原著人工関節感染症における術中検体を用いた細菌遺伝子検査の有用性について櫻井慶造 1) 内山勝文 2) 安本龍馬 1) 狩野有作 1) 3) 中﨑信彦 1) 棟方伸一 1) 1) 北里大学病院臨床検査部神奈川県相模原市南区北里 ) 北里大学医学

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りえかせ
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1 原著人工関節感染症における術中検体を用いた細菌遺伝子検査の有用性について櫻井慶造 1) 内山勝文 ) 安本龍馬 1) 狩野有作 1) 3) 中﨑信彦 1) 棟方伸一 1) 1) 北里大学病院臨床検査部神奈川県相模原市南区北里 ) 北里大学医学部整形外科学 3) 北里大学医学部臨床検査診断学要旨今回関節液 98 例および人工関節周囲材料 14 検体を用いて PCR ラテラルフロー法 PCR-LF 法によるブドウ球菌系 3 菌種 methicillin-sensitive Staphylococcus aureus; MSSA, methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA, methicillin resistant-coagulase negative staphlyococci; MR-CNS それ以外の細菌は 16S リボゾーム RNA 16S-rRNA 法の解析を実施し人工関節感染症における術中検体を用いた細菌遺伝子検査の有用性を検討したその結果 PCR-LF 法を用いた関節液より細菌遺伝子 4 検体 MSSA: 5.1%, MRSA: 9.%, MR-CNS: 1.% が検出された PCR-LF 法が陰性であった 74 検体は 16S-rRNA 法を用いたシーケンスによる菌の推定を行ったしかし 16S-rRNA 法は増幅酵素由来の Escherichia coli や試薬中に存在する他の細菌によるコンタミネーションが発生し検出感度に問題が生じたよって真核細胞をホスト細胞として作製した Eukaryote-made Taq polymerase E-Taq を用いて bacterial DNA contamination free を確認した結果術中材料より直接的に 1 1 CFU/mL 5%検出まで細菌の遺伝子検出が可能となった E-Taq を用いた 16S-rRNA 法では 74 検体中 19 検体から細菌遺伝子を検出しシーケンス解析により菌を推定した遺伝子検査法は培養同定検査に比べて検出率が 1.5 倍高値を示したしかし培養同定検査が陰性を示した 8 検体 MSSA 3 例 MR-CNS 3 例 MRSA 例および同時に採取された組織材料 3 検体 MSSA 例 MR-CNS 1 例の術中組織材料から細菌遺伝子が検出され採取時のコンタミネーションが生じる可能性が示唆された以上より PCR-LF 法および E-Taq を用いた 16S-rRNA 法は良好な感度および特異性を示し人工関節感染症の感染診断として臨床応用が可能であると考えられたキーワード人工関節感染症細菌遺伝子検査 PCR ラテラルフロー法 16S-rRNA シーケンス解析近年人工関節はインプラントの飛躍的な機能向断法とは言えず感染診断に苦慮する場合が少なく上により生活の質の改善に極めて有効な治療法とさないよって臨床検査の場で感染症遺伝子検査がれているが人工関節感染症 prosthetic joint infection; 活用されている 1), ) PJI が最も重篤な合併症となっている米国感染症今回我々は術中検体を用いた迅速細菌遺伝子検学会によるガイドラインでは PJI の診断根拠査法の確立を目的とし polymarase chain reaction ラ definitive evidence として術中の二つ以上の組織検テラルフロー法 PCR-LF 法を原理とする遺伝子体の培養あるいは術前術中の穿刺液の培養にお検出試薬を用いて関節液あるいは術中人工関節組いて同一の微生物が検出された場合とされている織材料からメシチリン感受性黄色ブドウ球菌感染が疑われた場合の Gold standard は培養検査に MSSA メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 MRSA よる起炎菌の同定が重要であるしかし培養同定およびメチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌検査は検査時間が長く検出感度が低いため十分な診 MR-CNS の解析を実施した 3) 本法は約 3 時間で平成 3 年月 5 日受付平成 3 年 6 月 4 日受理 66 櫻井他人工関節感染症における術中検体を用いた細菌遺伝子検査の有用性について

