Microsoft Word - [2013修正]_Kit_8_ JEDU_F_F

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1 Biotechnology Explorer TM 実 習 用 テキスト Chromosome 16 PV92 PCR/Informatics キット カタログ 番 号 JEDU ご 使 用 にあたってのご 注 意 本 キットでは 生 徒 の 頬 からゲノム DNA を 採 取 します 採 取 するゲノム DNA には 個 人 の 全 ての 遺 伝 情 報 が 含 まれており 倫 理 上 の 問 題 が 発 生 する 恐 れがあります 実 施 にあたっては 下 記 の 事 項 を 厳 守 するようお 願 いいたします 1 採 取 を 行 う 個 人 に 実 験 内 容 を 事 前 に 説 明 し 承 諾 を 得 ておく 2 細 胞 を 採 取 することを 強 制 しない 3 実 験 終 了 後 には 採 取 し 増 幅 した DNA を 含 むサンプル 等 全 てを 本 人 自 身 で 処 理 をする 4 上 記 1 3については 実 施 記 録 を 残 しておく

2 Biotechnology Explorer にようこそ! 過 去 数 十 年 にわたる 技 術 の 進 歩 により バイオテクノロジーと 呼 ばれる 科 学 の 新 しい 領 域 が 誕 生 し 生 物 学 および 生 命 科 学 の 研 究 に 変 革 が 起 きました 生 命 の 基 本 的 な 構 造 単 位 である DNA の 分 離 分 析 をはじめ 有 用 な 実 験 手 法 が 多 く 開 発 され 生 体 内 で 起 こる 反 応 過 程 を 調 べたり ヒトの 疾 患 の 解 析 や 治 療 法 において すでに 多 数 の 進 展 がみられています そのため 教 育 の 場 でも 生 徒 にこうした 概 念 を 教 えることが 次 第 に 重 要 になってきています 来 るべき 数 十 年 のあいだには 家 庭 医 の 通 常 の 診 察 に 一 連 の DNA 診 断 検 査 が 含 まれるようになったり DNA フィンガープリント 法 が 個 人 識 別 の 最 終 的 な 方 法 となり これらの 原 理 を 理 解 することが 衛 生 学 や 栄 養 学 の 学 習 と 同 様 に 重 要 なこととなるかも しれません 高 校 短 大 専 門 学 校 あるいは 大 学 初 年 度 レベルの 生 徒 の 皆 さんに この 新 しい 技 術 にふれてい ただくため バイオ ラッド 社 は 生 徒 が 実 験 を 行 ない 基 本 的 な DNA 技 術 を 直 接 経 験 していただくた めの 教 科 書 と 実 験 器 材 を 含 んだ 学 校 教 材 キットを 開 発 しました この Biotechnology Explorer は 経 験 の 有 無 を 問 わず 教 室 で 教 える 科 学 と 実 際 の 科 学 のギャップを 埋 めようとしている 先 生 方 に 第 一 にお 選 びいただけるプログラムとなりました ポリメラーゼ 連 鎖 反 応 (PCR) 1 が 現 代 の 医 学 や 科 学 で 使 われる 機 会 が 増 加 する 一 方 であること こ の 技 術 が 社 会 の 構 成 員 の 一 人 一 人 に 大 きな 影 響 を 与 えうる 事 を 考 慮 すれば PCR の 基 本 概 念 と 応 用 を 生 徒 の 皆 様 が 理 解 することの 重 要 性 はおわかりいただけるでしょう このキットでは 生 徒 は 自 分 自 身 の DNA の 一 部 を PCR によって 増 幅 します 増 幅 される DNA の 部 分 は 多 くの 遺 伝 子 に 存 在 する ものですが 全 ての 人 に 存 在 するものではありません 実 験 室 で 得 られたデータの 解 析 をすることは 分 子 生 物 学 集 団 遺 伝 学 そして DNA 指 紋 (フィンガープリント)の 基 礎 理 論 を 教 えるきっかけにな るでしょうし PCR という 技 術 が 他 の 生 物 学 の 分 野 でどのように 利 用 されているかを 示 すことにもなるで しょう この Biotechnology Explorer は 非 常 にユニークで 極 めて 革 新 的 なものです 科 学 の 発 展 は 人 間 の 生 活 あるいは 個 人 や 社 会 の 意 思 決 定 のあり 方 に 次 第 に 影 響 力 を 持 つようになってきています 実 験 室 での 体 験 は 生 徒 の 皆 様 の 想 像 力 をかきたてるでしょうし バイオテクノロジーの 背 後 にある 科 学 の 認 識 と 理 解 を 深 める 事 にもなるでしょう サンフランシスコ 湾 岸 バイオテクノロジー 教 育 協 会 ラトガース 大 学 マキシジェン 社 ( 民 間 のバイオ テクノロジー 会 社 ) そしてスタンフォード ヒトゲノムセンターとの 五 年 間 以 上 にわたる 共 同 開 発 を 通 じ て 学 校 の 先 生 と 科 学 者 が 一 緒 に 作 業 する 事 でこのカリキュラムとキットが 生 み 出 されました この Biotechnology Explorer のカリキュラムはとてもユニークで 理 科 の 先 生 方 に 非 常 に 驚 かれ また 興 味 を 持 って 頂 いています バイオ ラッドではこれからもカリキュラムや 製 品 の 改 良 を 勧 めていきます 皆 様 のお 声 はその 意 味 でも 大 変 重 要 です ぜひご 意 見 をお 聞 かせください

3 目 次 キット 使 用 時 に 必 要 な 試 薬 器 具 等 の 一 覧...1 バックグラウンド...4 時 間 割 例 実 験 開 始 前 の 準 備 このキットを 使 用 するにあたってのポイント 結 果 の 解 釈 とトラブルシューティングガイド クイックガイド 学 生 生 徒 用 テキスト はじめに Lesson 1 DNA の 抽 出 と 鋳 型 DNA の 調 製 Lesson 2 PCR による 増 幅 Lesson 3 ゲル 電 気 泳 動 法 を 用 いた DNA の 分 析 Lesson 4 結 果 の 解 析 と 解 釈 Lesson 5 バイオインフォマティクス 付 録 A 分 子 生 物 学 の 基 礎 と 用 語 付 録 B 用 語 の 解 説 付 録 C PCR と 無 菌 操 作 付 録 D 教 員 用 解 答 テキスト 付 録 E ヒトゲノムを 用 いた 遺 伝 子 解 析 実 験 の 実 施 にあたって 付 録 F 発 展 学 習 について 付 録 I PCR 産 物 の 電 気 泳 動 パターン 例 付 録 G 参 考 文 献 付 録 H ゲルローディングテンプレート... 90

4 キット 使 用 時 に 必 要 な 試 薬 器 具 等 の 一 覧 このキットの 構 成 物 と キット 以 外 に 必 要 になる 試 薬 器 具 等 の 一 覧 表 です 1キット=8 班 4 人 分 の 実 験 に 必 要 な 数 になっています 準 備 の 時 の 確 認 リストとしてお 使 いください キット 内 容 物 1 キットあたりの 数 量 ( ) -20 保 存 : 到 着 時 冷 蔵 品 に 含 まれますが 到 着 後 冷 凍 (-20 )で 保 存 してください 1. PV92 ホモザイゴス(+/+)コントロール 100 l 1 バイアル 2. PV92 ホモザイゴス(-/-)コントロール 100 l 1 バイアル 3. PV92 ヘテロザイゴス(+/-)コントロール 100 l 1 バイアル 4. PCR マスターミックス(dNTP Taq DNA ポリメラーゼ 1 バイアル バッファー) 2 1.2ml 5. プライマーミックス l 1 バイアル 6. EZ Load TM DNA Mass Ruler 100 l 1 バイアル 7. Orange G ローディングダイ 5 1ml 1 バイアル 冷 蔵 保 存 TAE バッファー 100ml 1 本 9. アガロース 粉 末 5g 1 本 10. Fast Blast TM DNA 染 色 液 100ml 1 本 11. InstaGene マトリックス 20ml 1 本 室 温 保 存 12. PCR 用 チューブ 50 本 13. スクリューキャップ 付 きチューブ(1.5ml) 100 本 14. マイクロチューブ キャップなし(1.5ml) 50 本 15. マイクロチューブ(キャップ 付 き 1.5ml) 30 本 16. マニュアル 1 冊 1

5 本 キットに 含 まれない 必 要 な 器 具 等 生 徒 用 実 験 台 に 用 意 するもの マイクロピペット 2~20 l 1 20~200 l 1 100~1000 l 1 (100~1000 l がなければディスポーザブルピペット 8 ) ピペットチップ 2~20 l 20~200 l 100~1000 l 1 アガロースゲル 電 気 泳 動 装 置 ミニサブセル GT( J1) 8 1 箱 1 箱 パワーサプライ パワーパック Basic( ) 2-8 クラッシュアイス 用 のアイスボックス 1 使 用 済 みピペットチップ 等 廃 棄 用 容 器 8 油 性 マーカー 1 ゲル 染 色 トレイ 4-8 Jellyfish フォームフロート( 枚 )マイクロチューブ 浮 遊 用 8 教 員 用 実 験 台 に 用 意 するもの マイクロピペット 100~1000 l 1 ピペットチップ 100~1000 l 1 サーマルサイクラー 1 電 子 レンジ まで 設 定 可 能 な 恒 温 槽 1 精 製 水 約 6 L 0.9% NaCl 水 溶 液 ( 生 理 食 塩 水 ) 350 ml 紙 コップ 32 個 500ml 1L~のメスシリンダー 200~300ml 500ml または 1L のフラスコ 0.5N HCl( 精 製 水 9.5ml に 濃 塩 酸 0.5ml を 溶 解 ) 10 ml セロハンテープ 1 遠 心 分 離 器 1 食 品 保 存 用 ラップ 1 2

6 オプション ゲルサポートフィルム(50 枚 )-ゲル 乾 燥 用 ( ) 50 枚 マイクロチューブラック 4-8 振 盪 機 1 ゲルのトレイスのための 透 明 シート( 食 品 保 存 用 ラップなど) 8 保 存 と 安 定 性 : このキットの 中 身 は 適 切 な 条 件 で 保 存 されれば 未 開 封 の 状 態 で 購 入 後 一 年 間 は 品 質 が 保 証 されています 3

7 バックグラウンド <PCR-すべてはここから 始 まった> 1983 年 Cetus 社 のカリー ミュリス 2 は 遺 伝 子 研 究 に 革 命 を 起 こす 新 たな 分 子 生 物 学 的 技 術 を 開 発 し それによって 1993 年 にノーベル 賞 を 受 賞 しました ポリメラーゼ 連 鎖 反 応 (Polymerase Chain Reaction, PCR)と 名 付 けられたこの 技 術 は 発 明 後 5 年 以 内 で 分 子 生 物 学 を 多 くの 分 野 で 用 いられる 研 究 法 にな りました PCR が 発 明 される 前 の 分 子 生 物 学 の 実 験 には 手 間 暇 がかかり 高 度 の 技 術 を 要 しました 加 え て 微 量 の DNA を 用 いなければならなかったため 生 物 学 の 他 の 分 野 ( 病 理 学 植 物 学 動 物 学 薬 学 ) で 働 く 研 究 者 にとって 分 子 生 物 学 を 自 分 の 研 究 で 扱 うことが 難 しくなっていました PCR は 遺 伝 子 地 図 作 成 クローニング DNA 配 列 決 定 そして 遺 伝 子 検 出 という 4 つの 主 要 なバイオ テクノロジー 分 野 に 影 響 を 及 ぼしました PCR は 遺 伝 病 を 起 しうる 特 異 的 な 遺 伝 子 変 異 を 見 つける 医 学 的 な 診 断 法 として 3 或 いは 犯 罪 捜 査 や 裁 判 において 容 疑 者 を 分 子 レベルで 同 定 するためにも 用 いられ ていますし 4 ヒトゲノムの 配 列 決 定 でも 重 要 な 技 術 です 5 PCR が 開 発 される 前 は 分 子 生 物 学 を 治 療 学 法 医 学 薬 学 あるいは 医 学 的 診 断 で 用 いることは 技 術 的 も 経 済 的 にも 難 しいものでした PCR 技 術 の 発 達 は 分 子 生 物 学 を 扱 いづらい 科 学 から 遺 伝 研 究 や 医 学 研 究 でもっとも 扱 いやすく 幅 広 い 分 野 へと 変 え たのです <PCR とバイオテクノロジー: PCR とは? なぜ PCR は 生 物 研 究 を 一 変 させたのか?> PCR の 目 的 は 試 験 管 中 で 微 量 の DNA から その 中 の 特 定 の 部 分 を 大 量 に 合 成 することです 技 術 的 には 目 的 とする 配 列 を 含 む 鋳 型 DNA を 決 められた 方 法 により 酵 素 で 増 幅 するのです この 鋳 型 は 二 本 鎖 の DNA であればゲノム DNA でも 何 でもかまいません 研 究 者 は 一 滴 の 血 液 一 つの 毛 包 あるい は 頬 の 細 胞 から 微 量 の DNA を 抽 出 し PCR を 使 って 目 的 の DNA 断 片 を 数 百 万 個 も 合 成 しています 理 論 的 には 一 つの 鋳 型 があれば 数 百 万 個 の DNA 分 子 を 合 成 することができるのです PCR が 開 発 され る 前 は このような 微 量 の DNA を 用 いて 法 医 学 的 あるいは 遺 伝 的 な 研 究 を 行 なうことはできませんでした 研 究 者 が 調 べたい あるいは 操 作 したい DNA 配 列 を 正 確 に 増 幅 出 来 るということが PCR の 本 当 の 強 み なのです PCR による 増 幅 には 鋳 型 となる DNA 鎖 が 少 なくとも 一 つは 必 要 です このキットでは 生 徒 自 身 の 頬 の 細 胞 から 抽 出 されたヒトゲノム DNA が 鋳 型 DNA 鎖 になります PCR 反 応 には 次 のような 反 応 液 が 必 要 になります: 4 つの DNA 塩 基 (アデニン グアニン チミン シトシンの デオキシリボヌクレオチド 3 リン 酸 化 物 ) DNA ポリメラーゼ 2 つの DNA プライマー 増 幅 する 極 少 量 の 鋳 型 DNA 鎖 この 反 応 の 特 異 性 は 全 ゲノムから 一 つの 特 異 的 な DNA( 遺 伝 子 ) 断 片 に 狙 いをつけて 増 幅 することによ るのです 4

