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1 食 物 が 腸 管 免 疫 に 及 ぼす 影 響 の 評 価 システム 構 築 と 食 物 アレルギーの 機 序 解 明 安 達 貴 弘 東 京 医 科 歯 科 大 学 難 治 疾 患 研 究 所 免 疫 疾 患 准 教 授 腸 管 には 多 数 の 免 疫 担 当 細 胞 が 存 在 し 食 物 に 対 して は 寛 容 を 誘 導 するが 食 物 摂 取 に 付 随 して 摂 取 される 病 原 微 生 物 に 対 しては 生 体 防 御 に 働 く しかし この 精 巧 な 免 疫 系 も 時 として 破 綻 し 食 物 により 免 疫 系 が 始 動 さ れ 食 物 アレルギーを 引 き 起 こすことはよく 知 られてい る 同 じく IgE を 介 する 花 粉 症 では 花 粉 が 飛 散 しな い 時 期 でも 抗 体 が 産 生 され 続 け 免 疫 記 憶 が 成 立 してい る 本 来 この 免 疫 記 憶 による 抗 体 産 生 は インフルエ ンザなどに 対 するワクチン 効 果 を 発 揮 し 生 体 防 御 に 必 須 なものであるが 同 時 にアレルギーや 自 己 免 疫 疾 患 の 原 因 ともなっている 食 物 アレルギーに 関 しても 一 旦 感 作 されると 疾 患 が 継 続 することから 免 疫 記 憶 が 深 く 関 わっていると 推 測 される しかし 食 物 アレルギーに 対 して その 原 因 となる IgE の 産 生 機 序 や 産 生 細 胞 の 動 態 はほとんど 解 明 されておらず その 発 症 の 全 容 はよく わかっていない 食 物 は 多 くの 成 分 を 含 み 摂 取 後 消 化 吸 収 さらには 代 謝 され 様 々な 物 理 的 化 学 的 変 化 を 受 けるため in vivo での 正 確 な 評 価 システムが 必 要 であるが 現 在 のところいい 解 析 系 はない これらの 問 題 点 を 解 決 すべく 食 物 が 免 疫 系 に 及 ぼす 影 響 を 正 確 に 解 明 することを 目 指 し マウスをモデルとして その 解 析 系 の 確 立 を 行 った 蛍 光 タンパク 質 カルシウムプローブ Cameleon 1) を 条 件 的 に 発 現 するトランスジェニックマウス(Floxed Cameleon トランスジェニックマウス)はCAGプロ モーター(サイトメガロウィルス / チキンβアクチン) を 持 つpCXN2ベクターを 用 いた プロモーター 下 流 に 並 列 に LoxP 配 列 で 挟 んだネオマイシン 耐 性 遺 伝 子 を 挿 入 し そのさらに 下 流 に Cameleon 遺 伝 子 を 挿 入 し た このコンストラクトを 直 鎖 化 した 後 マウス 卵 母 細 胞 に 導 入 し トランスジェニックマウスを 作 製 した この floxed Cameleon マウスとそれぞれ IgG1 陽 性 B 細 胞 特 異 的 に 樹 状 細 胞 特 異 的 に Cre 組 換 え 酵 素 を 発 現 する IgG1-Cre マウス CD11c-Cre マウスと 交 配 し IgG1 陽 性 B 細 胞 特 異 的 樹 状 細 胞 特 異 的 に Cameleon を 発 現 するマウスを 作 製 した また floxed Cameleon トランスジェニックマウスを CAG-Cre マウスと 交 配 さ せ 全 身 性 に Cameleon を 発 現 させたマウスを 作 製 した 遺 伝 子 組 換 えマウスは 東 京 医 科 歯 科 大 学 動 物 実 験 委 員 会 および 組 換 え DNA 安 全 員 会 の 承 認 を 得 て 指 針 に 従 っ て SPF 下 で 飼 育 し 実 験 に 用 いた 蛍 光 タンパク 質 カルシウムプローブ Cameleon を 用 い た 図 1 に 示 すように Cameleon は CFP と YFP の 間 にカルモジュリンのカルシウム 結 合 ドメインを 持 ち カ ルシウム 結 合 状 態 では 分 子 内 の CFP と YFP が 隣 接 し CFP から YFP へのエネルギー 移 動 (Föster resonance energy transfer:fret)が 