2 MRSA が検出可能であるがこれら 3 菌種以外は ②術中組織材料 16S リボゾーム RNA を用いたシーケンス 16S 解析生体の組織は溶解しにくいが簡易的で迅速性に法により菌を推定した 4), 5) 市販の PCR 増幅試薬優れた超音波での前処理を行った 7) 滅菌サンプルでは 16S 解析法にてサイクル数が増加した場合バックに採取した組織材料は無菌生理食塩液 1 ml Escherichia coli E. coli による酵素由来のゲノムコを添加し超音波洗浄装置で 31 Hz 3 分処理後 QIA ンタミネーション細菌培養検査との乖離などの問法を用いて抽出した題が生じた以上の問題点を考慮し術中検体を用 3 細菌遺伝子検査いた細菌遺伝子検査の有用性について検討した ①PCR ラテラルフロー法 PCR-LF による MSSA MRSA および MR-CNS の検出 I 方法および材料 PCR-LF 法は Staphylococcus aureus が保有する fema 遺伝子と MRSA の meca を同時に増幅する 1 対象平成 7 年 4 月から平成 9 年 3 月までの期間に DNA の増幅の判定は probe スティックに金コロイド液で染色を行いその各バンドを陽性対照と比較北里大学病院整形外科を受診した人工関節感染症のして目視判定した 3) 患者から採取した関節液 98 検体および術中の組織 ②16S 解析法材料 14 検体滑膜 14 検体頚骨 3 検体大腿骨抽出した DNA は 16S-rRNA 遺伝子を増幅する周辺組織 34 検体骨髄内組織 1 検体ステム周辺ユニバーサル primer を用いた PCR 法によって増幅組織検体脛骨周辺組織検体セメントスペした 4 ), 5 ) PCR 溶液 5 μl は TAKARA Ex Taq サー周辺組織 1 検体を対象とした関節液はテル TAKARA を添付説明書に従い調整し抽出 DNA モシリンジ TERUMO で採取後無菌的に採取管 5 μl を添加した Ex-Taq 法 PCR 法は 95 5 分 EDTA-Na テルモに分注した関節組織材料は後 35 サイクル 95 3 秒 6 3 秒 7 1 分滅菌処理した滅菌サンプルバックアズワンに無 7 5 分増幅した DNA の増幅の判定は Nuclease- 菌的生理食塩液 1 ml を添加し保存した Free Water Cosmo BIO: N-Free Water を陰性の対象方法として電気泳動後エチジウムブロマイド ethidium 1 培養同定検査 bromide; EtBr 染色ニッポンジーンを説明書関節液は HK 半流動培地で培養を行い 5%ヒツジに従い染色し増幅酵素由来の E. coli や試薬中の他血液加寒天培地チョコレート寒天培地 BTB 乳糖の細菌によるコンタミネーションが陰性であること加寒天培地および BHK 寒天培地極東を用いてを目視判定した PCR 産物は PCR 産物精製キットサブカルチャーを行った培地上に発育した集落は Nucleospin Gel and PCR Clean-up TAKARA を用い CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute にて精製した細菌の推定は 16S-rRNA の領域約準拠 6)した MicroScan WalkAway-96SI SIEMENS を 1,5 bp の保存性の高い約 5 bp の 519a と 97a 使用し各菌種用専用パネルを用いて菌種同定薬のシーケンス primer を用いて測定したその精製産剤感受性を行い各遺伝子検査法と比較した操作物を鋳型としてシーケンス PCR キット BigDye 法判定法は添付書の指示に従った Terminator v 1.1 Cycle Sequencing Kit Applied DNA 抽出 Biosystems を用いて添付説明書に従い標識反応し ①関節液たシーケンス産物は精製キット BigDye EDTA-Na 管に採取した関節液 μl にリゾスタ Xterminator Purification Kit Applied Biosystems を用フィン処理後室温 1 分 DNA amp MiniKIT いて精製した精製済みのシーケンス PCR 産物は QIAGEN を用いて抽出した QIA 法特に粘シーケンサー 35XL GenticAnalyzer 装置 Applied 性が強い場合は NALC-NaOH 液 BD MycoPrepTM Biosystems を用いて塩基配列を解析した得られ μl を添加し 1 分間激しく混合して抽出試薬た塩基配列は DNA Data Bank of Japan DDBJ のの W1 液の洗浄操作を回繰り返した BLAST 検索によりアライメントを行い 99%以上の医学検査 Vol.67 No

3 相同性がある菌種について検索を行った Table 1 Patient characterstics (total: 98) ③PCR 増幅試薬の比較 Cases mean (min max) PCR 増幅試薬は市販 3 種類の Ex-Taq 法 AmpliTaq Gold ThermoFisher AmpG 法および FastStart SYBR Green Master Roche SYBR 法を用いて MRSA II の 16S-rRNA 遺伝子を増幅しバンドの有無を比較したまた真核細胞をホスト細胞として作製した Eukaryote-made Taq polymerase 製造北海道三井化学株式会社提供三井化学株式 All Male Female Age Synovial fluid (cell/μl) Bacterial microscopy Serum CRP (mg/dl) (16 88) 9,93 ( ,) 6 (GP: 4 GN: 1 MT: 1) 6.5 (.3 3.6) GP: Gram-positive bacteria, GN: Gram-negative bacteria, MT: Mycobacterium tuberculosis 会社は Niimi らの方法 8)に従い解析した E-Taq 法 SYBR 法は Realtime PCR 装置 LightCycler 市販増幅試薬の比較 Nano: Roche を使用し PCR 溶液 μl に抽出 DNA 4 