8 PCR は 遺 伝 学 の 最 も 基 本 となる 二 つの 原 理 を 利 用 しています 1. DNA 鎖 は 相 補 的 に 結 合 (ハイブリダイズ)する 2. DNA 鎖 は DNA ポリメラーゼによって 合 成 される PCR における 相 補 的 な DNA 鎖 の 結 合 とは 2 つの 異 なるプライマーが 各 々 鋳 型 上 に 存 在 する 相 補 的 な 塩 基 配 列 に 接 着 (アニーリング)することです この 2 つのプライマー(オリゴヌクレオチドプライマー) は 増 幅 する 二 本 鎖 DNA( 鋳 型 )の 各 々の DNA 鎖 の 3 末 端 に 特 異 的 に 付 着 するようなヌクレオチド 配 列 を 含 むように 人 工 的 に 合 成 します プライマーが 必 要 なのは DNA ポリメラーゼが 鋳 型 DNA の 複 製 を 開 始 して 新 たに 合 成 するためには 一 本 鎖 ではなく 二 本 鎖 の DNA がなければならないからです 鋳 型 である DNA の 二 本 鎖 は 合 成 の 前 に 熱 変 性 させて 一 本 鎖 にします そのため DNAポリメラーゼの 開 始 地 点 として 二 本 鎖 の 部 位 を 用 意 するには プライマーがどうしても 必 要 なのです DNA の ある 領 域 を 増 幅 する 前 に その 領 域 の 末 端 の 塩 基 配 列 を 同 定 しておく 必 要 があります そうしてその 配 列 は DNA 複 製 の 開 始 点 として 働 くオリゴヌクレオチドプライ マーを 作 るために 用 いられるのです しかし PCR で 用 いる DNA ポリメラーゼは 絶 対 に 耐 熱 性 のポリメラーゼでなくてはなりません これは PCR の 反 応 サイクルが 60 前 後 と 94 の 間 で 起 こるからです この 合 成 反 応 を 行 なう 熱 耐 性 DNA ポリメ ラーゼ(Taq)は Thermus aquaticus というイエローストーン 国 立 公 園 6 などでみられる 高 熱 の 温 泉 に 住 む 好 熱 性 細 菌 から 分 離 されたものです 1つの 鋳 型 からは 一 回 の 合 成 サイクル 毎 に 二 つの 鋳 型 DNA が 合 成 されます そのため 鋳 型 分 子 の 数 は 指 数 関 数 的 に 増 幅 すなわち 一 回 のサイクル 毎 に 数 が 倍 になるわけです ですから 30 サイクルの 後 には 反 応 開 始 時 点 の 2 30 倍 の 反 応 産 物 が 得 られるはずです 一 度 目 的 の DNA が 十 分 増 幅 されれば それをゲル 上 で 電 気 泳 動 することで 可 視 化 できます これにより 研 究 者 は 目 的 の PCR 産 物 の 有 無 や 各 個 人 の 遺 伝 子 の 異 同 を 調 べることができるのです 遺 伝 子 によっては 個 人 差 が 数 百 bp であることもあり ますし 1bp あるいは 一 塩 基 変 異 のような 小 さな 違 いにすぎないこともあります < 遺 伝 子 と DNA> ヒトゲノム DNA は 23 対 の 染 色 体 ( 全 部 で 46 染 色 体 )で 構 成 されています その 中 に 10 万 近 い 遺 伝 子 があると 推 定 されていましたが 最 近 になって およそ 3 万 個 の 遺 伝 子 しかないことが 明 らかになりました 各 々の 遺 伝 子 は 特 定 のタンパク 質 のための 暗 号 をもっています 興 味 深 いことに これらの 遺 伝 子 は 全 染 色 体 DNA のわずか 5%を 占 めるにすぎません 残 りの 95%は 非 暗 号 DNA( 非 コード DNA)です この 非 暗 号 DNA は 遺 伝 子 の 間 にも 遺 伝 子 の 中 にも 存 在 し 遺 伝 子 を 分 断 しています 真 核 細 胞 において こ の 非 暗 号 領 域 や 遺 伝 子 中 に 存 在 するが RNA には 転 写 されてもタンパク 質 のアミノ 酸 配 列 の 情 報 を 含 ま ない 領 域 をイントロンとよびます タンパク 質 のアミノ 酸 配 列 の 情 報 を 含 むDNA 配 列 あるいはそれを 含 む 領 域 をエクソンと 呼 びます イントロンもエクソンも 転 写 はされますが イントロンは 完 全 な mrna を 合 成 す るときに 切 り 出 されます 真 核 細 胞 では ゲノム DNA は ある 遺 伝 子 のイントロンとエクソン 両 方 を 含 むメッセンジャーRNA (mrna)にまず 転 写 されます この mrna が 核 にいる 間 に( 核 から 運 び 出 される 前 に) 遺 伝 子 を 分 断 す る 非 暗 号 領 域 即 ちイントロン(インは 核 内 にあることを 意 味 する)は mrna から 除 去 されなければなりませ ん 一 方 エクソン(エクは 核 外 を 意 味 する) 同 士 は 繋 ぎ 合 わされて タンパク 質 を 合 成 する 為 の 完 全 な 配 5

9 列 が 形 成 されます( 図 1 を 参 照 ) この 過 程 は RNA スプライシングとよばれます 遺 伝 子 の 中 には 数 個 の イントロンしか 持 っていないものも 数 十 個 のイントロンを 持 っているものもあります イントロン 1 イントロン 2 エクソン 1 エクソン 2 エクソン 3 ゲノム DNA 転 写 エクソン 1 エクソン 2 エクソン 3 スプライシング エクソン 1 エクソン 2 エクソン 3 プレ mrna mrna 遺 伝 子 型 翻 訳 タンパク 質 表 現 型 図 1. 遺 伝 子 からのイントロンのスプライシング 既 に 述 べたように 遺 伝 子 の 機 能 部 位 即 ちエクソンはタンパク 質 をコードします タンパク 質 はヒトの 生 存 に 必 須 の 物 質 です そのため エクソン 配 列 の 個 人 差 はあまりありません 驚 くべきことに イントロンの 数 や 大 きさは 人 によって 大 きく 異 なります イントロン 配 列 は 進 化 を 通 して 遺 伝 子 変 異 が 色 々な 形 で 蓄 積 されていった 結 果 であり それが 遺 伝 暗 号 として 子 孫 に 受 け 継 がれていったものであると 考 えられていま す このイントロン 配 列 の 違 いがヒトの 遺 伝 子 多 様 性 を 決 定 するうえで 役 に 立 つのです この DNA の 中 の 特 徴 的 な 性 質 を 同 定 することが 個 人 識 別 や 集 団 遺 伝 学 の 分 子 的 な 基 盤 になっているのです 進 化 の 過 程 で イントロン 配 列 には SINES(Short Interspersed Elements) 7 といわれる 短 い 分 散 型 反 復 配 列 のランダムな 挿 入 が 起 こりました SINES は 数 百 万 年 にもわたり 我 々のイントロンの 中 にランダムに 挿 入 され 続 けてきたのです このような 反 復 配 列 の 一 つが Alu 配 列 7 ( 図 2 参 照 )です これは 300bp 程 度 の 反 復 配 列 を 含 む DNA 配 列 であり 一 度 に 1 つずつ 挿 入 され ヒトゲノム 8 中 には 50 万 回 程 度 の 挿 入 が あったとされています この 様 にランダムに 反 復 する 配 列 の 起 原 や 機 能 はわかっていません この Alu と いう 名 前 は この 配 列 に 制 限 酵 素 Alu I の 切 断 部 位 が 共 通 してみられることからきています Alu 配 列 イントロン 図 2. イントロン 内 での Alu 配 列 挿 入 部 位 Alu 配 列 が 位 置 する 部 位 の 中 には 遺 伝 学 者 にとって 非 常 に 有 用 な 性 質 を 持 ったものがあります もし これが 特 定 の 病 態 と 関 連 する 遺 伝 子 のイントロン 中 に 存 在 する 場 合 その 配 列 はその 病 気 と 関 連 がある かもしれません 遺 伝 子 のイントロンに 存 在 しているのなら Alu 配 列 は 各 個 人 の 相 関 関 係 を 推 定 するの にも 用 いることができます 本 キットの 実 験 では Alu 配 列 の 分 析 はある 集 団 における 挿 入 の 頻 度 を 推 定 するためと 分 子 遺 伝 的 な 多 様 性 を 簡 単 に 調 べるために 用 いられますが それを 病 気 や 個 人 間 の 相 関 関 係 と 関 連 づけることはありません 6

10 このキットでは 第 16 染 色 体 の PV92 遺 伝 子 座 内 にある 一 つの Alu 配 列 を PCR で 簡 単 にスクリーニン グします この Alu イントロンは 二 形 性 です すなわち その 因 子 はある 人 には 存 在 し ある 人 には 存 在 し ません( 下 記 参 照 ) ある 人 は 片 方 の 第 16 染 色 体 の PV92 遺 伝 子 座 に 挿 入 配 列 を 持 ち ある 人 はどちら の 相 同 染 色 体 にもそれを 持 っています そして どちらにも 挿 入 配 列 を 持 っていない 人 もいます この 挿 入 配 列 の 有 無 は PCR とアガロースゲル 電 気 泳 動 により 検 知 することができます この 実 験 では 生 徒 は 自 分 の 頬 の 細 胞 からゲノム DNA を 抽 出 します 生 徒 が 使 うプライマーは Alu 配 列 全 体 (300bp)と 641bp の PV92 遺 伝 子 座 を 挟 むようデザインされており Alu 配 列 が 存 在 すれば 941bp の 断 片 が 存 在 しなければ 641bp の 断 片 が 増 幅 されます PCR 産 物 を 用 いてアガロースゲル 電 気 泳 動 を 行 えば Alu 配 列 を 持 つ(+/+)ホモザイゴス(941bp の 産 物 のみ)と Alu 配 列 を 持 たない(-/-)ホモザイ ゴス(641bp の 産 物 のみ) 941bp の 産 物 641bp の 産 物 の 両 方 が 存 在 する(+/-)ヘテロザイゴスを 充 分 見 分 けることができます PV92 遺 伝 子 型 PCR 産 物 の DNA サイズ Alu ホモザイゴス(+/+) 941bp Alu ホモザイゴス(-/-) 641bp Alu ヘテロザイゴス(+/-) bp 図 3. 第 16 染 色 体 の PV92 遺 伝 子 座 内 の Alu 配 列 の 有 無 7

11 <PCR ステップ バイ ステップ> PCR 技 術 では 1 鋳 型 の 変 性 2プライマーのアニーリング( 接 着 ) 3TaqDNA ポリメラーゼによる 付 着 したプライマーの 伸 長 という 一 連 のサイクルが 繰 り 返 されます DNA を 増 幅 し 始 める 前 に ゲノム DNA を 生 徒 の 頬 の 細 胞 から 抽 出 する 必 要 があります サンプルを 用 意 した 後 (ページ 30 参 照 ) 鋳 型 DNA オリゴヌクレオチドプライマー 耐 熱 性 DNA ポリメ ラーゼ(Taq) 4 つのデオキシヌクレオチド(A T G C)を 含 む 反 応 液 をまとめて 一 つのマイクロチューブ で 混 ぜます このマイクロチューブをサーマルサイクラーに 入 れます サーマルサイクラーにはサンプルを 保 持 し 温 度 を 大 きく 急 速 に 上 下 できるアルミ 性 の 塊 (アルミブロック)があります このアルミブロックでサ ンプルを 急 速 に 加 熱 したり 冷 却 する 事 を 温 度 サイクル あるいは 熱 サイクル といいます 温 度 サイクルの 最 初 の 段 階 はサンプルを 94 にまで 温 めることです このような 高 熱 下 では 鋳 型 DNA 鎖 は1 本 鎖 に 分 離 します( 変 性 ) そのため これを 変 性 (denature ディネイチャー)ステップ とよびま す このサーマルサイクラーは 温 度 を 60 にまで 急 速 に 下 げ 分 離 した 鋳 型 鎖 にプライマーがアニーリング ( 接 着 ) 出 来 るようにします これは アニーリング(annealing)ステップ と 呼 びます もともとの 二 本 の 鋳 型 鎖 が 再 び 接 着 したりプライマーと 競 合 したりする 可 能 性 はあります しかし オリゴヌクレオチドプライマー の 量 がずっと 多 いので プライマーが 鋳 型 DNA 鎖 の 相 補 的 配 列 にくっつく 可 能 性 のほうがずっと 高 いの です 最 後 に サンプルを72 に 加 熱 し TaqDNAポリメラーゼがプライマーを 伸 長 して 各 々の 鋳 型 DNA 鎖 か ら 完 全 な 複 製 産 物 をつくれるようにします これは 伸 長 (extention エクステンション)ステップ とよばれ ます Taq ポリメラーゼはこの 温 度 で 最 も 効 率 良 くはたらきます そうして 2 つの 相 補 的 な DNA 鎖 が 合 成 されます すなわち 鋳 型 DNA が 二 つになったわけです この 二 つの 鋳 型 DNA は 次 の 温 度 サイクルや DNA 鎖 の 合 成 に 利 用 されます ここで 一 つの 完 全 な 温 度 サイクル( 熱 サイクル)が 完 了 するわけです( 次 頁 図 4 参 照 ) 温 度 サイクル= 変 性 ステップ+アニーリングステップ+ 伸 長 ステップ 8

