レポート 課 題 : 次 世 代 シークエンサーが 産 出 する 大 規 模 シークエンシ ングデータを 生 命 科 学 にどう 活 かすか? というお 題 で A4レポート 用 紙 1 枚 程 度 の 文 章 ( 講 義 の 感 想 自 分 で 調 べたこと などなど)を 書 いてください 提 出

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1 2015 年 4 月 16 日 生 命 情 報 特 別 講 義 第 2 次 世 代 シークエンサーの インフォマティクス 佐 藤 健 吾 慶 應 義 塾 大 学 理 工 学 部 生 命 情 報 学 科 satoken@bio.keio.ac.jp

2 レポート 課 題 : 次 世 代 シークエンサーが 産 出 する 大 規 模 シークエンシ ングデータを 生 命 科 学 にどう 活 かすか? というお 題 で A4レポート 用 紙 1 枚 程 度 の 文 章 ( 講 義 の 感 想 自 分 で 調 べたこと などなど)を 書 いてください 提 出 場 所 :L 科 事 務 室 前 のポスト 提 出 期 限 :4 月 23 日 ( 木 )2 限 開 始 前 まで 今 日 のスライド h9p://

3 今 日 の 話 次 世 代 シークエンサーによる 網 羅 的 データと その 統 合 的 な 解 析

4 ゲノム 情 報 ビッグバン ゲノムを 読 むスピードがものすごい 勢 いで 上 がっている 兆 1000 億 Illumina HiSeq2500 解 読 可 能 塩 基 数 / 日 100 億 10 億 1 億 万 1000 万 100 万 ABI377 ABI3700 ABI GS20 10 万 年 454 FLX 2 年 で2 倍 Illumina GAIIx 8ヶ 月 で2 倍

5 次 世 代 シークエンサー 超 並 列 シークエンシング Illumina/GA Roche/454 ABI/SOLiD 特 徴 リード 長 が 短 い ( 塩 基 ) 1 塩 基 を 読 むのに1 時 間 かかる 5000 万 10 億 個 を 並 列 に 読 む

6 次 世 代 シークエンサー (Metzker 2010)

7 h9p://

8 性 能 比 較 Roche 454FLX Illumina GA2 ABI SOLiD3 ABI 3730xl 平 均 リード 長 ( 塩 基 ) リード 数 100 万 億 2 億 96 塩 基 数 /ラン 0.5Gb 4-8Gb 10Gb 72kb ラン 時 間 10 時 間 4 日 5 日 1 時 間 塩 基 数 / 日 Gb 1-2Gb 2Gb 1.8Mb (2009 年 5 月 現 在 )

9 次 々 世 代 シークエンサー 1 分 子 シークエンシング Pacific Biosciences Helicos 特 徴 DNAポリメラーゼがDNAを 複 製 する 仕 組 みを 利 用 する 秒 速 1 2 塩 基 を 実 時 間 で 読 むことができる リード 長 も 塩 基 と 長 い 並 列 度 は 低 い (8 万 個 ぐらい)

10 次 々 世 代 シークエンサー (Metzker 2010)

11 h9ps://

12 マイクロアレイ (Wikipedia)

13 マイクロアレイ プローブ 設 計 が 必 要 ミスハイブリダイゼーション 結 果 が 発 光 強 度

14 どのようなデータが 得 られるか? Sequence variant data Transcriptome data Epigenome data Interactome data

15 解 析 の 流 れ サンプル 調 製 とシークエンシング - 納 豆 菌 ゲノム (アジア 株 5 株 ) ゲノム 抽 出 サンプル 調 製 断 片 化 500 bp Illumina GAIIx シークエンシング ペアエンドリード 断 片 化 されたショートリードの 両 端 を 読 む ペアエンドリード ペアエンドリード 平 均 インサート 長 500bp

16 解 析 の 流 れ - de novo アセンブリ - 参 照 するゲノムがない 場 合 の 解 析 方 法 ペアエンドリード (アジア 株 5 株 ) アセンブリ Velvet [Zerbino et al, 2008] 推 定 ゲノム (スキャフォルド) 遺 伝 子 予 測 glimmer [Salzberg et al, 1998] 遺 伝 子 アノテーション 比 較 ゲノム Murasaki [Popendorf et al, 2010] 枯 草 菌 納 豆 菌 BEST195 アジア 株 オーソログ 遺 伝 子 リピート 領 域 の 解 析

17 解 析 の 流 れ リシークエンシング - 参 照 するゲノムがある 場 合 の 解 析 方 法 ペアエンドリード (アジア 株 5 株 ) マッピング Bowne2 [Langmead et al, 2012] BEST195ゲノム 多 型 の 同 定 GATK [McKenna et al, 2010] A A A A A C BEST195ゲノム 変 異 影 響 度 アノテーション snpeff [Cingolani et al, 2012] 同 義 置 換 非 同 義 置 換 非 コード 領 域 の 置 換 遺 伝 子 の 機 能 表 現 型 の 解 析