種類の PCR 増幅法を用いた陰性確認の電気泳動 5 μl を添加した MRSA II 型の Macfarland.5 菌液を示す Figure 1 N-Free Water を用いて 35 cycle を無菌生理食塩で 1 倍希釈液を作製し感度試験をから 55 cycle の PCR 増幅を 3 日間測定し E-Taq 法検討した PCR 条件は 95 3 分後 95 1 秒では 55 cycle まではバンドが陰性であることを確認 6 秒 7 5 秒 7 5 分増幅しした市販 3 種類の PCR 増幅試薬に関しては cycle で増幅した cycle から陰性対照の N-Free Water にバンドが認めら 4 各検査法から得られた結果の比較れ陰性が確認できた 35 cycle までは大腸菌ホスト PCR-LF 法および 16S 菌検索法から得られた結果を個々に比較検討したのゲノムのバンドは認めなかった市販の Ex-Taq PCR 試薬を 35 cycle 増幅した場合 1 14 CFU/mL 5%検出と E-Taq 試薬の感度に約 1 倍の差を認 II 結果めた Table 3 遺伝子検査の検出頻度関節液 98 例における PCR-LF 法を用いた細菌遺 1 患者背景および検査所見関節液および人工関節組織材料に由来した患者の伝子の検出結果を示す Figure MSSA 5 検体背景および検査所見の一部を示す Table 1 98 例 5.1% MRSA 9 検体 9.% MR-CNS 1 検体の内訳は男性 6 検体女性 7 検体で検査依頼時 1.% から細菌遺伝子が検出された PCR-LF 法の年齢は中央値 67.1 歳歳であった細胞が陰性を示した 74 検体について E-Taq を用いた数の中央値は 9,93 cell/μl , cell/μl 16S 解析法で菌の推定を実施したその結果グラ血清 CRP の中央値は 6.5 mg/dl mg/dl ム陽性菌として Streptococcus agalactiae 5 検体であったなお細菌顕微鏡検査ではグラム陽性菌 5.1% Finegoldia magna が検体.% が 4 検体グラム陰性菌が 1 検体抗酸菌陽性が 1 Propionibacterium acnes が 1 検体 1.% Clostridium 検体であった leptum が 1 検体 1.% Enterobacter Species が 1 検 PCR-LF 法と 16S 解析法の感度および市販増幅試体 Prevotella oralis が 1 検体 1.% Micrococuuus 薬の比較 Species が 1 検体 1.% Bacilius thermolactis が 1 1 感度試験検体を認めたまたグラム陰性菌では Escherichia MRSA-II の 1 倍段階希釈の菌液を用いて重測 coli が検体.% Stenotrophomonas maltophilia 定した PCR-LF 法の検出感度は 1 1 CFU/mL が 1 検体 1.% Klebsiella pneumoniae が 1 検体 5 cycle 増幅した E-Taq 法の検出は 1 1 CFU/mL 1.% であった PCR 増幅が低濃度を示した検を 5%検出できる感度であった 5%検出 Table 体に関しては 16S 解析法は判定不能であった 4 遺伝子検査法と培養同定検査との比較同時に組織材料が提出された関節液 91 例につい 66 櫻井他人工関節感染症における術中検体を用いた細菌遺伝子検査の有用性について

Table Limit of detection for PCR-LF and 16S-rRNA (CFU/mL) PCR-LF 16S-rRNA Ex-Taq (35 cycle) E-Taq (5 cycle) 1 18 1 17 1 16 1 15 1 14 1 13 1 1 1 11 PCR-LF: PCR lateral flow method, 16S-rRNA: 16S

4 Table Limit of detection for PCR-LF and 16S-rRNA (CFU/mL) PCR-LF 16S-rRNA Ex-Taq (35 cycle) E-Taq (5 cycle) PCR-LF: PCR lateral flow method, 16S-rRNA: 16S ribosomal RNA method, PCR assay Ex-Taq (TAKARA Ex Taq), E-Taq (Eukaryote-made Taq polymerase) MW PC PC PC MW 1,5 bp 1, bp 5 bp ② Bacterial contamination negative ① Bacterial contamination positive 35 cycle 45 cycle 55 cycle Figure 1 Effect of bacterial contamination using eukaryote-made thermostable DNA polymerase and Escherichia coli-made polymerase Gels showing the PCR assay products (35, 45 and 55 cycles) of bacterial 16S ribosomal RNA genes in the Nuclease-Free Water or MRSA II using the universal primers. Commercial bacterially