12 95 での DNA 鎖 の 変 性 60 でのプライマーのアニーリング (Taq ポリメラーゼは 二 本 鎖 基 質 を 認 識 します) 72 での 伸 長 ( 新 しい DNA 鎖 の 合 成 ) サイクルを 40 回 繰 り 返 す 図 4. PCR の 全 サイクル 温 度 サイクルは 40 回 繰 り 返 されます 各 温 度 サイクルの 度 に 鋳 型 鎖 の 数 は 二 倍 になり 鋳 型 DNA の 数 は 指 数 関 数 的 に 増 加 します 40 サイクルの 後 鋳 型 DNA の 数 は 理 論 的 には 倍 になっている 筈 です PCR で 最 も 特 徴 的 なのは 正 確 な 長 さと 塩 基 配 列 をもった DNA が 合 成 されることです 始 めのサイクル では 二 つの 異 なるオリゴヌクレオチドプライマーが 別 々の 鎖 の 両 端 に 付 着 します 最 初 の 温 度 サイクル が 完 了 した 後 二 つの 新 しい DNA 鎖 が 合 成 されるわけですが それはもとの 鋳 型 DNA よりは 短 く しかし 増 幅 する DNA よりは 長 くなります 正 確 な 長 さの DNA が 合 成 されるのは 3 回 目 の 温 度 サイクルが 終 った 後 です( 次 頁 図 5) 9

13 1 回 目 サ イ ク ル 1 回 目 サイクルの 伸 長 段 階 94 での 変 性 新 たな 中 間 鋳 型 鎖 2 回 目 サ イ ク ル 60 でのプライマーのアニーリング 72 での 新 たな DNA 鎖 の 伸 長 94 での 変 性 3 回 目 サ イ ク ル 同 一 の 長 さのフラグメント 60 でのプライマーのアニーリング 72 での 新 たな DNA 鎖 の 伸 長 全 40 サイクル 図 5. 同 一 の 長 さのフラグメントがつくられる 指 数 関 数 的 に 増 幅 されるのはこの 正 しい 長 さの 鋳 型 DNA 鎖 です(X n X=もとの 鋳 型 の 数 n=サイクル 数 ) 決 して 完 全 には 複 製 されることのない もともとの 長 い DNA 分 子 は 常 に 一 組 だけ 存 在 します 各 々 の 温 度 サイクルの 後 2 つの 中 間 の 長 さの DNA 鎖 が 合 成 されますが この DNA 鎖 も 指 数 関 数 的 には 増 幅 されません なぜなら これはもとの 鋳 型 からしか 合 成 できないからです ですから もし 一 つの 二 本 鎖 DNA 分 子 に 対 して 20 サイクルの 増 幅 を 行 なった 場 合 は もとの 鋳 型 ゲノム DNA 鎖 が 一 つ 中 間 長 の 鋳 型 鎖 が 20 そして 個 の 正 確 な 長 さの 複 製 産 物 が 得 られるわけです 40 サイクルの 後 には もと の 鋳 型 ゲノム DNA 鎖 が 一 つ 中 間 長 の 鋳 型 鎖 が 個 の 正 確 な 長 さの 複 製 産 物 が 得 られるわ けです( 次 頁 図 6 参 照 ) 10

14 スタート サイクル 1 サイクル 2 サイクル 3 サイクル 4 サイクル 5 サイクル 6 20サイクル 後 の 最 終 的 な 数 鋳 型 DNA 中 間 長 の DNA 正 しい 長 さの DNA 図 6. 正 しい 長 さの DNA だけが 指 数 関 数 的 に 増 幅 される < 発 展 学 習 :Alu 配 列 とハーディー ワインベルグの 法 則 > 遺 伝 子 の 非 暗 号 領 域 に Alu 配 列 が 存 在 する 意 義 は これはいかなるタンパク 質 もコードせず 特 定 の 病 気 との 関 連 が 無 い 事 です Alu 配 列 はランダムにヒト 集 団 のゲノムに 挿 入 されるので ヒト 集 団 における 遺 伝 子 頻 度 の 研 究 に 大 変 有 用 なのです Lesson 4 では ハーディー ワインベルグの 平 衡 説 の 原 理 を Alu 配 列 の 遺 伝 子 型 と 頻 度 の 検 証 に 応 用 することができます ハーディー ワインベルグの 式 p 2 +2pq+ q 2 =1 は 集 団 全 体 の 遺 伝 子 型 における 対 立 遺 伝 子 の 頻 度 を 記 述 しています この 実 習 では p 2 は Alu 配 列 について(+/+)ホモザイゴスである 個 人 の 頻 度 q 2 は Alu 配 列 について(-/-)ホモザイゴスである 個 人 の 頻 度 2pq は Alu 配 列 についてヘテロザイゴスである 個 人 の 頻 度 をさします 生 徒 の 集 団 中 での Alu 遺 伝 子 型 の 頻 度 を 調 べることで 対 応 する 対 立 遺 伝 子 の 頻 度 が 計 算 出 来 るのです 加 えて クラスで の 遺 伝 子 頻 度 は もっと 大 きな 集 団 での 結 果 と 比 較 する 事 ができます 9 さらに 生 徒 には Cold Spring Harbor Laboratory のウェブサイト 内 の Allele Server と 呼 ばれる PV92 Alu 多 型 性 を 示 すデータベースにクラス 内 全 体 のデータを 入 力 させ 情 報 科 学 についての 練 習 を 行 わせ ることもできます 生 徒 はこのデータベースを 用 いて 自 分 のクラスのデータが 予 想 されるハーディー ワイ ンベルグ 遺 伝 子 型 に 沿 ったものであるかどうかを 確 認 することになります この 発 展 学 習 は ハーディー ワインベルグの 法 則 を 教 えるきっかけになるでしょう 表 1 2(ページ 61 ~62 参 照 )の 生 徒 データを 用 いて ヒト 集 団 はハーディー ワインベルグの 平 衡 状 態 ではない 事 を 示 して 下 さい 11

15 時 間 割 例 このキットを 使 用 する 際 に 50 分 授 業 を 数 回 で 行 えるようになっています 先 生 方 の 都 合 生 徒 や 生 徒 の レベル 等 に 合 わせてカリキュラムを 組 んでください また 全 ての 授 業 に 生 徒 のための 一 連 の 予 備 考 察 生 徒 実 験 解 析 に 関 する 質 問 および 結 果 の 解 釈 の 3 つの 過 程 が 含 まれています < 授 業 内 容 > Lesson 1; 鋳 型 DNA の 準 備 頬 細 胞 の 採 取 頬 細 胞 サンプルからのゲノム DNA の 抽 出 Lesson 2; PCR 増 幅 PCR 反 応 の 準 備 実 施 アガロースゲル 作 成 Lesson 3; PCR 産 物 の 電 気 泳 動 PCR 産 物 のアガロースゲル 電 気 泳 動 ゲル 染 色 Lesson 4; 結 果 の 分 析 と 解 釈 ゲルの 脱 色 結 果 考 察 ディスカッション 12

16 実 験 開 始 前 の 準 備 < 大 まかな 準 備 内 容 について> まず 実 際 にキットを 使 用 して 授 業 を 行 う 前 に 必 要 な 準 備 内 容 とそれにかかる 時 間 を 紹 介 します 詳 細 な 準 備 内 容 は 13~22 ページをご 覧 ください 準 備 いつ 必 要 時 間 マニュアルを 読 む すぐ 2 時 間 インスタジーンマトリックスを 分 注 する Lesson 1 の 前 45 分 0.9%NaCl 水 溶 液 を 調 製 する 生 徒 の 実 験 台 を 用 意 する 試 薬 を 分 注 する Lesson 2 の 前 1 時 間 コントロールの PCR 反 応 物 を 準 備 する TAE バッファーを 準 備 する アガロース 溶 液 を 準 備 する サーマルサイクラーをプログラムする 生 徒 の 実 験 台 を 準 備 する Fast Blast DNA 染 色 液 を 準 備 する Lesson 3 の 前 20 分 生 徒 の 実 験 台 を 準 備 する 生 徒 の 実 験 台 を 準 備 する Lesson 4 の 前 10 分 < 実 験 直 前 に 準 備 すべき 試 薬 器 具 のチェックリスト> 各 生 徒 に 準 備 する 実 験 試 薬 器 具 実 験 を 始 める 前 に 実 験 を 行 う 生 徒 や 生 徒 達 のために 次 のリストにあるものをすべて 用 意 します リスト は 1 班 当 たりに 必 要 なものです このキットには 最 高 8 班 4 人 =32 人 の 生 徒 が 実 験 できる 分 量 が 揃 っ ています あらかじめ 1 つの 班 の 実 験 スペースに 置 いておくと 良 いでしょう また マイクロチューブには 間 違 いのないように 印 またはラベルをしておくことをお 勧 めします 共 有 で 使 用 する 実 験 試 薬 器 具 生 徒 達 が 共 有 して 使 用 する 試 薬 や 器 具 を 準 備 します これらのものは 先 生 が 使 用 する 実 験 スペースに 置 くと 良 いでしょう ウォーターバスやインキュベーターは 前 もって 温 度 調 節 しておく 必 要 があります 13

17 Lesson 1 鋳 型 DNA の 調 製 生 徒 用 実 験 台 机 当 たりの 数 ( ) インスタジーンマトリクス 1 スクリューキャップ 付 チューブ 8 マイクロチューブラック 2 P-20 マイクロピペット 1 P-200 マイクロピペット 1 P-1000 マイクロピペット 1 (P-1000 マイクロピペットがなければ 4 ) ディスポーザブルピペット 紙 コップ 4 0.9%NaCl 水 溶 液 10ml/1 人 廃 液 用 容 器 1 フォームフロート 1 先 生 の 実 験 台 P-200 マイクロピペット 1~8 ピペットチップ(フィルタータイプ) 20~200 l 1 箱 ピペットチップ(フィルタータイプ) 100~1000 l 1 箱 恒 温 槽 ( ) 1 遠 心 分 離 機 1 Lesson 2 PCR 増 幅 生 徒 用 実 験 台 机 当 たりの 数 ( ) PCR チューブ 4 蓋 なしマイクロチューブ 4 P-20 マイクロピペット 1 ピペットチップ(フィルタータイプ) 2~20 l 8 チップ マイクロチューブラック 2 油 性 マーカー 1 クラッシュアイス 入 りボックス 1 PCR 反 応 溶 液 ( 分 注 したもの) 1 廃 液 用 容 器 1 14

18 先 生 の 実 験 台 ゲルトレイ 各 実 験 台 1 つ アガロース 溶 液 ( 事 前 準 備 参 照 ) 40ml/ゲル セロハンテープ 各 実 験 台 1 つ サーマルサイクラー 1 15

19 Lesson 3 PCR 産 物 の 電 気 泳 動 生 徒 用 実 験 台 机 当 たりの 数 ( ) アガロースゲル PCR 用 サンプル 1 枚 人 数 分 P-20 マイクロピペット 1 EZ Load TM DNA Mass Ruler 1 Orange G ローディングダイ 1 ピペットチップ(フィルタータイプ) 0~20 l 1 箱 油 性 マーカー 1 マイクロチューブラック 2 アガロースゲル 電 気 泳 動 システム ( 泳 動 槽 ゲルトレイ 8 ウェルコーム) ゲル 染 色 トレイ 1 廃 液 用 容 器 1 1 先 生 の 実 験 台 1 TAE 電 気 泳 動 用 バッファー Fast Blast DNA 染 色 液 泳 動 槽 あたり 275ml 500ml ポジティブコントロール 3 ホモザイゴス(+/+) ホモザイゴス(-/-) ヘテロザイゴス(+/-) ネガティブコントロール 1 遠 心 分 離 機 (オプション) 1 EZ Load TM DNA Mass Ruler 1 振 盪 器 1 食 品 保 存 用 ラップ 1 Lesson 4 結 果 の 分 析 と 解 釈 生 徒 用 実 験 台 机 当 たりの 数 ( ) ゲルサポートフィルム(オプション) 1 ゲル 脱 色 用 の 水 ~1L ゲルをトレイスするための 透 明 シート(オプション) 1 16

20 < 各 ステップにおける 事 前 準 備 の 詳 細 な 手 順 > ここでは 実 験 に 先 立 って 行 った 方 が 良 いと 思 われる 事 前 準 備 について 説 明 します Lesson 1 鋳 型 DNA の 調 製 目 的 時 間 必 要 な 材 料 インスタジーン マトリックスを 分 注 する 0.9%NaCl 水 溶 液 を 調 製 する 生 徒 と 教 官 の 実 験 台 を 準 備 する 56 と 100 の 恒 温 槽 を 用 意 する 30 分 マイクロチューブ 8 つ クラッシュアイス アイスボックス 操 作 手 順 1. インスタジーンマトリックスを 分 注 する A. マトリックスを 再 懸 濁 するために インスタジーンマトリックスのはいったボトルを 何 回 か 上 下 に 静 かにふって 中 身 を 充 分 混 合 させます 試 薬 を 分 注 するときにはマトリックスがきちんと 混 合 され ている 事 を 必 ず 確 認 することが 重 要 です このマトリクスは 溶 液 中 ですぐに 沈 殿 するので 分 注 操 作 をしている 最 中 は 何 度 もよくボトルを 振 り 混 ぜることが 重 要 です B. ピペットを 用 いて900 lのマトリックスを8つのマイクロチューブへ 入 れ インスタジーン とラベル し 氷 上 におきます 一 回 一 回 のピペット 操 作 の 後 に 必 ず 良 く 混 合 することが どのチューブにも 均 等 な 量 を 取 分 けるポイントです %NaCl 水 溶 液 を 調 製 する A. NaCl 3.15g を 精 製 水 350ml に 溶 解 する B. 紙 コップに 1 人 あたりの 必 要 量 10mlずつ 分 注 しておく Lesson 2 PCR 反 応 目 的 時 間 プライマーミックスとマスターミックス(Taq ポリメラーゼ ヌクレオチド バッファー MgCl 2 )を 混 ぜて 完 全 な PCR 反 応 溶 液 を 準 備 する コントロールの PCR 反 応 物 を 準 備 する サーマルサイクラーをプログラムする アガロースゲルの 作 成 ( 実 験 中 に 生 徒 が 泳 動 用 ゲルを 作 成 する 場 合 は 先 生 は ゲルを 用 意 しておくだけで 結 構 です アガロース 溶 液 を 用 意 する 場 合 は 使 用 する まで 35~45 の 恒 温 槽 に 入 れておくと 良 いでしょう ) 1~1.5 時 間 (どの 様 にゲルを 準 備 するかによります) 材 料 氷 上 に マイクロチューブ 10 本 (キャップ 付 のマイクロチューブ) 17

