; 77: ) Hase R et al.: Bacterial meningitis in the absence of cerebrospinal fluid pleocytosis: A case report and review of the literature, Can J infect Dis Med Microbiol, 04; 5: ) 中野有也他初回髄液検査で髄液細胞増多を伴わなかった細菌性髄膜炎例の検討小児感染免疫 00; : ) Richter S et al.: Minimizing the workup of blood culture contaminants: Implementation and evalution of a laboratory-based algorithem, J Clin Microbiology, 00; 40: 本論文に関連し開示すべき COI 状態にある企業等はありません櫻井他中枢神経系感染症における MultiplexPCR 法と PCR ラテラルフロー法を用いた迅速遺伝子検査の臨床的評価

7 Original Article Clinical evaluation of the Multiplex PCR method and PCR lateral flow method in central nervous system infection by rapid genetic detection test Keizou SAKURAI ) Shin NIHONYANAGI ) Nobuhiko NAKAZAKI ) Tomoko HISAMATSU ) Shinichi MUNEKATA ) Ikumasa KAZUYAMA 3) ) 4) Yusaku KANOU ) Department of Clinical Laboratory, Kitasato University Hospital (-5-, Kitasato, Minami-ku, Sagamihara-shi, Kanagawa , Japan) ) Department of Infection Control, Kitasato University Hospital 3) Kitasato-Otsuka Biomedical Assay Laboratories Co, Ltd. 4) Department of Laboratory Medicine, Kitasato University School of Medicine Summary Infections of the central nervous system are roughly divided into meningitis and encephalitis. The initial treatment for such diseases considerably affects the patient s outcome; hence, rapid and correct diagnosis is crucial. We simultaneously used multiplex polymerase chain reaction (M-PCR) and PCR-Lateral Flow (PCR-LF) analyses for the screening examination and clinically evaluated eight bacterial species, namely, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides, Listeria monocytogenes, Group B Streptococci, Staphylococcus aureus (SA), coagulase-negative staphylococci species (CoagNS), and methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and seven viruses, namely, varicella-zoster viruses, herpes simplex virus (HSV)-, HSV-, Epstein-Barr virus, cytomegalovirus, human herpes virus-6, and enterovirus collected from patients cerebrospinal fluids. In total, 4 (.4%) and 3 (8.7%) samples of causative bacteria and viruses, respectively, were detected in 3 samples of cerebrospinal fluid. However, there is a possibility of false-positive results as five SA and CoagNS were detected although the samples were culture-negative for these species. Hence, the results need to be carefully interpreted. M- PCR and PCR-LF analyses did not require dedicated PCR devices, had detection rates that were higher than those of other analytical methods, and yielded results within a short span of time. Therefore, M-PCR and PCR-LF analyses may be effective for the quick diagnosis of central nervous system infections. Key words: CNS infection, CSF, Multiplex PCR, PCR lateral flow, rapid genetic detection test (Received: October 6, 05; Accepted: January 7, 06) 医学検査 Vol.65 No

CHEMOTHERAPY JUNE 1993 Table 1. Background of patients in pharmacokinetic study

CHEMOTHERAPY JUNE 1993 Table 1. Background of patients in pharmacokinetic study VOL. 41 S 1 Table 2. Levels (ƒêg/ml or ƒêg/g) of S-1006 in serum, bile, and tissue (gallbladder) after oral administration