made thermostable of three companies were tested. MW: 1 bp DNA Ladder ① No. 6 1: TAKARA Ex Taq No : Amplitaq Gold No : SYBR Green ② No : eukaryote-made thermostable DNA polymerase (PCR assay 55 cycles) for bacterial contamination of nuclease free water using bacterial universal primers. て PCR-LF 法と培養同定検査を比較検討した Table 5 左人工骨頭置換術 bipolar hip arthroplasty; 3 全体として PCR-LF 法では 4 例培養同定法で BHA 後緩み患者の臨床経過 16 例が検出され PCR-LF 法による検出率は培養同術中に左大腿骨頸部内側組織の迅速病理検査培定法の 1.5 倍であった菌種による陽性一致率の比養同定検査および細菌遺伝子検査が提出された較では MSSA が 4.% MR-CNS が 7.% MRSA BHA 例の臨床経過を示す Figure 3 迅速病理診断が 77.8%であったまた材料の比較として同時にでは形質細胞リンパ球などの炎症細胞浸潤化依頼された関節液と組織材料 91 例について比較検膿性炎症に矛盾なしとの診断で好中球主体の炎討した Table 3 組織材料との陽性一致率の比較症性浸出液が出現していた 7 日間の培養同定検査では MSSA が 6% MR-CNS が 75% MRSA がは陰性 PCR-LF 法では meca が陽性を示し 16S 解 9%であった析法において S. epidermidis が推定されたその後 Cefazolin の投与により炎症反応は改善を示した術中に使用した Vancomycin と Gentamycin はリン酸医学検査 Vol.67 No

5 infection; SSI は抗菌薬が発達した現在において MSSA, 5 も治療に難渋する場合が多く早期の感染診断が重 MR-CNS, 1 要である日本整形外科学会では骨関節術後感 MRSA, 9 PCRLF 染予防ガイドラインを 6 年 5 月に作成し以後も定期的に改定を行っている 9) 本来骨関節は無菌的であるが人工関節などの異物の存在下では少 S. agalactiae, 5 -, 55 量の菌により感染症を生じ関節インプラントプ E. coli, レートなどの人工関節を抜去せざるを得ない合併症 F. magna, P. acnes, 1 Clostridum leptum, 1 P. oralis, 1 16SrRNA Signal weak, が生じるよって PJI の迅速的な感染診断および治療が重要であり 1) 術中に採取した組織や関節液に対する感染診断により一期的置換か二期的置換 S. maltophilia, 1 Micrococcus sp., 1 かの選択が行われるなお起炎菌同定の Gold K. pneumoniae, 1 B. thermolactis, 1 Enterbacter sp., 1 standard は細菌検査であるが迅速的な判定には細 Figure Detection of causative bacterial in prosthetic joint infection samples (n = 98: Syovail fliud) MSSA: methicillin-sensitive Staphylococcus aureus (n = 5), MRSA: methicillin-resistant Staphylococcus aureus (n = 9), MR-CNS: methicillin resisitant coagrase-negative Staphylococci (n = 1), S. agalactiae: Staphylococcus agalactiae (n = 5), P. acnes: Propionibacterium acnes (n = 1), Clostridium leptum: (n = 1), F. magna: Finegoldia magna (n = ), B. thermolactis: Bacilius thermolactis (n = 1), P. oralis: Prevotella oralis (n = 1). E. coli: Escherichia coli (n = ), S. maltphilia: Stenotrophomonas maltophilia (n = 1), Micrococcus sp.: species (n = 1), Enterbacter sp.: species (n = 1), K. pneumoniae: Klebsiella pneumoniae (n = 1), signal weak: indeterminate (n = ), : negative (n = 55). Table 3 Comparisons of bacteriological test (synovial fluid) and PCR-LF (synovial fluid periprosthetic samples) for the detection of MSSA MR-CNS MRSA PCR-LF assay (synovial fluid) Total: 91 MSSA MR-CNS MRSA