21 操 作 手 順 プライマーミックス マスターミックス コントロール 用 のチューブ 12 本 :1 セット/2 グループ ホモザイゴス(+/+) ホモザイゴス(-/-) ヘテロザイゴス(+/-) 電 気 泳 動 装 置 トレイ コーム 電 気 泳 動 用 バッファー(50 TAE) アガロースパウダー マイクロピペット(P-20 P-200) フィルターチップ 500ml 1L~のメスシリンダー 200~300ml 500ml または 1L のフラスコ 食 品 保 存 用 ラップ 重 要!: 試 薬 のチューブをあける 前 には 内 容 物 を 良 く 混 ぜるため 数 回 タッピングをし 下 におとすため に 必 ず 小 型 遠 心 分 離 器 でかるく(~3 秒 ) 回 転 させてください 特 に 冷 凍 されていた 溶 液 は 溶 解 した ときに 成 分 がチューブ 下 部 に 沈 んでいますので 混 ぜることによって 均 一 な 濃 度 の 溶 液 を 分 注 することが できます また 試 薬 は 全 て 氷 上 に 置 いておきます *マスターミックスとプライマーミックスの 混 合 溶 液 を PCR 反 応 溶 液 とします 1. マスターミックスを 分 注 します もし PCRにかける 生 徒 用 のサンプルが 16 個 以 下 の 場 合 には マスターミックスを2つのチューブに 500 l ずつ 入 れてください もう 一 つは 冷 凍 保 存 することができます プライマーミックスは Tris バッ ファー 中 に 黄 色 の 濃 縮 溶 液 として 提 供 されています プライマーミックスは 濃 縮 された 状 態 のほうが 安 定 性 が 高 いため マスターミックスへのプライマーミックスの 添 加 は 実 験 の 開 始 直 前 に 行 い 15~ 30 分 以 内 に PCR による 増 幅 を 行 うようにしてください 32 人 の 生 徒 あるいは 8 つの 実 験 台 に 対 して (16 人 あるいは4つの 実 験 台 なら 半 分 ) 1-a. 10 個 のマイクロチューブを マスター とラベ ルし 氷 上 におきます 1-b. 20 l のプライマーミックスを 1000 l のマス ターミックスにいれ 10 秒 間 ボルテックスでかき 混 ぜます プライマーミックスを 入 れた 後 必 ず PCR 反 応 溶 液 を 均 一 に 混 合 することが 重 要 です マスターミックス 1000 l に 対 し プライマーミックス 20 l プライマーミックス マスターミックス 1-c. PCR 反 応 溶 液 95 l を 10 個 のラベルしたマイクロチューブに 分 注 します 8 個 は 生 徒 に( 各 実 験 台 に 一 つずつ) 2 つはポジティブ ネガティブコントロールとして 用 います 18

22 1-d. 最 高 の 結 果 を 得 るためには これらの 試 薬 は 15~30 分 以 内 で PCR 反 応 に 用 いることをおすす めします 2. コントロール 用 の PCR チューブを 準 備 し 次 のようにラベルします:(+/+) (-/-) (+/-) もし 一 度 の 実 習 でキット 全 部 を 使 うのであれば 各 々のコントロールを 4 本 全 部 で12 本 準 備 してください もしキットを 二 回 かけて 使 うのであれば コントロールを 2 本 ずつ 全 部 で 6 本 のチューブを 準 備 してく ださい 使 用 しなかったコントロール 用 の 溶 液 は 次 回 まで 冷 凍 保 存 してください それぞれの PCR チューブに 次 のコントロールサンプルを 入 れてください (+/+)PCR チューブ (-/-)PCR チューブ (+/-)PCR チューブ 20 l の(+/+)コントロール 20 l の(-/-)コントロール 20 l の(+/-)コントロール 2-a. 20 l の PCR 反 応 溶 液 を 次 のように 各 々のコントロール 用 PCR チューブに 入 れます 各 々の チューブに 新 しいチップを 用 いてください 2-b. サーマルサイクラーに 入 れるまで 氷 上 で 静 置 してください 2-c. ネガティブコントロールを 準 備 する 場 合 は PCR チューブに 精 製 水 20 l に PCR 反 応 溶 液 を 20 l 加 えて 準 備 します その 後 の 操 作 はポジティブコントロール 同 様 にしますが 1 班 4 人 の 場 合 アガロースゲルのウェル 数 が 足 りず 電 気 泳 動 ができませんので 注 意 してください 3. アガロースゲルを 準 備 します ( 生 徒 が 準 備 してもかまいません) 3-a. バッファーの 調 製 : TAE バッファーは 50 倍 濃 度 の 保 存 溶 液 として 添 付 されています アガロー スゲルの 作 成 に 使 用 する 他 に 電 気 泳 動 槽 1 台 につき およそ 275~300ml の 1 TAE バッファーが 必 要 です 1 TAE バッファーが 3L あれば 8 台 分 の 電 気 泳 動 槽 および 8 枚 のアガロースゲル 作 成 に 十 分 足 りるでしょう 50 TAE から 1 TAE を 3L 調 製 するためには 蒸 留 水 2.94L に 50 TAE 60ml を 加 えます 3-b. アガロースの 準 備 : 本 実 験 で 推 奨 するゲル 濃 度 は 1.0%アガロースです ゲルの 厚 さは 0.75 ~1.0 cm です このゲル 濃 度 は 解 像 度 に 優 れ 電 気 泳 動 で DNA 断 片 を 分 離 する 場 合 の 泳 動 時 間 が 最 小 で 済 みます 1.0% 溶 液 を 調 製 するためには アガロース 1.0g を 100ml の 1 TAE バッファー に 加 えるだけで 良 いです アガロース 溶 解 には 必 ず 電 気 泳 動 用 バッファーを 使 用 してください 水 は 絶 対 に 使 用 しないでください 3-c. 適 当 な 容 器 ( 例 えば 250ml の 三 角 フラスコ メディウム 瓶 など)を 用 意 します 沸 騰 時 の 事 故 防 止 や アガロースの 溶 解 時 間 を 考 慮 すると 使 用 する 容 器 は 一 度 に 調 製 する 液 体 容 量 の 2 倍 以 上 の 容 量 を 有 する 容 器 例 えば アガロース 100ml を 調 製 するときは 200~300ml フラスコを 使 用 してく ださい 容 器 にアガロース 粉 末 を 入 れ 1 TAE バッファーを 適 正 量 加 えて 懸 濁 します アガロース 溶 液 を 調 整 するために ホットプレートマグネチックスターラーあるいは 電 子 レンジでアガロースを 溶 解 することができます アガロース 粉 末 が 完 全 に 溶 解 してしまうまで この 混 合 液 を 電 子 レンジあるい は 恒 温 槽 で 煮 沸 します 状 況 に 応 じて 2~3 回 に 分 けて 調 製 すると 良 いでしょう 19

23 ! 警 告!:アガロースゲルを 調 製 および 注 入 する 場 合 は 常 にグローブ ゴーグル および 実 験 衣 を 着 用 してください 沸 騰 したアガロース あるいは 熱 いアガロース 入 り 容 器 が 皮 膚 に 接 触 すると 重 度 のやけど の 原 因 になる 恐 れがあります また 溶 液 の 突 沸 には 充 分 注 意 してください 電 子 レンジを 使 用 する 方 法 ゲル 溶 液 を 電 子 レンジに 入 れます 蓋 付 ビンを 使 用 している 場 合 は 蓋 を 緩 めます 加 熱 設 定 を 中 にし 加 熱 時 間 を 5 分 に 設 定 します 30 秒 ごとに あるいは 溶 液 が 沸 騰 しそうになったら 電 子 レ ンジを 止 め フラスコを 実 験 台 上 で 水 平 に ゆっくりと 振 って 溶 け 残 っているアガロースを 懸 濁 させま す これが 最 も 早 く 最 も 安 全 なアガロース 溶 解 法 です 小 さな 半 透 明 のアガロース 粒 子 が 完 全 に 溶 解 するまで 煮 沸 と 振 とうを 繰 り 返 します 加 熱 中 は 必 ず 電 子 レンジの 中 にあるフラスコ 内 の 溶 液 が 突 沸 しないように 加 熱 中 は 常 に 目 で 見 ながら 注 意 してください アガロースゲルが 完 全 に 溶 解 し たら ゲルトレイに 注 ぐまで 小 さなフラスコで 蓋 をしたまま 60 ( 手 で 触 れられる 程 度 )に 冷 まします ホットプレートマグネチックスターラー 溶 解 していないゲル 液 に 攪 拌 子 を 入 れます ホットプレートマグネチックスターラーで 攪 拌 しながら 沸 騰 するまで 溶 液 を 加 熱 します 泡 はフラスコの 頚 部 をすすぐ 前 に 消 えるはずです 小 さな 半 透 明 のアガロース 粒 子 が 完 全 に 溶 解 するまで 煮 沸 を 繰 り 返 します ゲルトレイに 注 ぐまで アルミ 箔 等 で 蓋 をしたまま 60 ( 手 で 触 れらる 程 度 )に 冷 まします 加 熱 中 は フラスコ 内 で 突 沸 が 起 こらないよう 常 に 目 で 見 ながら 注 意 してください アガロースゲルの 作 成 この 実 験 では 各 ゲルに 8 ウェル 以 上 のサンプルウェルが 必 要 です 上 記 の 指 示 通 りにアガロース を 調 製 し クラスあたりのアガロースの 必 要 量 を 決 定 してください ゲル 用 コームの 歯 を 完 全 に 覆 うま で およそ 0.5~0.75cm の 深 さまでアガロースを 注 ぎます ゲルトレイのゲルを 注 ぐ 面 から 0.75~ 1.0cm の 部 分 に 印 をつけておいても 良 いでしょう ゲルが 固 まるまではゲルトレイを 動 かしたり い じったりしないでください ゲルが 固 まったら ジッパー 付 き 保 存 袋 や 保 存 用 タッパーに 入 れ 翌 日 に 使 用 するまで 室 温 あるいは 冷 蔵 庫 に 保 管 します 授 業 で 生 徒 にゲルを 作 成 させる 場 合 クラス 全 体 がゲルを 流 し 終 わるまでの 所 要 時 間 は 約 30 分 かかるでしょう できれば 予 備 のゲルを 1~2 枚 作 成 します ここでは アガロース 溶 液 を 流 し 込 む 場 合 にゲルトレイをテープで 止 める 方 法 を 簡 単 に 説 明 します その 他 の 方 法 はサブセル GT 取 扱 い 説 明 書 に 詳 述 されています A. ゲルトレイの 端 をセロハンテープでしっかり 目 張 りします 液 体 状 のゲルがもれないように ゲル トレイの 端 にピンと 張 る 状 態 にテープをとめます B. 水 平 台 あるいは 実 験 台 上 に 水 準 器 を 置 き 水 平 を 確 かめたらゲルトレイをおきます C. 1 TAE バッファーに 溶 解 したアガロースを 必 要 な 濃 度 と 量 で 調 製 します D. 流 し 込 む 前 に 60 まで 冷 まします E. アガロースを 60 まで 冷 ましている 間 に ゲルトレイの 適 当 な 溝 にコームを 置 きます コームは ゲルトレイの 端 から 3/4 インチ( 約 1.9cm) 以 内 に 置 いてください(ゲル 中 央 には 置 かないでくだ さい) 20

24 F. ゲルを 室 温 に 10~20 分 置 いて 固 まるのを 待 ちます 使 用 できるようになると 白 く 濁 って( 不 透 明 に)みえるようになります G. 固 まったゲルから 慎 重 にコームを 取 り 外 します 真 上 にそっと 持 ち 上 げるようにするとうまくいき ます H. ゲルトレイ 端 のテープをはがします I. 水 平 にした DNA 電 気 泳 動 槽 に サンプルウェルを 陰 極 側 ( 黒 色 )にするようにゲルトレイを 置 き ます 泳 動 中 は DNA サンプルは 陽 極 ( 赤 色 ) 方 向 に 向 かって 移 動 します 4. サーマルサイクラーをプログラムする サーマルサイクラーは サイクル 1 に 3 ステップを 含 むようにプログラムします 最 後 のサイクル 2 で 最 後 の 伸 長 反 応 が 完 了 し 合 成 可 能 な 全 ての PCR 産 物 が 生 成 されます サイクル ステップ 機 能 温 度 時 間 1 ステップ 1 変 性 94 1 分 ステップ 2 アニーリング 60 1 分 ステップ 3 伸 長 72 2 分 40 回 繰 り 返 す 2 ステップ 1 最 後 の 伸 長 反 応 分 1 回 のみ 細 かいプログラムの 方 法 についてはサーマルサイクラーの 説 明 書 をご 覧 ください 21

25 Lesson 3 DNA サンプルの 電 気 泳 動 目 的 時 間 材 料 操 作 手 順 ポジティブコントロールを 準 備 する Fast Blast DNA 染 色 液 を 準 備 する 生 徒 と 先 生 の 実 験 台 を 準 備 する DNA サイズマーカー(EZ Load TM DNA Mass Ruler)の 分 注 ORANGE G ローディングダイの 分 注 20 分 蓋 つきマイクロチューブ スクリューキャップマイクロチューブ 8 つずつ Fast Blast DNA 染 色 液 マイクロピペット(P-20 P-200)とフィルターチップ 1. ポジティブコントロール 用 のサンプルを 調 製 します 10μlの ORANGE GローディングダイをPCR(+/ +) (-/-) (+/-)ポジティブコントロールサンプルに 加 えます チューブを 先 生 の 実 験 台 に 置 いてください 先 生 あるいは 生 徒 のグループが ポジティブ ネガティブコントロールを 25 ページに 述 べてあるようにゲルに 注 入 します 2. 染 色 方 法 には 一 晩 染 色 を 行 うオーバーナイトステインと 染 色 時 間 が1~2 時 間 のクイックステインの 2 種 類 があります 授 業 の 時 間 割 等 に 合 わせてお 選 びください 適 当 な 大 きさのフラスコを 使 用 し オーバーナイトステインの 場 合 Fast Blast 染 色 液 1ml を 蒸 留 水 499ml で 希 釈 します クイックステインで 染 色 する 場 合 は Fast Blast 染 色 液 100ml を 蒸 留 水 400ml で 希 釈 します フラスコの 口 を 食 品 保 存 用 ラップ 等 で 覆 い 使 用 するまで 室 温 で 保 管 します 7cm 平 方 のゲルを 染 めるのに 必 要 な Fast Blast 染 色 液 は 60ml~100ml 程 度 (ゲルの 厚 さにより 変 わります)になります ゲルの 染 色 は 実 験 台 に 一 つずつ 割 り 当 てられた 染 色 トレイで 行 なうべきですが 大 きい 染 色 皿 を 用 いて 一 度 にたくさん 染 色 してもよいでしょう この 色 素 は 無 毒 ですが 手 が 染 まらないようにするために ゲルを 扱 う 時 はラテックス 製 あるいはビ ニール 製 の 手 袋 を 使 用 してください 3. DNA サイズマーカーを 分 注 します 11 l の EZ Load TM DNA Mass Ruler を 8 つのマイクロチューブに 入 れ M とラベルしてください EZ Load TM DNA Mass Ruler DNAのバンドのサイズは 81 ページに 示 し てあります 4. Orange G ローディングダイを 分 注 します 50 l の Orange G ローディングダイを 8 つのスクリュー キャップマイクロチューブに 入 れ LD とラベルしてください 22