起 こる このエネルギー 移 動 の 効 率 を 測 定 し 細 胞 内 のカルシウム 濃 度 の 変 化 を 検 出 した マウスを 麻 酔 後 腹 部 あるいは 脇 腹 の 一 部 を 外 科 的 に 切 開 して 腸 管 あるいは 脾 臓 を 取 り 出 し マウスを 観 察 台 に 固 定 し 臓 器 の 動 きを 最 小 限 にとどめるようにして 生 体 イメージングを ニコン 社 製 共 焦 点 レーザー 顕 微 鏡 A1 システムを 用 いておこなった 2) 励 起 波 長 458nm で YFP と CFP の 蛍 光 波 長 を 測 定 し YFP/CFP の 比 を とることによって FRET を 検 出 した マウスより 脾 臓 骨 髄 腸 間 膜 リンパ 節 小 腸 パイエ ル 板 を 取 り 出 し それらリンパ 組 織 から 細 胞 を 調 製 した 1

2 安 達 貴 弘 細 胞 を 蛍 光 標 識 された 抗 CD4 抗 体 抗 CD3 抗 体 抗 B220 抗 体 抗 CD138 抗 体 抗 CD19 抗 体 抗 CXCR4 抗 体 で 染 色 し フローサイトメーター CyAnADP (コー ルター 社 製 )を 用 いて 解 析 した かった 腸 管 でもB 細 胞 が 容 易 に 観 察 できる CD19-Cre マウスと 交 配 した floxed Cameleon マウ スではB 細 胞 のマーカーである CD19 陽 性 細 胞 特 異 in vivo Cameleon 蛍 光 蛋 白 質 カルシウムセンサー Cameleon( 図 1)を 用 いてB 細 胞 のカルシウムシグナリングを 測 定 できる ことを 我 々は 既 に 示 している そこで 本 研 究 では 各 種 免 疫 担 当 細 胞 特 異 的 に リアルタイムで 生 体 イメージ ングが 行 える in vivo の 系 を Cameleon を 用 いて 構 築 す ることにした 既 に DNA 組 換 え 酵 素 Cre を 利 用 して 誘 導 的 に Cameleon を 発 現 するマウス(floxed Cameleon マウス)を 樹 立 し B 細 胞 特 異 的 に Cre を 発 現 する マウス(CD19-Cre マウス)と 交 配 したB 細 胞 特 異 的 Cameleon 発 現 マウスでは 図 2に 示 すように B 細 胞 が 集 団 を 形 成 しているリンパ 組 織 で Cameleon の 発 現 がみられた また これまで 自 家 蛍 光 が 高 く 観 察 が 難 し 1 CFPとYFPの 蛍 光 蛋 白 質 の 間 にカルモジュリンのカルシウ ム 結 合 部 位 を 持 っている カルシウムの 有 無 により 構 造 変 化 を 伴 い カルシウム 結 合 状 態 ではCFPとYFPが 隣 接 し 蛍 光 共 鳴 エ ネルギー 移 動 (FRET)が 起 こり Cameleonを 励 起 波 長 433nm 付 近 を 用 いた 場 合 蛍 光 波 長 がシフトする 2 CD19-Cre マウスと 交 配 した floxed Cameleon マウスの 各 リンパ 組 織 をについ て 蛍 光 顕 微 鏡 により 観 察 した 緑 色 に 見 えるのがCameleon 発 現 細 胞 の 集 団 2

3 食 物 が 腸 管 免 疫 に 及 ぼす 影 響 の 評 価 システム 構 築 と 食 物 アレルギーの 機 序 解 明 的 に Cameleon の 発 現 がみられる( 図 3 上 段 左 ) ま た IgG1-Cre マウスと 交 配 したものではB 細 胞 のマー カーである B220 陽 性 細 胞 のうち 約 1% ほどの 細 胞 で Cameleon の 発 現 がみられた さらに 樹 状 細 胞 T 細 胞 特 異 的 Cameleon 発 現 マウスを 得 る 目 的 で CD11c- Cre マ ウ ス CD4-Cre マ ウ ス と 交 配 し た 末 梢 血 を 採 血 し T 細 胞 特 異 的 に あるいは 樹 状 細 胞 特 異 的 に Cameleon が 発 現 していることを 確 認 した CD4- Cre マ ウ ス と 交 配 し た floxed Cameleon (CD4-Cre/ Cameleon)マウスでは 末 梢 血 中 のリンパ 