Bacteriological Test (synovial fluid) PCR-LF asssay (periprosthetic samples) PCR-LF: PCR lateral flow method, MSSA: methicillin-sensitive Staphylococcus aureus, MR-CNS: methicillin resistant coagulasenegative Staphlococci, MRSA: methicillin-resistant Staphylococcus aureus. カリシウムペーストに入れて局所に使用した菌顕微鏡検査が必要であるしかし関節液や周囲組織における細菌顕微鏡検査の感度は低く報告時間と検出感度に限界がある近年遺伝子検査技術の向上により細菌感染症の迅速診断が可能となり関節置換術時 PJI の感染診断に活用されている 11) 13) 今回我々は PJI において直接的に細菌の特異的遺伝子が検出可能な PCR-LF 法および 16S 解析法を用いて術中の細菌遺伝子検査の有用性について検討を行った検出感度に関しては MRSA II の菌液を用いた PCR-LF 法は 1 1 CFU/mL を示した 16S 解析法では市販の PCR 増幅酵素を用いた場合 PCR-LF 法に比べ約 1/1 感度が低下したなお通常に市販されている E. coli 由来の PCR 酵素 Ex-Taq 法 AmpliTaq 法 SYBR 法を用いて 35 cycle 以上で PCR 反応を行った場合大腸菌ホストのゲノムにおけるコンタミネーションがしばしば問題視されている 8) そこで Niimi ら 8)が開発した E-Taq を用いて測定感度試験およびコンタミネーション試験を実施した E-Taq は bacterial DNA contamination free を初めて実現した PCR 酵素であり臨床材料から直接的に高感度なバクテリア DNA の検出が可能となったが通常 16S 解析法はオーバーナイトで解析を行うため報告は翌日となった今回 E-Taq の使用により 5 cycle 増幅した場合でも対照の N-Free Water III 考察は陰性を呈することを確認した細菌の検出感度については PCR-LF 法とほぼ同等の 1 1 CFU/mL 人工関節における手術部位感染 surgical site 664 5%検出を示し 3 種類の市販試薬と比較して櫻井他人工関節感染症における術中検体を用いた細菌遺伝子検査の有用性について

6 Date 15/11/ 16/1/8 Operation BHA 1 years ago Labo. data 3.8 RBC 16/μL 3.8 WBC 13/μL 4.4 PLT 16/μL CRP mg/dl.79 Culture Syovail ﬂuid Preiprosthetic sample Genetic Test PCR-LF Syovail ﬂuid Preiprosthetic sample 16S-rRNA positive 16//3 16//4 16//11 16//5 16/3/ THA culture negative 1W FemA - /meca + 16S-ribosomal RNA was ampliﬁed by 5 cycled using Eukaryote-made thermostable DNA Syovail ﬂuid Preiprosthetic sample Rapid pathological diagnosis Therapy Cefazolin Vancomycin Gentamycin S. epidermidis Neutrophil/purulent inﬂammation mg/day 5 g/1 ml g/v Figure 3 Clinical course (culture no growth, 16S-rRNA positive) BHA: bipolar hip arthroplasty THA: total hip arthroplasty 約 1 倍向上したの 1 例中 1 例は組織材料での細菌遺伝子が陰性で今回の PCR-LF 法及び 16S 解析法による結果であったまた関節液が陰性で組織材料が陽性であっは MSSA 5 検体 5.1% MRSA 9 検体 9.% た MR-CNS の例及び MRSA の 1 例が検出され MR-CNS 1 検体 1.% 及び Streptococcus これらは汚染菌が示唆されたなお PJI に関する agalactiae が 5 検体 5.1% と上位を占めていた Infectious Diseases Society of America IDSA ガイドなお手術部位感染の起因微生物調査では MSSA にライン ) では複数検体の培養検査から P. acnes 次いで CNS Enterococcus Species E. coli などが多 CNS などの常在菌が 1 菌種のみ検出された場合はいことが報告されている PJI とは断定せず他の検査所見も考慮して判断す 14 ) 18 ) 検出動向に関して日本整形外科学会学術プロジェクト研究人工関節ることされている 1) 3) 分離培養法が陰性を示した置換術および脊椎 instrumentation 術後感染症例の実皮膚常在菌に関しては PCR 法は死菌の遺伝子も検態調査では MRSA や MR-CNS による SSI が人工出するため検体採取時のコンタミネーションによる関節置換術で 4 割以上 46% を示した本検討偽陽性の可能性があり術中迅速病理所見炎症反においても MSSA MRSA および MR-CNS が約 3 割応などから PJI との関連性は低いことが考えられた検出され人工関節感染症に占める頻度がほぼ一致しかし今回の BHA 症例では 16S 解析法を実施しした組織材料で確認が可能であった 91 例中 4 例た結果 S. epidermidis が推定され PCR-LF 法でもから細菌遺伝子が検出され組織材料で確認が可能 meca 遺伝子が確認された同時に依頼された術中迅であった関節液の MSSA の 5 例中例及び MR-CNS 速病理所見として関節内に好中球主体の炎症性浸出 19 ) 医学検査 Vol.67 No