26 Fast BlastDNA 染 色 手 順 染 色 方 法 には 一 晩 染 色 を 行 うオーバーナイトステインと 染 色 時 間 が1~2 時 間 のクイックステイン の2 種 類 があります 授 業 の 時 間 割 等 に 合 わせてお 選 びください オーバーナイトステインによる 染 色 方 法 1. 非 金 属 製 のへら 等 を 使 用 してゲルトレイからゲルを 外 します サンプルウェルの 列 に 沿 ってゲ ルが 裂 ける 場 合 があるので サンプルウェルの 部 分 を 支 えるように 特 別 の 注 意 を 払 う 必 要 があ ります 2. ゲルを 完 全 に 覆 いきるまで 1 Fast BlastDNA 染 色 液 を 注 ぎます 食 品 保 存 用 ラップで 覆 い 乾 燥 を 防 ぎ 一 晩 染 色 します 3. 翌 日 蒸 留 水 でゲルを 数 回 すすぎ ゲルの 背 景 部 分 の 染 色 を 落 とします( 脱 色 ) クイックステインによる 染 色 方 法 倍 希 釈 の Fast Blast DNA 染 色 液 を 用 意 し ゲルの 入 った 染 色 トレイに 約 60ml 入 れます 染 色 トレイを 食 品 保 存 用 ラップで 覆 い 2~3 分 置 いて 染 色 します 2. Fast Blast DNA 染 色 液 をバイアルあるいは 適 切 な 容 器 に 入 れ およそ 100mlの 精 製 水 を 注 い でゲルをすすぎます これを 2~3 回 繰 り 返 します mlの 精 製 水 を 容 器 に 注 ぎ 1 分 間 置 きます この 時 振 盪 器 などで 容 器 を 軽 く 揺 らしてやる と ゲルから 余 分 な 染 色 剤 が 抜 けやすくなります 使 用 した 精 製 水 は 廃 液 用 ビーカーに 注 ぎ 捨 てます これを 7~10 回 繰 り 返 します 4. 1~2 時 間 放 置 します 23

27 Lesson 4 ゲルの 乾 燥 と DNA パターンの 分 析 ゲルを 乾 燥 させる 前 に 記 録 をとっておくとよいでしょう ゲルが 乾 燥 する 前 に 結 果 を 得 るためには 紙 ま たは 透 明 なシートにゲルの 輪 郭 サンプルウェル および DNA バンドを 書 き 写 すか あるいはカメラで 写 真 を 撮 影 するなどの 方 法 があります 目 的 時 間 材 料 操 作 手 順 長 期 保 存 のためにアガロースゲルを 乾 燥 させる 10 分 脱 色 用 の 水 ゲルサポートフィルム ゲルをトレイスするための 透 明 フィルム( 食 品 保 存 用 ラップなど) この 実 習 では 試 薬 を 準 備 する 必 要 はありません < 実 験 記 録 を 長 期 保 存 するためのアガロースゲル 乾 燥 > 注 意 :アガロースゲルを 乾 燥 させるためには バイオ ラッド 社 製 高 強 度 分 析 用 アガロースを 使 用 する 必 要 があります 脱 色 したゲルを 乾 燥 させる 方 法 は 2 通 りあります 方 法 1 この 方 法 をまずお 勧 めしますが バイオ ラッド 社 製 のゲルサポートフィルム( )を 使 用 する 必 要 があります 脱 色 したアガロースゲルを 染 色 トレイから 取 り 出 します ゲルサポートフィルムにゲルを 直 接 載 せます ゲルをフィルム 中 央 に 置 き 完 全 に 乾 燥 するまで 空 気 乾 燥 します ゲルは 乾 燥 すると フィルムに 結 合 し 縮 みません サポートフィルム 上 に 室 温 で 静 置 しておけば 2~3 日 後 には 完 全 に 乾 燥 するでしょう その 結 果 平 坦 かつ 透 明 で 耐 久 性 のある 実 験 記 録 ができるでしょう ゲルサポートフィルム 方 法 2 ゲルを 染 色 脱 色 した 後 プラスチック 染 色 トレイにゲルを 放 置 します 2~3 日 空 気 乾 燥 させます ゲルは 乾 燥 するとかなり 縮 みますが 比 率 は 変 わりません 静 かに 染 色 トレイ 上 に 放 置 すれば ゲ ルは 比 較 的 平 坦 なままですが 乾 燥 するにつれてしわができるでしょう 24

28 このキットを 使 用 するにあたってのポイント このセクションでは 技 術 的 に 難 しいこと あるいは 実 験 の 結 果 と 理 解 に 非 常 に 重 要 な 意 味 を 持 つ 手 順 について 述 べてあります また 付 録 C に PCRや 無 菌 操 作 の 基 礎 的 な 注 意 事 項 がありますので 参 照 くだ さい 先 生 は 生 徒 に 対 して これらのポイントに 充 分 注 意 するよう 指 導 してください そして できれば 生 徒 がその 手 技 を 行 なう 前 に デモンストレイションをしてください 生 徒 マニュアルとクイックガイドには 各 Lesson で 用 いる 全 ての 実 験 ステップと 手 法 に 関 する 細 かい 記 述 と 挿 絵 が 含 まれています 実 習 で 使 う 実 験 手 順 の 質 問 に 関 しては そちらを 参 照 下 さい Lesson 1 サンプルの 調 製 頬 細 胞 のサンプルを 処 理 して PCRの 鋳 型 として 用 いるゲノム DNA を 用 意 します <インスタジーンマトリックスの 機 能 は?> ピペット 中 の 頬 細 胞 は 200 l のインスタジーンマトリックスが 入 ったマイクロチューブ 中 に 移 されます こ の 粒 子 マトリックスは 陰 性 に 荷 電 した 微 小 な 粒 で 金 属 イオンをキレート( 吸 着 )します それは 酵 素 反 応 の 触 媒 あるいは 補 助 因 子 として 必 要 なマグネシウムイオンなどの 金 属 イオンをトラップするように 働 きます そして あなたの 頬 細 胞 は 加 熱 により 融 解 あるいは 破 壊 され 細 胞 の 内 容 物 は 放 出 されます その 中 には 頬 細 胞 のリソソーム 中 に 存 在 していた 酵 素 も 含 みます リソソームは 細 胞 質 に 存 在 する 袋 のようなもので ウイルスの DNA を 分 解 するために 用 いられる DNA 分 解 酵 素 のような 強 力 な 酵 素 を 含 んでいます 細 胞 を 破 壊 すると この DNA 分 解 酵 素 は 我 々がこれから 実 験 で 用 いる DNA を 分 解 する 可 能 性 があります しか し キレート 剤 の 存 在 下 で 細 胞 を 溶 解 すると 補 助 因 子 は 吸 着 され 酵 素 に 結 合 できません これにより 抽 出 した DNA の 酵 素 的 分 解 はほぼ 完 全 に 阻 害 され PCR 反 応 で 鋳 型 として 使 う DNA が 無 傷 の 状 態 で 得 られるのです インスタジーンマトリックスのビーズはすぐに 溶 液 の 下 に 沈 みます ですから マトリックスの 入 ったバイア ルは 各 々の 生 徒 の 実 験 台 に 分 注 する 前 と そこから 各 々の 生 徒 が 自 分 の 分 を 取 り 出 すときには よくか き 混 ぜておく 必 要 があります もし DNA サンプルを 翌 日 に PCR にかけないのであれば 一 週 間 はインスタジーンマトリックスと 一 緒 に 冷 蔵 庫 で 保 存 することができます 長 期 間 の 保 存 には DNA の 分 解 を 防 ぐために 冷 凍 庫 で 保 存 すると よいでしょう サンプルを PCR にかける 前 に ビーズは 遠 心 分 離 によってペレットにして 取 り 除 かなければ なりません しかし サンプルの 処 理 は24 時 間 以 内 にする 事 をお 奨 めします 処 理 のコツについては 次 の ステップを 参 照 してください < 保 温 : 各 々の 保 温 ステップの 意 味 は?> 56 で 行 うプレヒート( 前 加 熱 )ステップには 2 つの 機 能 があります 1. 細 胞 浮 遊 液 を 熱 することで 頬 細 胞 同 士 を 接 着 している 結 合 組 織 の 分 解 を 助 けます 組 織 を 壊 す ことで 後 の 100 のステップの 時 に 細 胞 が 融 けやすくなります で 加 熱 することで 頬 細 胞 浮 遊 液 に 通 常 存 在 する DNA 分 解 酵 素 を 不 活 化 します DNA 分 解 酵 素 によりゲノム DNA が 分 解 されると PCR 反 応 を 妨 害 される 可 能 性 があります 頬 細 胞 液 を 100 に 熱 することで 頬 細 胞 の 膜 は 破 壊 され ゲノム DNA を 含 む 細 胞 の 内 容 物 が 放 出 され ます PCR 反 応 での 鋳 型 DNA として 用 いるのはこのゲノム DNA です 25

29 < 抽 出 した DNA の 取 り 扱 いについて> インスタジーンを 用 いて 抽 出 した DNA サンプルには 生 徒 や 生 徒 達 個 々の 個 人 情 報 が 詰 まっていま す 文 部 科 学 省 厚 生 労 働 省 経 済 産 業 省 ヒトゲノム 遺 伝 子 解 析 研 究 に 関 する 倫 理 指 針 を 設 け ヒト 由 来 DNA を 用 いる 研 究 現 場 あるいは 遺 伝 子 診 断 や 遺 伝 子 治 療 の 場 で 守 られるべき 倫 理 指 針 としてい ます ここには このキットを 用 いた 授 業 のような 教 育 目 的 のヒト DNA は 対 象 外 となっていますが 研 究 においてはこのような 指 針 が 存 在 すること 個 人 情 報 を 扱 う 倫 理 問 題 などにも 充 分 留 意 した 上 で 授 業 を 行 ってください このような 事 柄 をふまえ 特 に PCR テンプレートとして 使 用 し 残 ったゲノム DNA は 分 解 及 び 変 性 させてから 廃 棄 してください 今 回 の 実 験 では 酸 (0.5N HCl 取 扱 いには 十 分 気 をつけてくだ さい)を 等 量 加 えます また アガロース 電 気 泳 動 に 用 い 残 った PCR 産 物 も 同 様 に 処 理 することが 望 ま しくなります <PCR の 前 にインスタジーンマトリックスを 除 く 必 要 はありますか?> 溶 解 液 を PCR 用 に 分 注 する 前 に インスタジーンマトリックスをチューブの 下 に 完 全 に 沈 澱 させることは 非 常 に 重 要 なことです マトリックス 中 のビーズは Taq ポリメラーゼの 機 能 に 必 須 であるマグネシウムのよ うな 二 価 の 陽 イオンと 結 合 します それゆえ もし 少 しでもビーズが PCR 反 応 中 に 混 入 していると 反 応 は 阻 害 されるでしょう このインスタジーンマトリックスは 溶 解 液 を 遠 心 分 離 器 (6000 g 5 分 )にかけること で 取 り 除 くことができます ビーズ 上 の(ゲノムDNAを 含 む) 上 清 のうち20 lをpcr 反 応 の 為 に 取 り 出 します インスタジーンマトリッ クスに 触 れる 事 なく 上 清 を 取 り 除 き 蓋 なしのアダプター 上 においた PCR チューブに 移 してください 上 清 鋳 型 DNA マトリックス Lesson 2 ゲノム DNA サンプルの PCR による 増 幅 <マスターミックスとは 何 ですか?> マスターミックスはヌクレオチド(dNTP(dATP dttp dctp dgtp)) バッファー ポリメラーゼの 混 合 物 であり それらは PCR 反 応 に 必 須 の 要 素 なのです プライマーミックスには PCR でも 使 える 色 素 が 入 っ ています プライマーミックスは 実 習 の 直 前 にマスターミックスに 加 え PCR 反 応 溶 液 を 作 成 します そして 頬 細 胞 の 融 解 物 のはいった 溶 液 ( 鋳 型 DNA になる)を 20 l 同 量 の PCR 反 応 溶 液 に 加 える 事 で 40 l の PCR 反 応 に 必 要 なすべての 要 素 が 加 わったことになります この 2 PCR 反 応 溶 液 は 100mM KCl 20mM Tris-HCl 4mM MgCl 2 2mM dntp そしてプライマーが 1 M ずつ 入 っています(pH 8.3) プライ マーとマスターミックスを 混 ぜた 後 の PCR チューブに 存 在 する すべての 反 応 物 の 1 あるいは 作 業 濃 度 は 最 終 的 には 上 記 の 半 分 になります 増 幅 の 後 サンブルは 直 接 ゲルに 流 すことができます 注 意 :マスターミックスとプライマーがミックスされた 後 は 溶 液 は 氷 上 におき 15~30 分 以 内 に 使 用 してく 26