球 の 約 10% (CD19 陰 性 )が また CD11c-Cre マウスと 交 配 した もの(CD11c-Cre/Cameleon)では 脾 臓 細 胞 の 約 5% が Cameleon 陽 性 であった( 図 3 中 段 ) CD11c は 一 部 の B 細 胞 にも 発 現 していることが 知 られており IgM 陽 性 細 胞 の 一 部 でも Cameleon の 発 現 がみられた 細 胞 系 譜 特 異 的 Cameleon 発 現 マウスが 交 配 では 得 られな い 細 胞 系 譜 については CAG-Cre マウスとの 交 配 によ り 胚 細 胞 レベルで 組 換 えを 起 こし 全 身 性 に Cameleon を 発 現 するマウスも 作 製 した 図 3( 下 段 )に 示 すとおり ほとんどの 脾 臓 の 細 胞 で Cameleon の 発 現 がみられた B 細 胞 あるいは IgG1 陽 性 B 細 胞 特 異 的 に 蛋 白 性 のカ ルシウムイオン 蛍 光 プローブ Cameleon を 発 現 するマ ウスを 利 用 して 生 体 イメージングにより 腸 管 での 免 疫 細 胞 の 動 態 およびその 活 性 化 をリアルタイムで 詳 細 に 観 察 し 免 疫 細 胞 を 直 接 調 べた 小 腸 パイエル 板 の 生 体 イメージングを 行 った 麻 酔 し たマウスより 腸 管 を 取 り 出 し 腸 管 の 蠕 動 運 動 を 抑 制 す るために 腸 管 内 をアガロースを 含 むリン 酸 緩 衝 液 で 満 た し 共 焦 点 顕 微 鏡 でパイエル 板 を 観 察 した 腸 の 動 きは 完 全 に 抑 えるのは 不 可 能 であるが FRET センサーを 用 いたことにより 蛍 光 輝 度 の 減 衰 や 動 きによる 変 化 を 補 正 し 細 胞 内 カルシウムシグナリングを 検 出 するのに 成 功 した しかし 食 物 の 影 響 を 評 価 するため 腸 管 にリ ン 酸 緩 衝 液 を 満 たすための 穴 を 腸 管 に 開 けることなく 観 察 することが 望 ましいので 観 察 方 法 の 改 良 を 行 った 腸 管 をガラスボトムシャーレに 乗 せ スポンジで 上 から 腸 管 を 押 さえ 固 定 した この 方 法 で 共 焦 点 顕 微 鏡 によ る 観 察 に 耐 えうる 程 度 の 固 定 ができ 生 体 イメージング ができることが 確 かめられた 細 胞 内 のカルシウム 濃 度 は 図 4 に 示 すように 疑 似 カラーによって 示 されており 3 Cre floxed Cameleon Cameleon フローサイトメーターによりマウス 脾 細 胞 での Cameleon 発 現 細 胞 を 細 胞 表 面 マーカーを 用 いて 解 析 した CD19 あるいはB 220はB 細 胞 のマーカーである IgM はクラススイッチを 起 こ す 前 のB 細 胞 のマーカーである 赤 い 細 胞 が 高 いことを 示 している この 方 法 を 用 いて 小 腸 パイエル 板 を 生 体 イメージングによって 観 察 した FRETを 起 こしている 細 胞 が 多 く 見 られた 複 数 のマ ウスで 再 現 性 よくカルシウムシグナリングをモニターで きた IgE B Cameleon アレルギーの 影 響 をを 調 べるため IgE 発 現 細 胞 特 異 3

4 安 達 貴 弘 4 CD19-Cre/floxed Cameleon マウスを 麻 酔 し 小 腸 パイエル 板 を 共 焦 点 顕 微 鏡 により 観 察 した ( 上 )CD4 陽 性 T 細 胞 ( 青 )と Cameleon 発 現 細 胞 ( 緑 )を 示 す ( 下 )10 分 間 観 察 した YFP と CFP の 比 ( 高 いほど 細 胞 内 カルシウムぬ 度 が 高 い)のイメージを 経 時 的 に 示 した 疑 似 カラーで 赤 が 細 胞 内 カルシウム 濃 度 が 高 い 的 に Cameleon を 発 現 するマウスを IgE-Cre マウスと 交 配 することによって 作 製 した 全 身 性 に Cameleon を 発 現 させるマウスも 作 製 でき また 我 々が 作 製 した 条 件 的 Cameleon 発 現 マウスにお いても 