18 Sequence variant data シークエンサーで 読 んだリードをリファレンス ゲノムにマッピングすることによって どこに 変 異 が 入 っているかを 網 羅 的 に 計 測 できる 最 近 はrare variant(<1%)が 注 目 されている パーソナルゲノム

19 Transcriptome data RNA- seqという 技 術 で 転 写 物 を 網 羅 的 に 計 測 できる mrnaの 発 現 量 選 択 的 スプライシングの 検 出 遺 伝 子 のフュージョン(ガン 細 胞 など) 新 規 non- coding RNAの 発 見

20 解 析 の 流 れ RNA- Seq - サンプル 調 製 納 豆 菌 BEST195 total RNA 抽 出 total RNA 断 片 化 RNA 逆 転 写 cdna ショートリード Illumina GAIIx シークエンシング

21 解 析 の 流 れ RNA- Seq - 異 なる 条 件 におけるmRNAの 発 現 量 を 比 較 す る ねばねばする 培 養 条 件 (BN) ねばねばしない 培 養 条 件 (PN) マッピング Bowne2 [Langmead et al, 2012] BEST195ゲノム 発 現 量 比 較 cuffdiff [Trapnell et al, 2010] 各 遺 伝 子 の 発 現 差 があるかないか BEST195ゲノム

22 RNA- seq (Wang+ 2009)

23 RNA- seq (Wang+ 2009)

24 Epigenome data ChIP- seqやbisulfite sequencing, MeDIP- seqと いう 技 術 でゲノムの 後 天 的 修 飾 (エピゲノム) を 網 羅 的 に 計 測 できる ヒストン 修 飾 (ChIP- seq) DNAメチル 化 (Bisulfite- sequencing, MeDIP- seq)

25 ヒストンとヌクレオソーム 構 造 約 146 塩 基 対 のDNAがヒストン8 量 体 に 巻 き 付 いている(ヌクレオソーム 構 造 ) (Wikipedia)

26 クロマチン 構 造 ヌクレオソームの 凝 縮 度 合 いによって 転 写 活 性 が 異 なる 転 写 活 性 化 転 写 不 活 性 化 (Jenuwein+ 2001)

27 ヒストン 修 飾 ヒストンのN 末 端 配 列 は 様 々な 修 飾 を 受 ける (Cheung+ 2000)

28 ヒストンコード 仮 説 (Strahl+ 2000)

29 ChIP- seq 転 写 因 子 やヒストン 修 飾 に 特 異 的 な 抗 体 を 使 って 免 疫 沈 降 し 一 緒 に 落 ちたDNAを 読 む (Park 2009)

30 Bisulfite sequencing Bisulfite 処 理 を 行 うと メチル 化 されていないシトシン (C)はウラシル(U)に 変 換 されるが メチル 化 されてい るシトシンは 変 換 されない (Xi+ 2009)

31 MeDIP- seq (Wikipedia)

32 Interactome data ChIP- seqやhits- CLIPという 技 術 でDNA- タンパ ク 質 結 合 やRNA- タンパク 質 結 合 を 網 羅 的 に 計 測 できる

33 HITS- CLIP (Licatalosi+ 2010)

34 データをどうやって 処 理 するか? Base calling Read mapping Data complexity reducnon Peek detecnon Data integranon Data visualizanon Unsupervised integranon Supervised integranon

35 Base calling 次 世 代 シークエンサーはエラー 率 が 比 較 的 高 い (Illumina GAIIの 場 合 1%ぐらい) base qualityを 一 緒 に 出 力 する エラー 補 正 アルゴリズムが 多 数 開 発 されてい る

36 Read mapping ここ 数 年 で 最 も 開 発 競 争 が 激 しい 分 野 Hashを 基 にしたツール SeqMap, MAQ, SOAP, Stampy, Novoalign Suffix Array/BWTを 基 にしたツール SOAP2, Bowne, BWA, BWA- SW

37 Read mapping しかし 課 題 はまだ 沢 山 ある ギャップ 付 アラインメント pair- end readのアラインメント base qualityを 考 慮 したアラインメント 長 いリードのアラインメント SOLiDが 出 力 する color- code read bisulfite 処 理 されたリードのアラインメント spliced read, muln readのアラインメント