7 液を認め細菌培養検査では 7 日間陰性を示したが病態が感染症であることを考慮し Cefazolin による治療により創部の浸出液は減少し炎症反応は改善した S. epidermidis はコンタミネーションとの鑑別が難しい菌種であるが迅速病理診断および遺伝子検査法により原因菌と判断できたことは治療薬を選択する上で非常に重要であると考えられた以上より術中検体を用いた細菌遺伝子検査は組織と関節液を組み合わせることにより PJI の感染診断および適正治療に非常に有用であると考えられたなお高感度な遺伝子検査を用いて PJI の有無を判定する場合は関節液および人工関節周辺組織の採取時に生じる皮膚汚染菌などのコンタミネーションによる偽陽性の注意が必要である IV 結語 PCR-LF 法は MSSA MRSA MR-CNS の 3 菌種それ以外の細菌は E-Taq を用いた 16S 解析法の細菌遺伝子検査の有用性が確認された PCR-LF 法は約 3 時間で結果報告が可能であり PJI における培養同定検査結果が確認できない時期の早期診断に有用である今後は皮膚汚染菌の判定及び 16S 解析法の迅速性に向けた改善が必要であるなお本研究は北里大学医学部病院倫理委員会の承認を得て患者情報保護法に準じた B13-64 謝辞本研究の遺伝子検査法に関してご助言ご指導賜りました富山大学大学院医学薬学研究部医学臨床分子病態検査学講座仁井見英樹先生北島勲先生及び北里大塚バイオメディカルアッセイ研究所に深謝いたします文献 1) Douglas RO et al.: Diagnosis and management of prosthetic joint infection: Clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America, Clin Infect Dis, 13; 56: 1 1. ) Minassian AM et al.: Clinical guidelines in the management of prosthetic joint infection, J Antimicrob Chemother, 14; 69: ) Nihonyanagi S et al.: Clinical usefulness of multiplex PCR lateral flow in MRSA detection: A novel, rapid genetic testing method, Inflammation, 1; 35: ) 大楠清文江崎孝行遺伝子解析技術の新たな潮流と感染制御への適応日本化学療法学会雑誌 11; 59: ) 大楠清文江崎孝行遺伝子解析技術を活用した感染症診 666 断の実践小児感染免疫 13; 5: ) Clinical and Laboratory Standards Institute: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement (M1-S1) CLSI, January 11. 7) 小林直実他術中リアルタイム PCR を用いたインプラント感染の診断整災外 1; 53: ) Niimi H et al.: A novel eukaryote-made thermostable DNA polymerase which is free from bacterial DNA contamination, J Clin Microbiol, 11; 49: ) 日本整形外科学会診療ガイドライン委員会骨関節術後感染予防ガイドライン策定委員会編骨関節術後感染予防ガイドライン南江堂東京 6. 1) 松下和彦他整形外科領域の周術期感染予防日本化学療法学会 1; 6: ) Marin S et al.: Effectiveness of a bundled intervention of decolonization and prophylaxis to decrease Gram positive surgical site infections after cardiac ororthopedic surgery: Systematic review and meta-analysis, BMJ, 13; 346: ) Edwards K et al.: Utility of real-time amplification of selected 16S rdna sequences as a tool for detection and identification of microbial signatures directly from clinical samples, J Med Microbiol, 1; 61: ) Kommedal Ø et al.: Dual priming oligonucleotides for broadrange