30 ださい これらの 試 薬 は 温 度 に 非 常 に 敏 感 です <プライマーミックスはなぜ 黄 色 なのですか?> プライマーミックスの 溶 液 にはおおよそ 50bp の DNA と 同 じ 移 動 度 を 有 するテトラジンと 呼 ばれる 黄 色 い 色 素 を 含 んでいます プライマーミックスを 加 えると PCR 反 応 溶 液 が 黄 色 くなりますが これはサンプル を 見 やすくし 生 徒 が 扱 いやすくするためです この 色 素 は PCR 反 応 には 影 響 を 及 ぼしません <PCR による 増 幅 > PCR による 増 幅 はサーマルサイクラー 中 で 行 なわれ 遺 伝 子 複 製 に 必 要 な 加 熱 冷 却 サイクルが 行 な われます この 実 習 では 3 サイクル PCR を 行 ないます;11 分 間 94 の 変 性 ステップ 21 分 間 60 の アニーリングステップ 32 分 間 72 の 伸 長 ステップ これらのサイクルは PCR 増 幅 中 に 40 回 繰 り 返 され ます 変 性 ステップでは プライマーが 結 合 出 来 るようにするために 二 本 の 鋳 型 DNA は1 本 鎖 になりま す アニーリングステップでは PCR プライマーは 鋳 型 DNA を 認 識 し そこに 結 合 します 一 度 プライマー が 結 合 すると 伸 長 ステップ 中 に Taq ポリメラーゼはプライマーを 伸 長 し DNA を 複 製 します PCR チューブは 非 常 に 小 さいので 扱 いは 慎 重 にお 願 いします サーマルサイクラーにチューブを 入 れる 前 に チューブのフタを 完 全 に 締 めてください もしチューブが 完 全 に 閉 じられていないと 反 応 液 が 蒸 発 し PCR 反 応 が 阻 害 されます 実 験 を 2 回 に 分 けて 行 う 場 合 には PCR 反 応 溶 液 は PCR サイクルの 直 前 に 調 製 するようにしましょう これは PCR 反 応 溶 液 とゲノム DNA を 長 時 間 放 置 すると 増 幅 効 率 が 低 下 するからです Lesson 3 ゲル 電 気 泳 動 <どのくらいの PCR 反 応 液 をゲルに 流 せばよいのか?> 増 幅 させたサンプルを 電 気 泳 動 にかける 前 に 生 徒 には 10 l の 5 ORANGE G ローディングダイを 各 々の PCR 用 チューブに 加 えさせます ローディングダイはグリセロールを 含 んでおり これによりサンプ ルの 密 度 が 増 大 して DNA サンプルがアガロースゲルのウェルの 底 部 にたまるようになっています さら に ローディングダイには Orange G と 呼 ばれる 色 素 が 含 まれており これは 50bp の DNA と 同 じ 速 度 で 陽 極 側 に 向 かって 移 動 します 目 ではっきり 見 えるようにするためには 20 l のポジティブコントロールサンプル 10 l の EZ Load TM DNA Mass Ruler 20 l の 生 徒 用 サンプルを 流 す 必 要 があります レーン サンプル アプライ 量 1 モレキュラールーラー 10 l 2 ポジティブコントロール(+/+) 20 l 3 ポジティブコントロール(-/-) 20 l 4 ポジティブコントロール(+/-) 20 l 5 生 徒 1 20 l 6 生 徒 2 20 l 7 生 徒 3 20 l 8 生 徒 4 20 l 27

31 <ゲルの 染 色 > ゲルは 染 色 トレイ 中 で 一 つ 一 つ 染 色 することができますが 大 きい 染 色 皿 を 使 って 一 度 にたくさん 染 色 することもできます また 振 盪 機 などでゲルを 軽 く 振 ると 効 率 良 く 染 まります 染 色 液 に 入 れるために ゲ ルトレイからゲルをはずす 必 要 があります 非 金 属 製 のへらを 使 用 すると 容 易 に 外 れます サンプルウェ ルの 列 に 沿 ってゲルが 裂 ける 場 合 があるので サンプルウェルの 部 分 を 支 えるように 特 別 の 注 意 を 払 う 必 要 があります 染 色 方 法 には 一 晩 染 色 を 行 う 一 晩 オーバーナイトステインと 染 色 時 間 が1~2 時 間 のクイックステイン の2 種 類 があります 授 業 の 時 間 割 等 に 合 わせてお 選 びください ゲルを 完 全 に 覆 いきるまで 染 色 液 を 注 ぎます 食 品 保 存 用 ラップで 覆 い 乾 燥 を 防 ぎます ゲルはエチジウムブロマイドで 染 色 し UV 光 を 当 ててバンドを 検 出 すつことも 可 能 です(キットには 含 ま れていません) エチジウムブロマイドを 用 いるときは アガロース 中 に 0.05 g/ml のエチジウムブロマイド が 含 まれている 必 要 があります この 濃 度 のエチジウムブロマイドで 最 もきれいなコントラストをもったバン ドが 見 えます ただし エチジウムブロマイドは 発 ガン 性 物 質 ですので 取 扱 いに 注 意 ください 注 :Fast Blast 染 色 液 はエチジウムブロマイド 染 色 を 打 ち 消 してしまうので エチジウムブロマイド 染 色 は Fast Blast 染 色 の 前 に 行 なってください 28

32 Lesson 4 結 果 の 分 析 と 解 釈 <ゲルの 脱 色 > オーバーナイトステインの 場 合 一 晩 染 色 後 染 色 液 を 容 器 から 取 り 除 き およそ 100mlの 精 製 水 を 注 いでゲルをすすぎます クイックステインの 場 合 は 精 製 水 で 脱 色 する 必 要 があります はじめに 染 色 液 を 容 器 から 取 り 除 き およそ 100mlの 精 製 水 を 注 いでゲルをすすぎます これを 2~3 回 繰 り 返 します 次 に 100mlの 精 製 水 を 容 器 に 注 ぎ 1 分 間 おきます この 時 容 器 を 軽 く 揺 らしてやる と ゲルから 余 分 な 染 色 剤 が 抜 けやすくなります これを 7~10 回 繰 り 返 します その 後 1~2 時 間 の 脱 色 によってより 優 れたコントラストが 得 られるでしょう 乾 燥 するとバンドは 薄 くなるので 染 色 したゲルは 乾 燥 前 に 分 析 する 方 が 良 いでしょう バンドをはっき り 見 るには ゲルを 下 から 照 らします ゲルを 照 明 箱 の 上 におき バンドのパターンを 透 明 なシート 上 にマ ジックでトレイスします 結 果 を 分 析 したら ゲルを 乾 かしましょう < 余 分 なレーンを 除 く> ゲルの 幅 はゲルの 縮 み 方 に 影 響 を 与 えます 幅 が 狭 いゲルの 方 が 乾 燥 した 時 に 丸 まりません ですから 不 要 なレーンは 乾 燥 する 前 に 除 きましょう 29

33 結 果 の 解 釈 とトラブルシューティングガイド < 空 レーン あるいは 増 幅 されないサンプルはどうして 発 生 するのですか?> PCR 反 応 によって 生 徒 のサンプルが 増 幅 されない 理 由 は 幾 つか 考 えられます 1. インスタジーンマトリックスが 正 しく 分 配 されていない 各 々の 実 験 台 には 先 生 が 分 注 したインスタジーンマトリックスのチューブが 割 り 当 てられ それは 氷 上 にある 筈 です このマトリックスは ビーズを 均 等 にするために 一 回 の 分 注 の 度 にかき 混 ぜなけ ればなりません もしビーズが 生 徒 のマイクロチューブになかったら 二 価 イオンは ゲノム DNA 溶 液 中 から 取 り 除 かれず PCR 反 応 は 阻 害 されるでしょう 2. 頬 細 胞 の 量 が 足 りない 口 内 をすすいだ 1mlを 遠 心 した 後 ペレットが 小 さい(おおよそ 直 径 2mm 以 下 ) 場 合 には 再 度 1ml のすすいだ 溶 液 をマイクロチューブに 入 れて 遠 心 します 不 十 分 な 数 の 細 胞 しかインスタジーンマト リックスのチューブに 入 れられず 増 幅 はおこりません 3. 頬 細 胞 に 血 液 が 混 入 している 強 く 引 っかいてしまいますと 血 液 が 混 入 して PCR 反 応 を 阻 害 する 可 能 性 があります 4. PCR 反 応 液 にマトリックスが 混 入 している ビーズは 鋳 型 DNA の 調 製 には 必 須 ですが PCR 反 応 液 中 には 絶 対 にインスタジーンマトリックスは 含 まれていてはなりません 少 しでもビーズが PCR チューブ 中 にあると Taq ポリメラーゼに 必 要 な 塩 化 マグネシウムはビーズに 結 合 してしまい 増 幅 反 応 がうまく 進 みません 上 清 ( 鋳 型 DNAを 含 む) 鋳 型 DNA マトリックス PCR チューブ 5. 長 期 間 保 存 により DNA が 分 解 した インスタジーンマトリクスでの DNA 抽 出 後 の 保 存 が 鋳 型 となる DNA が 分 解 してしまい PCR 反 応 で 増 幅 しない 可 能 性 があります 6. サンプルにコンタミネーションが 起 こった ピペットチップの 先 端 を 触 ったり マイクロチューブを 開 けた 状 態 でしゃべったりすることで 手 の 汚 れ や 唾 がサンプルに 混 入 することがあります それによって DNA が 分 解 してしまう 可 能 性 が 考 えられま すので 操 作 の 際 には 充 分 に 注 意 を 払 ってください 30

34 <ヘテロザイゴスの 解 釈 > 1. 増 幅 中 の 競 合 反 応 : 小 さいバンド(641bp)と 大 きいバンド(941bp)が 競 合 するので ホモザイゴスの 増 幅 に 比 べるとヘテロザイゴスの 増 幅 はより 難 しくなります 小 さい 641bp のバンドは 941bp のバン ドより 効 率 よく 増 幅 されるので アガロースゲル 上 でヘテロザイゴスの 増 幅 産 物 をみると 小 さいバ ンドの 方 が 大 きいバンドより 濃 くみえます( 下 のゲルで 星 印 で 示 してあるバンドをみて 下 さい) その ため 上 のバンドが 弱 いヘテロザイゴスはしばしば(-/-)ホモザイゴスと 勘 違 いされる 事 がありま す ですから ヘテロザイゴス(+/-)とホモザイゴス(-/-)の 区 別 には 慎 重 なゲルのチェック が 必 要 です 代 わりに エチジウムブロマイドを 使 ったりスキャナーを 用 いることも 感 度 を 増 加 させ 見 づらいヘテロザイゴスのバンドも 簡 単 に 可 視 化 できるでしょう 2. ヘテロザイゴスでみられる 大 きなバンド: 検 体 がヘテロザイゴスの 場 合 1100~1700bp あたりを 流 れ る 大 きなバンドがみられることがあります( 下 のゲルで 矢 印 がついているもの) これらのバンドは 641bp と 941bp のバンドの 間 で 形 成 されたヘテロダイマーによるもので ゲル 上 での DNA バンドの 泳 動 速 度 を 遅 らせる 二 次 構 造 を 含 んでいます( 下 の 図 8 参 照 ) Alu 挿 入 配 列 (300bp) 641bp 941bp 図 8.941bp と 641bp バンドの 間 で 形 成 されるヘテロダイマー 31

35 3. プライマーダイマーの 形 成 : 一 部 の PCR 反 応 ではプライマーダイマー( 二 量 体 )が 出 来 るかもしれ ません プライマーダイマーはゲルの 下 にバンドとして 観 察 され 双 方 のプライマーの 分 子 量 を 足 した 大 きさに 相 当 します プライマー 二 量 体 は 増 幅 産 物 が 殆 どないか 全 く 存 在 しない 時 により 多 く なります ですから 鋳 型 がなかったり インスタジーンが 混 入 しているとき またはサーマルサイク ラーに 移 すずっと 前 にサンプルを 準 備 したりすると 発 生 しやすくなります 下 のゲルの 矢 印 はプライ マーダイマーの 生 成 を 示 しています 4. バンドが 弱 い:Fast Blast DNA 染 色 液 の 青 い 染 色 液 は 明 るい 室 内 光 にあたると 可 逆 的 に 発 色 が 減 弱 します 乾 燥 してから 3~5 日 後 にゲルを 観 察 すると バンドは 薄 くなっているかもしれません ですから ゲルは 暗 い 所 ( 箱 の 中 あるいはノートに 挟 む)において 数 時 間 後 に 観 察 すると 強 いバ ンドが 観 察 されるでしょう 最 も 便 利 なのは 実 験 台 でゲルを 3~5 日 乾 燥 させ ノートにテープでと めておき 翌 日 ゲルを 観 察 することです 32

36 クイックガイド Lesson 1 DNA テンプレートの 準 備 1. スクリューキャップのついたチューブを 用 意 し 自 分 のイニシャルをつけます マト リックスチューブの 中 身 を 充 分 に 混 合 し インスタジーンマトリックス 200 l をラベル したねじ 式 蓋 のついたチューブへ 入 れま す インスタジーンマトリックス %NaCl 水 溶 液 10mlを 口 に 含 み 30 秒 間 口 に 含 み くちゅくちゅとすすぎ 再 度 紙 コップに 液 を 戻 します 10 ml 3. マイクロチューブに 口 をすすいだ 液 を 1ml 入 れ 2 分 間 遠 心 します 約 50 l 程 度 溶 液 が 残 るようにチューブを 傾 けて 上 澄 みを 廃 液 入 れに 捨 て ピペッティングあるいは ボルテックスで 良 く 懸 濁 します このとき ペレットがおおよそ 直 径 2mmに 満 たない 場 合 は 再 度 チューブに 溶 液 を 1ml 入 れ 遠 心 します 4. 懸 濁 した 細 胞 液 を 20 l とり インスタジー ンマトリックスに 加 えます ピペッティング で 良 く 懸 濁 します 最 高 速 度 で 2 分 間 遠 心 遠 心 分 離 20 l インスタジーンマトリックス 33