38 Peek detecnon シグナルプロファイルを 作 る バックグランドモデルを 用 意 する バックグランドと 比 較 し て 有 意 な 領 域 をコール する (Pepke+ 2009)

39 Data visualizanon (Hawkins+ 2010)

40 Database biology ゲノムブラウザを 見 るといろいろなことがわか る 配 列 に 対 して 様 々なデータが 張 り 付 けられている ゲノムはただの 座 標 軸 に 過 ぎない

41 Unsupervised integranon 与 えられたデータにおける 特 徴 的 なパターン を 教 師 なし 学 習 アルゴリズムで 発 見 する クラスタリング 主 成 分 分 析 頻 出 パターンマイニング

42 Supervised integranon 発 見 したパターンを 仮 説 としてモデルを 構 築 し 教 師 あり 学 習 アルゴリズムで 検 証 する 相 関 分 析 回 帰 分 析 ベイジアンネットワーク

43 どのようなことがわかるのか? ゲノムの 機 能 アノテーション 遺 伝 多 型 の 機 能 推 定 遺 伝 子 制 御 メカニズムの 解 明

44 ゲノムの 機 能 アノテーション 転 写 因 子 結 合 部 位 やヒストン 修 飾 によりゲノ ムに 機 能 アノテーションをすることができる (Hawkins+ 2010)

45 遺 伝 多 型 の 機 能 推 定 Genome- wide associanon study (GWAS) 一 塩 基 多 型 (SNPs)などの 遺 伝 多 型 をゲノムワイド に 解 析 する パーソナルゲノムによるmulnple rare variant 解 析 non- coding regionのsnpsがchip- seqで 多 く 見 つかっている à regulatory SNPs (Hawkins+ 2010)

46 遺 伝 子 制 御 メカニズムの 解 明 transcriptomic data と epigenomic dataの 統 合 はと ても 強 力 à エピゲノム ヒストンコードの 解 読 ゲノムインプリンティング ips 細 胞 ガン 遺 伝 子 RNA- seq によるexon expression dataと HITS- CLIPによるsplicing factorとmrnaの interactome dataを 統 合 して スプライシング 機 構 を 解 明 する

47 Case study (1) ヒストン 修 飾 データを 用 いると 転 写 因 子 結 合 部 位 の 予 測 精 度 が 向 上 する (Sato+ 2010)

48 転 写 因 子 結 合 部 位 予 測 これまでの 方 法 Posinon Weight Matrix (PWM) を 使 って 配 列 データか ら 予 測 する False posinve( 間 違 えて 予 測 する)がとても 多 い 組 織 特 異 的 な 発 現 を 説 明 できない

49 本 手 法 ヒストン 修 飾 や 配 列 保 存 度 などを 統 合 して 予 測 精 度 の 向 上 を 図 る ヒストン 修 飾 (メチル 化 アセチル 化 など) RNA Pol II の 結 合 転 写 開 始 点 (AceView) 配 列 保 存 度 (phastcons) PWMスコア

50 本 手 法 機 械 学 習 を 使 ってデータを 統 合 する Naïve Bayes Random Forest with Naïve Bayes Trees

51 結 果 予 測 精 度 のAUC(1に 近 いほど 良 い)

52 結 果

53 Case Study (2) ヒストン 修 飾 データを 多 変 量 HMMでモデル 化 し ヒトゲノムの 機 能 アノテーションを 行 う

54 RESEARCH ARTICLE a WLS in H1 ES cells (poised) WLS in GM12878 cells (repressed) WLS in HUVEC (active) WLS in NHLF (active) CTCF H3K27me3 H3K36me3 H4K20me1 H3K4me1 H3K4me2 H3K4me3 H3K27ac H3K9ac WCE Chromatin state Genes H1 ES K562 GM12878 HepG2 HUVEC HSMM NHLF NHEK HMEC b c Coverage d Chromatin states Candidate HepG2 enhancer activity state annotation Active promoter Weak promoter Inactive/poised promoter Strong enhancer Strong enhancer Weak/poised enhancer 20 n = Weak/poised enhancer Insulator Transcriptional transition Transcriptional elongation Weak transcribed Polycomb repressed n = 7 n = Heterochrom; low signal Repetitive/CNV Repetitive/CNV State 4 in State 7 in State 4 in Chromatin mark observation frequency (%) (%) (fold) (kb) (%) Functional enrichments (fold) HepG2 HepG2 GM12878 State CTCF DEPDC1 H3K27me3 H3K36me3 RPE65 H4K20me1 H3K4me1 H3K4me2 H1 ES H3K4me3 H3K27ac H3K9ac WCE Median H1 ES GM GM12878 WLS gene Median length ±2 kb TSS Conserved non-exon Figure 1 Chromatin state discovery and characterization. a, Top: profiles DNase (K562) c-myc (K562) HUVEC NF-κB (GM12878) DIRAS3 Transcript Nuclear lamina (NHLF) NHLF Luciferase relative light units GNG12 GADD45A 100 kb (Ernst+2011) cell types by a multivariate hidden Markov model. The table shows emission