amplification of the bacterial 16S rrna gene directly from human clinical specimens, J Clin Microbiol, 1; 5: ) Hidron AI et al.: NHSN annual update: Antimicrobial-resistant pathogens associated with healthcare-associated infections, Infect Control Hosp Epidemiol, 8; 9: ) Ammon P, Stockley I: Allograft bone in two-stage revision of the hip for infection, J Bone Joint Surg Br, 4; 86: ) Alicia IH et al.: Antimicrobial-resistant pathogens associated with healthcare-associated infections: Annual summary of data reported to the National Healthcare Safety Network at the Centers for Disease Control and Prevention, 6 7, Infection Control and Hospital Epidemiology, 8; 9: ) Zimmerli W et al.: Prosthetic joint infections, N Engl J Med, 4; 351: ) 山本謙吾他インプラント手術における手術部位感染の疫学整災外 1; 53: ) 品川長夫他. 外科感染症分離菌とその薬剤感受性 9 年度分離菌を中心に Jpn J Antibiot, 11; 64: ) Baron EJ et al.: A guide to utilization of the microbiology laboratory for diagnosis of infectious diseases 13 recommendations by the Infectious Diseases Society of America (IDSA) and the American Society for Microbiology (ASM), Clin Infect Dis, 13; 57: e e11. 1) Weinstein MP et al.: The clinical significance of positive blood cultures in the 199s a prospective comprehensive evaluation of the microbiology, epidemiology, and outcome of bacteremia and fungemia in adults, Clin Infect Dis, 1997; 4: ) Marculescu CE et al.: Outcome of prosthetic joint infections treated with debridement and retention of components, Clin Infect Dis, 6; 4: ) Richter SS et al.: Minimizing the workup of blood culture contaminants: Implementation and evaluation of a laboratorybased algorithm, J Clin Microbiol, ; 4: 本論文に関連し開示すべき COI 状態にある企業等はありません櫻井他人工関節感染症における術中検体を用いた細菌遺伝子検査の有用性について

8 Original Article Applicability of bacterial genetic testing using intraoperative samples from patients with prosthetic joint infection Keizo SAKURAI 1) Ryuma YASUMOTO 1) Nobuyuki NAKAZAKI 1) Shinichi MUNEKATA 1) Katsufumi UCHIYAMA ) 1) 3) Yuhsaku KANOH 1) Department of Clinical Laboratory, Kitasato University Hospital (1-15-1, Kitasato, Minami-ku, Sagamihara-shi, Kanagawa 5-375, Japan) ) Department of Orthopaedic Surgery, Kitasato University School of Medicine 3) Department of Laboratory Medicine, Kitasato University School of Medicine Summary In this study, the applicability of rapid bacterial genetic testing of synovial fluid samples or intraoperative periprosthetic samples was investigated. Three different