37 5. チューブにしっかりとふたをし それを チューブラックに 入 れて 56 の 恒 温 槽 で 10 分 間 静 置 します 半 分 (5 分 )までき たところで チューブを 軽 くタッピングして 内 容 物 を 軽 くかき 混 ぜて 下 さい そしてま た 恒 温 槽 に 戻 して 残 りの 5 分 間 保 温 してく ださい 2 水 槽 分 恒 温 槽 56 C10 分 6. チューブを 取 り 出 し 軽 くタッピングして 内 容 物 をかき 混 ぜ チューブを 100 の 恒 温 槽 で 6 分 間 加 熱 します 恒 温 槽 100 C 6 分 7. チューブを 恒 温 槽 から 取 り 出 し 軽 くタッ ピングしてかき 混 ぜてください 次 に 5 分 間 遠 心 分 離 にかけ マトリックスを 沈 澱 さ せてください 遠 心 分 離 8. 続 けて Lesson 2 に 進 まない 場 合 チュー ブは 冷 蔵 庫 に 保 存 しておきましょう 注 意 :Lesson 2 はLesson 1の 実 験 後 できるだ け 早 く(できれば 24 時 間 以 内 ) 行 ってくださ い 34

38 Lesson 2 PCR による 増 幅 注 意 :Leeson 2 は Lesson 1 の 実 験 後 できれば 24 時 間 以 内 に 行 ってください 1. PCR チューブと 蓋 なしアダプターにイニ シャルを 書 き PCR チューブをアダプ ターにおいて 二 つを 発 泡 スチロールの ラックに 入 れてください 自 分 の 頬 細 胞 由 来 の 鋳 型 DNA の 入 ったスクリュー キャップチューブをチューブ 立 てに 入 れ てください PCRチューブ アダプター l の DNA 鋳 型 溶 液 ( 上 清 )をスク リューキャップチューブから PCR チューブの 下 にいれます マトッリクス のビーズを 絶 対 に PCR チューブに 入 れないようにしてください PCR 反 応 は マトリックスによって 阻 害 されます 残 った 鋳 型 DNA には 200 l の 0.5N HCl を 加 え よく 混 ぜて 廃 棄 してくださ い 鋳 型 DNA 上 清 マトリックス 3. マスターミックスのチューブを 氷 上 に おいて 20 l のマスターミックスを PCR チューブに 入 れます PCR チューブを 締 めてください マスターミックス 4. PCR チューブをサーマルサイクラーに いれます 40 サイクルの PCR 増 幅 反 応 のプログラムをセットし スタートさせ ます 35

39 Lesson 3 PCR 産 物 の 電 気 泳 動 1. PCR チューブをサーマルサイクラーから 取 り 出 し ローディングダイを 10 l ずつ 加 え タッピングしてよく 混 ぜます 遠 心 分 離 機 で 蓋 やチューブ 壁 面 についた 液 体 を 底 に 落 とすために PCR チューブ をアダプターにいれ かるく 遠 心 してくだ さい(~3 秒 2000 g) 2. ゲルを 冷 蔵 庫 から 取 り 出 し 1 TAEバッ ファーで 泳 動 槽 を 満 たしゲルを 覆 います ( 約 275~300ml のバッファーが 必 要 で す) 3. アガロースゲルのウェルが 黒 い(-) 電 極 の 近 くにあり ゲルの 下 端 が 赤 い(+) 極 に 近 くなっている 事 を 確 認 してください 4. 各 々のサンプルに 別 々のチップを 用 いて 8 つのウェルに 以 下 の 順 番 に 入 れます レーン サンプル 流 量 1 MMR 10 l 2 コントロール(+/+) 20 l 3 コントロール(-/-) 20 l 4 コントロール(+/-) 20 l 5 生 徒 1 20 l 6 生 徒 2 20 l 7 生 徒 3 20 l 8 生 徒 4 20 l 36

40 5. 注 意 深 く 電 気 泳 動 槽 に 蓋 をします コー ドを 電 源 ユニットにつなぎます 赤 は 赤 に 黒 は 黒 につなぎます 6. パワーサプライの 電 源 を 入 れ 80V で 約 35 分 間 泳 動 します 泳 動 初 期 と 終 了 時 の 電 流 値 を 控 えておきます 電 圧 値 が 80V でない 場 合 ローディングダイがゲ ルの3 分 の2 程 度 まで 流 れたところで 泳 動 を 止 めてください 7. 電 気 泳 動 が 終 わった 後 パワーサプライ の 電 源 を 切 り 蓋 を 泳 動 槽 から 外 して 下 さい ゲルをゲルトレイごと 泳 動 槽 から 取 り 出 してください ゲルは 滑 べりやすいの で 充 分 注 意 してください 両 手 の 親 指 を 使 ってゲルトレイからゲルを 押 し 出 し 注 意 深 くプラスチックの 染 色 トレイに 落 して 下 さい 8. 約 60ml の Fast Blast DNA 染 色 液 をトレ イに 入 れてください 染 色 トレイを 食 品 保 存 用 ラップで 覆 います オーバーナイト ステインの 場 合 は 1 晩 染 色 します (ク イックステインの 方 法 は p.57 を 参 照 くだ さい ) 9. 残 った PCR 産 物 は 20 l の 0.5N HCl を 加 え 混 ぜた 後 に 廃 棄 します 37

41 Lesson 4 ゲルの 分 析 1. Fast BlastDNA 染 色 液 を 瓶 またはビー カーに 注 ぎ 空 け 100ml の 精 製 水 に 浸 します (クイックステインの 場 合 は 必 要 ありません) 2. カッターナイフを 用 いて いらないレー ンを 切 り 取 って 下 さい ゲルをゲルサ ポートフィルム 上 あるいは 実 験 台 上 の 染 色 トレイで 乾 燥 させてください 3. 染 色 トレイ 上 あるいはゲルサポートフィ ルム 上 にゲルを 置 き 空 気 乾 燥 するだ けで 長 期 保 存 が 可 能 です ゲルが 乾 燥 したら 実 験 ノートにテープで 止 めま す 4. 自 分 が Alu 配 列 に 対 してホモザイゴス かヘテロザイゴスか 先 生 も 含 めてみ なさんで 考 えてください 38

42 学 生 生 徒 用 テキスト はじめに- <PCR(ポリメラーゼ 連 鎖 反 応 )とは> 皆 さんがこれから 行 なう 手 法 は PCR 1 として 知 られています この 技 術 により マイクロチューブの 中 の 自 分 自 身 の DNA のある 特 定 の 配 列 を 増 幅 する 事 ができるようになりました この 特 定 の DNA 配 列 は 多 く の 人 の 遺 伝 子 に 存 在 しますが 全 ての 人 で 同 じではありません この 実 習 で 得 られるデータを 分 析 するこ とであなたのゲノム DNA がこの 配 列 をもっているかどうかが 分 かるのです DNA から 成 り 立 つゲノムは 我 々の 遺 伝 的 な 暗 号 です これは 固 定 された 情 報 であり 我 々の 見 た 目 や 行 動 等 の 多 くをコントロールする 青 写 真 なのです 分 子 生 物 学 は 遺 伝 子 と DNA から RNA そしてタンパ ク 質 への 遺 伝 情 報 の 流 れ あるいは 世 代 から 世 代 への 遺 伝 情 報 の 伝 達 をコントロールする 分 子 メカニズ ムを 研 究 する 学 問 です バイオテクノロジーはこの 知 識 を 用 いて 生 物 ( 微 生 物 植 物 動 物 )の DNA をうま く 使 うことで 人 類 の 諸 問 題 を 解 決 する 手 助 けをする 技 術 です 生 物 学 を 分 子 的 な 枠 組 で 考 えてみると DNA RNA そしてタンパク 質 は 強 く 関 係 づけられています タ ンパク 質 と 酵 素 は 究 極 的 には 生 命 が 生 きていくうえで 欠 かせない 役 割 を 果 たしているため 科 学 者 たち は 一 生 涯 を 費 やしてタンパク 質 を 研 究 し どの 様 にそれが 働 くかを 理 解 しようと 努 力 してきたのです そう することで 我 々は 病 気 や 身 体 的 障 害 を 治 し 予 防 し そして 克 服 すると 同 時 に どの 様 にして 生 命 は 存 在 し 広 がり そして 死 んでいくかを 正 しく 説 明 出 来 るようになると 信 じられていました しかし 単 に 酵 素 が どの 様 に 働 くかを 理 解 するだけでは それに 対 する 答 えは 得 られません 我 々はそれがどのように 生 まれ たかを 理 解 する 必 要 があるのです もし 一 つ 一 つの 酵 素 が 特 有 であるのなら 何 がこの 違 いをコントロー ルしているのか この 違 いを 既 定 する 青 写 真 は 何 なのか その 答 えはゲノム すなわち 遺 伝 暗 号 中 に 存 在 するのです そうなれば 色 々な 生 命 活 動 の 背 後 にある 複 雑 なメカニズムを 理 解 しようと 努 力 している 最 近 の 研 究 者 たちが タンパク 質 だけでなく 核 酸 も 研 究 することで 完 全 な 全 体 像 を 把 握 することが 出 来 ると 考 える 理 由 を 皆 さんにもお 分 かり 頂 けるでしょう 最 近 20 年 間 の 核 酸 に 関 連 する 技 術 のすさまじい 進 歩 により 研 究 者 は 生 物 学 において 核 酸 が 果 たす 役 割 を 研 究 する 手 段 を 得 ることができました それには 生 命 のもつ 最 も ミステリアスなパズルの 一 つ すなわち DNA が 細 胞 の 中 でどの 様 にタンパク 質 に 翻 訳 されるかをコント ロールするメカニズムを 理 解 しようとしてきた 多 くの 科 学 者 達 の 努 力 と 想 像 力 が 必 要 でした 実 験 を 始 める 前 に 以 下 の 質 問 に 答 えられるかどうか チェックしてください どのようにして DNA は 正 しく 世 代 から 次 世 代 へ 伝 えられるのか? どうして 遺 伝 病 は 特 定 の 人 にしか 起 こらないのか? どうやって 研 究 者 は 研 究 で 用 いる DNA を 得 るのか? DNA は 我 々の 起 源 に 関 して どの 様 な 情 報 を 与 えてくれるのか? DNA を 理 解 することは 何 の 役 に 立 つのか? 生 命 の 最 も 基 本 的 な 構 成 要 素 に 含 まれる 秘 密 を 我 々は 暴 いて 良 いものなのだろうか? 39

43 <PCR は 生 命 科 学 に 革 命 をもたらした> 1983 年 Cetus 社 の Kary Mullis 2 は 遺 伝 研 究 にとって 革 命 的 な 技 術 を 開 発 しました ポリメラーゼ 連 鎖 反 応 (Polymerase Chain Reaction PCR)と 名 付 けられたこの 技 術 は 発 明 後 5 年 以 内 で 分 子 生 物 学 を 学 際 的 な 研 究 分 野 に 変 えてしまったのです PCR が 開 発 される 前 は DNA の 研 究 に 用 いられる 分 子 生 物 学 的 手 法 は 高 度 の 技 術 を 要 したため 一 部 の 研 究 者 にしか 広 まっていませんでした PCR の 目 的 は 試 験 管 中 (in vitro)で DNA を 微 量 から 大 量 に 合 成 することです 技 術 的 には 目 的 と する DNA 配 列 すなわち 遺 伝 子 を 決 められた 方 法 により 酵 素 で 増 幅 することを 意 味 します この 鋳 型 は 二 本 鎖 の DNA であればゲノム DNA でも 何 でも 構 いません 研 究 者 は 一 滴 の 血 液 一 つの 毛 包 あるいは 頬 の 細 胞 から 微 量 の DNA を 抽 出 し 研 究 するのに 充 分 な 量 にまで 増 幅 する 事 ができます 理 論 的 には 一 つの 鋳 型 があれば 数 百 万 個 の DNA 分 子 を 複 製 することができるのです PCR が 開 発 される 前 は この ような 事 は 不 可 能 でした 研 究 者 が 調 べたい 操 作 したい DNA 配 列 を 正 確 に 増 幅 出 来 るということが PCR の 本 当 の 強 みなのです PCR は 遺 伝 子 地 図 作 成 クローニング DNA 配 列 決 定 そして 遺 伝 子 検 知 という 4 つの 主 たるバイオ テクノロジーの 分 野 に 影 響 を 及 ぼしました PCRは 遺 伝 病 を 起 しうる 特 異 的 な 遺 伝 子 変 異 を 見 つける 医 学 的 な 診 断 法 として 3 或 いは 犯 罪 捜 査 や 裁 判 において 容 疑 者 を 分 子 レベルで 同 定 するためにも 用 いられ ていますし 4 ヒトゲノムの 配 列 決 定 においても 重 要 な 技 術 です 5 PCR が 開 発 される 前 は 分 子 生 物 学 を 治 療 学 法 医 学 薬 学 農 学 あるいは 医 学 的 診 断 でもちいることは 技 術 的 も 経 済 的 にも 難 しいものでした PCR 技 術 の 発 達 は 分 子 生 物 学 を 扱 いづらい 科 学 から バイオテクノロジーにおいて 最 も 扱 いやすく 幅 広 く 用 いられる 分 野 へと 変 えたのです さあ これから 自 分 の DNA を 抽 出 しましょう なお 今 回 の 実 験 で 増 幅 する DNAは 皆 さんの 病 気 や 身 体 的 特 徴 等 に 関 わる 部 分 ではありません (51 52ページ 参 照 ) また 実 際 にヒトゲノムの 遺 伝 子 解 析 研 究 や 遺 伝 子 診 断 遺 伝 子 治 療 等 の 現 場 では 生 命 倫 理 問 題 に 気 を 配 って 進 められています 文 部 科 学 省 厚 生 労 働 省 経 済 産 業 省 が 定 めている ヒトゲノム 遺 伝 子 解 析 研 究 に 関 する 倫 理 指 針 には ヒトゲノムを 上 記 のような 目 的 で 取 扱 う 際 の 取 り 決 めが 書 かれています 40