55 RESEARCH ARTICLE a Enhancer activity b Gene expression c d Candidate regulators e Activator/repressor activity signatures H1 ES K562 GM12878 HepG2 HUVEC HSMM NHLF NHEK HMEC Cluster size H1 ES K562 GM12878 HepG2 HUVEC HSMM NHLF NHEK HMEC Correlation TF binding Oct4 NF-κB Top motifs (enriched/depleted) Oct4 Rfx GATA PU.1 STAT NF-E2 NF-κB IRF ELK1 TEL2 Ets HNF1 HNF4 PPARγ TEF-1 Myf RP58 p53 c-myc Mef2 AP-1 MAF BACH1 GFI1 BACH2 CTCF AP-4 NF-Y HEN1 Nrf-2 ASCL2 A B C D E F G H I J K L M N O P , Rfx, Oct4, CTCF , GATA, Nrf-2, STAT , PU.1, STAT, GFI , Nrf-2, NF-E2, BACH , Nrf-2, MAF, NF-E , IRF, NF-κB, BACH , TEL2, Ets, ELK , HNF1, HNF4, PPARγ , HNF1, HNF4, AP , BACH1, BACH2, TEF , Mef2, HNF1, Ets , BACH2, BACH1, HEN , BACH1, AP-1, NF-E , BACH2, TEF-1, Ets , ASCL2, AP-4, Myf , RP58, Nrf-2, BACH1 A B C D E F G H I J K L M N O P Q , p53, ASCL2, Nrf-2 Q R , PU.1, p53, GATA R S , NF-Y, c-myc, CTCF S T , BACH1, BACH2, NF-E2 T Cluster coefficient Nearest-gene expression Cluster coefficient/gene expression correlation Regulatory motif enrichment TF expression TF/motif correlation Activator signature Positive correlation Motif enrichment/tf expression Motif depletion/tf repression Repressor signature Negative correlation Motif depletion/tf expression Motif enrichment/tf repression Figure 3 Correlations in activity patterns link enhancers to gene targets and upstream regulators. a, Average enhancer activity across the cell types (columns) for each enhancer cluster (rows) defined in Fig. 2b (labelled A T) and number of 200-bp windows in each cluster. b, Average messenger RNA expression of nearest gene across the cell types and correlation with enhancer activity profile from a. High correlations between enhancer activity and gene expression provide a means of linking enhancers to target genes. c, Enrichment Myf: Myf family; NF-Y: NFYA, NFYB and NFYC. e, Predicted causal regulators for each cluster based on positive (activators) or negative (repressors) correlations between motif enrichment (top left triangles) and transcription factor expression (bottom right triangles). For example, the red yellow combination indicates that Oct4 is a positive regulator of ESC-specific enhancers, as its motif-based predicted targets are enriched (red upper triangle) for enhancers active in ESCs (cluster A), and the Oct4 gene is expressed

56 榊 原 研 でやっている 次 世 代 シークエンサー 関 連 の 研 究 納 豆 菌 ゲノムの 解 読 ( 近 縁 種 を 使 ったアセンブ リ) ヤコウダケゲノムの 解 読 (de novoアセンブリ)と 遺 伝 子 探 索 メダカゲノムの 発 現 解 析 (RNA- seq) がんゲノム( 変 異 解 析 ) マーモセットゲノムの 解 読 (de novoアセンブリ)

57 今 日 話 さなかったこと de novo アセンブリ メタゲノム 解 析 ヒトの 腸 内 環 境 ゲノム( 土 壌 海 洋 ) 生 命 工 学 経 済 生 物 エネルギー 問 題 (バイオエタノール) 環 境 問 題 ( 重 金 属 汚 染 など)

58 まとめ シークエンサーによるゲノム 解 読 の 速 度 が 爆 発 的 に 向 上 している 様 々な 種 類 の 網 羅 的 なデータが 簡 単 に 得 ら れるようになった これらのデータを 統 合 的 に 解 析 することに よって 生 命 の 謎 をより 多 く 解 き 明 かすことが できるだろう そのためには ドライとウェットの 協 力 は 必 要 不 可 欠 である

59 レポート 課 題 : 次 世 代 シークエンサーが 産 出 する 大 規 模 シークエンシ ングデータを 生 命 科 学 にどう 活 かすか? というお 題 で A4レポート 用 紙 1 枚 程 度 の 文 章 ( 講 義 の 感 想 自 分 で 調 べたこと などなど)を 書 いてください 提 出 場 所 :L 科 事 務 室 前 のポスト 提 出 期 限 :4 月 23 日 ( 木 )2 限 開 始 前 まで 今 日 のスライド h9p://

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