strains of Staphylococcus (methicillin-sensitive Staphylococcus aureus, MSSA; methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA; and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci, MR-CNS) were detected in 98 synovial fluid samples and 14 periprosthetic samples from around prosthetic joints by the PCR lateral flow method (PCR-LF), and other bacterial strains were detected by 16S ribosomal RNA (16S-rRNA) sequencing for bacterial identification. The results obtained by the PCR- LF method revealed that 4 synovial fluid samples (MSSA, 5.1%; MRSA, 9.%; MR-CNS, 1.%) contained bacterial DNA. Seventy-four samples with negative results of the PCR-LF method were further tested using 16S-rRNA sequencing for bacterial identification. However, a problem with detection sensitivity arose owing to Escherichia coli (E. coli) genome contamination of the enzyme solution used for amplification as well as additional bacteria present in the reagents used in the 16S-rRNA sequencing. Therefore, bacterial infection was tested using Taq polymerase from eukaryotes (E-Taq). Results showed that the direct detection of bacterial genes in samples containing bacterial cells as low as 1 1 CFU/mL (5% hit rate) was possible. Bacterial genes were detected and bacterial strains were identified in 19 of 74 samples by 16S-rRNA sequencing combined with the test using E-Taq. The detection rate was 1.5-fold higher by genetic testing than by the culture identification method. Notably, bacterial genes were detected in eight samples (MSSA, 3; MR-CNS, 3; MRSA, ) that tested negative in the culture identification method and in three periprosthetic samples (MSSA, ; MR-CNS, 1) intraoperatively collected. Therefore, contamination at the time of sample collection was suspected. In conclusion, the PCR-LF method and 16S-rRNA sequencing combined with the test using E-Taq showed satisfactory sensitivity and may therefore be clinically useful for diagnosing prosthetic joint infection. Key words: prosthetic joint infection, bacterial genetic test, PCR lateral flow method, 16S-rRNA sequencing (Received: February 5, 18; Accepted: June 4, 18) 医学検査 Vol.67 No

CHEMOTHERAPY JUNE 1993 Table 1. Background of patients in pharmacokinetic study

CHEMOTHERAPY JUNE 1993 Table 1. Background of patients in pharmacokinetic study VOL. 41 S 1 Table 2. Levels (ƒêg/ml or ƒêg/g) of S-1006 in serum, bile, and tissue (gallbladder) after oral administration