44 Lesson 1 DNA の 抽 出 と 鋳 型 DNA の 調 製 PCR で 用 いる DNA は 自 分 の 細 胞 から DNA を 抽 出 する 事 で 得 られます 興 味 深 いことに DNA はミイ ラや 化 石 になった 恐 竜 の 骨 からも 抽 出 できるのです 今 回 の 実 験 では 頬 の 中 の 上 皮 細 胞 からDNAを 抽 出 します そのためには 0.9%NaCl 水 溶 液 で 口 内 をすすぐ 事 により 細 胞 をはがし 取 り 遠 心 する 事 で 集 めます そして 皆 さんは 煮 沸 する 事 で 細 胞 を 破 壊 し 中 に 含 まれる DNA を 遊 離 させます PCR 用 の 純 粋 な DNA を 得 るには 以 下 の 手 法 を 使 用 します ピペット 中 の 頬 細 胞 は 200 l のインスタジーンマトリックスが 入 ったマイクロチューブ 中 に 移 されます こ の 粒 子 マトリックスは 陰 性 に 荷 電 した 微 小 な 粒 で 金 属 イオンをキレート( 吸 着 )します それは 酵 素 反 応 の 触 媒 あるいは 補 助 因 子 として 必 要 なマグネシウムイオンなどの 金 属 イオンをトラップするように 働 きます そして あなたの 頬 細 胞 は 加 熱 により 融 解 あるいは 破 壊 され 細 胞 の 内 容 物 は 放 出 されます その 中 には 頬 細 胞 のリソソーム 中 に 存 在 していた 酵 素 も 含 みます リソソームは 細 胞 質 に 存 在 する 袋 のようなもので ウイルスの DNA を 分 解 するために 用 いられる DNA 分 解 酵 素 のような 強 力 な 酵 素 を 含 んでいます 細 胞 を 破 壊 すると この DNA 分 解 酵 素 は 我 々がこれから 実 験 で 用 いる DNA を 分 解 する 可 能 性 があります しか し キレート 剤 の 存 在 下 で 細 胞 を 溶 解 すると 補 助 因 子 は 吸 着 され 酵 素 に 結 合 できません これにより 抽 出 した DNA の 酵 素 的 分 解 はほぼ 完 全 に 阻 害 され PCR 反 応 で 鋳 型 として 使 う DNA が 無 傷 の 状 態 で 得 られるのです 単 離 した 頬 細 胞 は 始 めインスタジーンマトリックス 中 で 懸 濁 した 後 56 で 10 分 間 加 熱 します この 前 加 熱 により 細 胞 膜 は 柔 らかくなり 細 胞 塊 はバラバラになります 温 度 を 上 げる 事 で 鋳 型 DNA を 消 化 する DNA 分 解 酵 素 のような 酵 素 は 不 活 化 されます この 10 分 間 の 保 温 の 後 細 胞 は 100 の 恒 温 槽 で 6 分 間 加 熱 されます この 煮 沸 によって 細 胞 は 破 壊 され 細 胞 核 から DNA は 遊 離 します こうして 抽 出 されたゲノム DNA は PCR 増 幅 の 鋳 型 として 用 いる 事 ができます 41

45 Lesson 1 実 験 注 意 :Lesson 1 は Lesson 2 の 直 前 に 行 ってください < 使 用 する 試 薬 器 具 の 一 覧 > 実 験 を 始 める 前 に 次 のリストにある 試 薬 や 器 具 等 がそろっているかどうか 確 認 してください 生 徒 用 実 験 台 机 当 たりの 数 ( ) インスタジーンマトリクス 1 スクリューキャップ 付 チューブ 8 マイクロチューブラック 2 P-20 マイクロピペット 1 P-200 マイクロピペット 1 P-1000 マイクロピペット 1 (P-1000 マイクロピペットがなければ 4 ) ディスポーザブルピペット 紙 コップ 4 0.9%NaCl 水 溶 液 10ml/1 人 廃 液 用 容 器 1 先 生 の 実 験 台 P-200 マイクロピペット 1~8 ピペットチップ(フィルタータイプ) 20~200 l 1 箱 ピペットチップ(フィルタータイプ) 100~1000 l 1 箱 恒 温 槽 ( ) 1 遠 心 分 離 機 1 42

46 < 操 作 手 順 > 1. グループの 一 人 は スクリューキャップチューブに 自 分 のイニシャルを 書 いてください 次 に インスタ ジーン とラベルされたチューブを 取 り 自 分 の 人 差 し 指 でかるく 弾 くか ボルテックスにかけて チューブの 内 容 物 を 充 分 混 合 してください(ビーズは 絶 対 に 均 一 に 混 ざっていなければなりません そうしないと 以 降 のステップがうまくいかなくなります) そしてインスタジーンマトリックスを 200 l スク リューキャップチューブに 分 注 してください チューブの 蓋 と 横 にはイニシャルを 書 いてください ス テップ 2 を 始 める 前 に 必 ず 手 を 洗 ってください %NaCl 水 溶 液 10mlを 口 に 含 み 30 秒 間 口 に 含 み くちゅくちゅとすすぎ 再 度 紙 コップに 液 を 戻 します 口 の 中 に 残 っている 食 べ 物 が 気 になる 場 合 は 水 で 軽 くすすいでから 行 なっても 結 構 です 10 ml 2. マイクロチューブに 口 をすすいだ 液 を 1ml 入 れ 2 分 間 遠 心 します 約 50 l 程 度 溶 液 が 残 るように チューブを 傾 けて 上 澄 みを 廃 液 入 れに 捨 て ピペッティングあるいはボルテックスで 良 く 懸 濁 します こ のとき ペレットがおおよそ 直 径 2mmに 満 たない 場 合 は 再 度 チューブに 溶 液 を 1ml 入 れ 遠 心 しま す 最 高 速 度 で 2 分 間 遠 心 4. 懸 濁 した 細 胞 液 を 20 l とり インスタジーンマトリックスに 加 えます ピペッティングで 良 く 懸 濁 しま す 遠 心 分 離 43

47 5. チューブの 蓋 をしっかりと 閉 め チューブラックに 置 いて 下 さい グループ 全 員 の 準 備 ができたとこ ろで チューブラックごとチューブを 56 の 恒 温 槽 に 10 分 間 浮 かべてください 5 分 後 チューブを 取 り 出 し 何 回 かチューブをタッピングして 中 身 を 混 和 し 恒 温 槽 に 再 び 戻 して もう 5 分 静 置 してく ださい 恒 温 槽 56 C 10 分 6. 恒 温 槽 からチューブを 除 去 し 何 回 かチューブをタッピングして 混 和 してください その 後 チュー ブをチューブラックごと 100 の 恒 温 槽 に 6 分 間 浮 かべてください このとき やけどには 充 分 注 意 してください 恒 温 槽 100 C 6 分 7. 6 分 後 チューブを 100 の 恒 温 槽 から 出 して サンプルを 懸 濁 するために 何 回 かタッピングして 下 さい 遠 心 分 離 機 に 4 つのサンプルをバランスがトレイるようにおいて 下 さい 5 分 間 遠 心 分 離 (6000 g)にかけて マトリックスを 沈 澱 させてください 遠 心 分 離 44

48 Lesson 1 質 問 で 煮 沸 する 前 に 頬 細 胞 の 溶 液 中 の 金 属 イオンを 吸 着 させるのはなぜ 必 要 なのですか? もしインスタジーンマトリックスを 入 れない 場 合 どうなるのでしょうか? 2. 頬 から 細 胞 を 取 りましたが PCR を 行 なうのになぜ 細 胞 が 必 要 なのでしょうか? 3. 細 胞 から DNA を 遊 離 させるには 細 胞 の 構 造 の 中 で どこを 破 壊 させる 必 要 がありますか? 45

49 Lesson 2 PCR による 増 幅 ヒトゲノム 中 にはおよそ 3 万 個 の 遺 伝 子 が 存 在 することが つい 最 近 分 かりました PCR が 素 晴 らしいの は 完 全 なゲノムから 特 定 の DNA 断 片 (あるいは 遺 伝 子 )に 狙 いをつけて 増 幅 する 事 が 出 来 ることです PCR による DNA の 増 幅 の 方 法 は 単 純 に 試 薬 を 混 ぜるだけです DNA のある 部 分 を 増 幅 するには 以 下 のようなものが 反 応 液 に 必 要 です 1. 無 傷 の 鋳 型 DNA 増 幅 したい DNA 配 列 を 含 んだもの 2. デオキシヌクレオチド 塩 基 (A T G C) DNA の 原 料 3. DNA ポリメラーゼ ヌクレオチドから 新 しい DNA 鎖 を 組 み 立 てる 酵 素 4. マグネシウムイオン DNA ポリメラーゼが DNA 鎖 を 合 成 するのに 必 要 な 補 助 因 子 ( 触 媒 ) 5. オリゴヌクレオチドプライマー 鋳 型 と 相 補 的 な 配 列 をもつ 短 い DNA 鎖 DNA ポリメラーゼの 複 製 開 始 地 点 になる 6. バッファー PCR に 適 したイオン 濃 度 と ph を 整 える この 実 験 で 用 いる 鋳 型 DNA はあなたの 頬 細 胞 から 抽 出 したゲノム DNA です もし 他 の 試 薬 が 正 しい 条 件 下 で 混 合 されれば もとの 二 本 鎖 の 鋳 型 DNA の 複 製 物 が 合 成 されます すなわち 鋳 型 の 数 が 倍 にな るわけです このサイクルが 繰 り 返 される 度 に 合 成 産 物 からは 新 しい DNA が 合 成 され 鋳 型 DNA 鎖 の 数 は 倍 々で 増 えていきます そして 20 サイクルの 後 は 個 の 複 製 産 物 が 存 在 します PCR は 細 胞 が DNA を 複 製 するのと 同 じ 遺 伝 学 における 基 本 原 理 を 用 いています 1. 相 補 的 な DNA 鎖 の 接 着 (ハイブリダイゼーション) 2. DNA 鎖 は DNA ポリメラーゼによって 合 成 される このキットの 2 つの DNA プライマーは ゲノム 中 のある DNA 配 列 を 挟 むようにデザインされており そう して DNA ポリメラーゼに 複 製 開 始 地 点 を 知 らせ 標 的 DNA の 複 製 を 開 始 させるのです 相 補 的 な DNA 鎖 のハイブリダイゼーションは 二 つの 異 なるプライマーが 鋳 型 DNA 分 子 上 の 各 々の 相 補 的 な 塩 基 配 列 にアニール( 接 着 ) すなわちハイブリダイズする 時 に 起 こります このプライマーは 二 つの 短 い 一 本 鎖 DNA 分 子 (23bp)であり 一 つは 鋳 型 DNAの5'-3' 鎖 の 一 部 分 に もう 一 つは 3'-5' 鎖 の 一 部 分 に 相 補 的 です これらのプライマーは 別 々の 鋳 型 DNA 鎖 に 結 合 し DNA 複 製 の 開 始 地 点 を 提 供 します Taq DNA ポリメラーゼといわれる 酵 素 はアニールしたプライマーを 順 方 向 に 伸 長 し 相 補 的 な DNA 鎖 を 合 成 します こうして Taq は 鋳 型 DNA 鎖 を 複 製 します このポリメラーゼは 熱 耐 性 バクテリア(Thermus aqualicus)から 単 離 されたもので もともとはイエローストーン 国 立 公 園 の 温 泉 にいたものです 6 そのため このバクテリアの 酵 素 は PCR で 用 いる 94 という 高 熱 にも 堪 えるよう 進 化 しているのです 46

50 <PCR ステップバイステップ> PCR による 増 幅 は 3 つのステップから 成 り 立 ちます: 変 性 ステップ アニーリングステップ 伸 長 ステップ ( 図 9 参 照 ) 変 性 の 間 反 応 液 は 94 で 1 分 間 加 熱 され 2 本 鎖 の 鋳 型 DNA は 2 つの 1 本 鎖 の 鋳 型 DNA に 分 離 します PCR 増 幅 においては 鋳 型 DNA はポリメラーゼが 複 製 反 応 をする 前 に 分 離 していな ければなりません DNA 鎖 を 変 性 するのに 必 要 な 厳 しい 温 度 条 件 のなかでは 殆 どの 酵 素 は 失 活 します が 温 泉 という 高 温 の 条 件 下 で 生 存 出 来 るバクテリアから 分 離 された Taq ポリメラーゼは 活 性 を 保 ちま す 95 で DNA 鎖 を 変 性 60 でプライマーをアニール (ポリメラーゼは 二 本 鎖 DNA のみを 認 識 する) 72 で 伸 長 ( 新 しい DNA 鎖 を 合 成 ) 40 回 サイクルを 繰 り 返 す 図 9.PCR サイクル アニーリングステップ 中 は オリゴヌクレオチドプライマーは アニール すなわち 二 つの 一 本 鎖 鋳 型 DNA の 上 の 相 補 的 な 配 列 をみつけます このアニールした 部 位 において プライマーは Taq ポリメラーゼ の 複 製 開 始 部 位 を 提 供 します プライマーという 名 前 は これが 一 本 鎖 DNA に 短 い 二 本 鎖 の 部 分 を 作 る ことで そこから Taq ポリメラーゼが 新 しい 相 補 的 な DNA 鎖 を 合 成 出 来 るように プライム( 準 備 ) する と いう 事 に 由 来 します プライマーが 鋳 型 配 列 に 結 合 するには 温 度 も 重 要 です この 実 習 では 64 とい うアニーリング 温 度 がプライマーの 結 合 には 最 適 です 47

51 伸 長 ステップにおいて Taq ポリメラーゼの 仕 事 はヌクレオチド(A T G C)を 一 つずつプライマーに くっつけて 鋳 型 DNA に 相 補 的 な 配 列 を 合 成 することです ポリメラーゼ 反 応 の 間 反 応 温 度 は Taq ポリ メラーゼの 最 適 温 度 である 72 まで 上 昇 します 変 性 アニーリング 伸 長 という 3 つのステップが 一 緒 に なって 一 つの PCR サイクル を 構 成 し それは 40 サイクル 繰 り 返 されます この 40サイクルの 反 応 は 温 度 サイクル 機 (サーマルサイクラー)の 中 に 置 かれたマイクロチューブの 中 で 行 なわれます サーマルサイクラーの 中 にはサンプルを 保 持 するアルミニウムの 塊 があるので 大 きく 急 速 に 温 度 を 上 下 する 事 が 可 能 なのです このように 温 度 ブロックの 温 度 を 急 速 に 上 げ 下 げすることは 温 度 サイクル あるいは 熱 サイクル と 呼 ばれます 温 度 サイクル= 変 性 ステップ(94 )+アニーリングステップ(60 )+ 伸 長 ステップ(72 ) 48