種 々の Cre マウスとの 交 配 により 細 胞 系 譜 特 異 的 Cameleon を 発 現 し 蛍 光 輝 度 が 高 く 腸 管 など 自 己 蛍 光 が 高 い 組 織 でも Cameleon 発 現 細 胞 を 容 易 に 検 出 できる 本 研 究 により 腸 管 でもリアルタイムで 免 疫 細 胞 の 動 態 のみならず 活 性 化 もモニターできることを 示 した しかし 腸 管 は 蠕 動 運 動 をしており 観 察 はい まだ 困 難 である 安 定 した 解 析 系 のためには 腸 管 を 傷 つ けないように 固 定 することが 必 要 である 実 際 に 食 物 の 影 響 を 評 価 するまでには 至 らなかったが 本 研 究 で 構 築 したマウスのモデル 系 で 食 物 の 違 いによる 免 疫 細 胞 の 変 化 を 詳 細 に 検 討 できると 思 われる B 細 胞 やT 細 胞 の 抗 原 受 容 体 やその 他 の 受 容 体 から のカルシウムシグナリングを 含 むシグナリングは 増 殖 分 化 アポトーシスといった 機 能 に 重 要 である しか し in vivo でのこれらのシグナリングを 観 察 するのはこ れまで 困 難 であった 我 々はB 細 胞 やT 細 胞 での 代 表 4

5 食 物 が 腸 管 免 疫 に 及 ぼす 影 響 の 評 価 システム 構 築 と 食 物 アレルギーの 機 序 解 明 的 な 細 胞 内 シグナリングであるカルシウムシグをモニ ターできるマウスを 作 製 し 生 体 で 細 胞 の 動 態 と 細 胞 内 シグナリングを 生 体 で 見 られるシステムを 構 築 した Cameleon はそれぞれ 細 胞 系 譜 特 異 的 に 発 現 していた in vivo イメージングで 腸 管 のパイエル 板 での B 細 胞 の 活 性 化 状 態 をリアルタイムで 見 られるシステムを 構 築 し た さらに 免 疫 記 憶 の 実 体 となる 長 期 の 抗 体 産 生 を 起 こ す 骨 髄 で 長 寿 命 形 質 細 胞 についても ex vivo のイメージ ングによりカルシウムシグナリングを 検 出 できることを 示 した 本 研 究 により 食 物 摂 取 やアレルギーなどの 疾 患 による 免 疫 細 胞 の 動 態 活 性 化 を 詳 細 に 調 べるマウス 実 験 系 が 構 築 できた 蛍 光 蛋 白 質 カルシウムセンサー YC3.60 遺 伝 子 をい ただきました 理 研 宮 脇 博 士 生 体 イメージングの 実 験 を 支 援 していただいた 東 京 医 科 歯 科 大 学 烏 山 教 授 CAG-Cre マウスをいただきました 大 阪 大 学 岡 部 教 授 CD11c-Cre マウスをいただきました 東 京 医 科 歯 科 大 学 樗 木 教 授 手 塚 助 教 IgG1-Cre マウスをいただきまし たハーバード 大 学 Rajewsky 教 授 CD4-Cre マウスを 使 わせていただいた 東 京 医 科 歯 科 大 学 ( 現 東 京 大 学 ) 高 柳 教 授 IgE-Cre マウスをいただきました 東 京 理 科 大 学 久 保 教 授 マウスを 作 製 していただいた 難 治 疾 患 研 究 所 組 換 えマウス 実 験 室 宇 佐 美 技 術 職 員 ソーティン グにご 助 力 いただいた 幹 細 胞 支 援 室 齋 藤 技 術 専 門 職 員 山 崎 技 術 補 佐 員 に 感 謝 いたします また 本 研 究 を 支 援 し ていただきました 公 益 財 団 法 人 三 島 海 雲 記 念 財 団 に 心 よ りお 礼 申 し 上 げます 1)Nagai, T., et al, : Proc Natl Acad Sci USA 101, , ) 実 験 医 学 別 冊 最 強 のステップ UP シリーズ in vivo イ メージング 実 験 プロトコール 原 理 と 導 入 のポイントから2 光 子 顕 微 鏡 の 応 用 まで ( 石 井 優 / 編 ) 羊 土 社 )Adachi, T. & Tsubata, T., : Biochem Biophys Res Commun 367, ,

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