ゲノム配列の登録～大量登録システム(MSS) ～

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ひできうみのなか
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1 第 27 回 DDBJing 講習会 in 三島 ( ) 大量登録システム (MSS) の紹介 : 大規模アセンブル配列の登録国立遺伝学研究所 DDBJ センター日本 DNA データバンクアノテータ大城戸利久目 DDBJ へのデータ登録 DDBJ 大量登録システムとは MSSにおける登録作業の流れ MSSを利用の前に MSS 申し込みフォーム登録のために必要なファイルアノテーションファイルサンプルアノテーションファイル塩基配列ファイル登録ファイルのチェックツール (UME) ゲノムデータの登録受付パターン NGS 由来ゲノム配列の登録 complete, WGS, CON アノテーションファイルの具体例微生物のcompleteゲノム配列の登録例 WGSエントリのアノテーション CONエントリの登録必要なファイル AGPファイルの入力例次ゲノム登録に必要なファイル一覧 BioProject Database Locus_tagの使用例 BioProject の申請 (1) BioProject の申請 (2) 複数のデータベースに跨る塩基配列の登録の流れ A) NGS 由来ゲノム配列の登録手続きの流れ B) NGS 由来 TSAの登録手続きの流れゲノムエントリの公開データ例登録の申し込みと問い合わせ参考資料 I. TSA (Transcriptome Shotgun Assembly) データの登録 NGS 由来 TSAの概略 TSAの登録に必要なファイル TSAエントリの登録例 II. Quality score

登録データの種類とデータベース (DB) の選択 DDBJ は, 現在 3 種類の塩基配列 archive データベースを運営しています. 各々の DB は米国, 欧州と協調体制の下, 国際的な共同体 (INSDC) を構成しています. 各々の DB に登録公開された塩基配列データは, 共同体メンバーの各データバンクへ送付され,3 極間でデータを共有しています.

DDBJ (DDBJ/EMBL-Bank/GenBank): 塩基配列登録システム ( 小規模 ) ; 大量登録システム :( 大規模 ) DDBJ Sequence Read Archive (DRA/ERA/SRA): NGS 由来の raw reads data DDBJ Trace Archive (DTA): Sanger 法由来の raw reads data DDBJ

2 登録データの種類とデータベース (DB) の選択 DDBJ は, 現在 3 種類の塩基配列 archive データベースを運営しています. 各々の DB は米国, 欧州と協調体制の下, 国際的な共同体 (INSDC) を構成しています. 各々の DB に登録公開された塩基配列データは, 共同体メンバーの各データバンクへ送付され,3 極間でデータを共有しています. 配列の性状や産生方法によって, データの登録先が異なりますので, 事前に内容をご確認の上, 該当する DB にデータを登録してください. DDBJ (DDBJ/EMBL-Bank/GenBank): 塩基配列登録システム ( 小規模 ) ; 大量登録システム :( 大規模 ) DDBJ Sequence Read Archive (DRA/ERA/SRA): NGS 由来の raw reads data DDBJ Trace Archive (DTA): Sanger 法由来の raw reads data DDBJ BioProject Database ( プロジェクト情報 ; 大規模塩基配列登録向け ) A. 塩基配列の登録事前に登録予定の配列が以下のどれに該当するのか確認し, 登録先を選択して下さい Nucleotide sequences Raw reads data 塩基配列登録システム (Web): 小規模登録向き MSS ( 大量登録 ): 多数エントリ, ゲノム, 転写物次世代シーケンサー (NGS) 由来 Sanger 法由来 Accession 番号発行 B. プロジェクトの登録 Accession 番号発行大規模塩基配列の登録では, 各 DB のエントリを相互に参照 Accession 番号発行大規模塩基配列の登録者向け全長ゲノム規模 (WGS,complete), 大規模転写物配列の登録登録者, 文献,grant, 配列の由来リソース情報 DDBJ MSS ( 大量登録システム ) とは 1. 特徴定型化したテキストファイルの利用による登録データ転送が簡便 (E メールや一般的な転送プロトコール利用 ) 大規模データの登録向き 2. 受付対象のデータ I. エントリ数 ( 登録する配列の数 ) が多い例 : 大規模転写物 (EST, HTC, TSA), ゲノム断片 (GSS, HTG), 特定の遺伝子や領域 (16S rrna, ITS-rRNA, ミトコンドリア由来 COXI など ), 1エントリあたり, 多数 ( 概ね30 以上 ) のBiological Featureを有する例 : オルガネラゲノム, プラスミド全長など II. 配列が長大 ( 概ね 500 kbp 以上 ) 例 : 全ゲノム規模データ, 長大な領域 ( 遺伝子クラスター ) など III. 塩基配列登録システムが対応していない登録例 : WGS,CONなど

査定作業 : 本登録登録者に修正内容を連絡 7. データの公開公開待ち登録完了 http://www.ddbj.nig.ac.jp/sub/mss_flow-j.

3 MSS における登録作業の流れ登録者 1. 登録依頼 2. 仮登録登録ファイルの作成 * データの一部 ( 数エントリ分程度 ) 配列ファイルアノテーションファイル申し込みフォーム DDBJ 返信 : 手順書, ツールの紹介 3. 査定作業 : 仮登録アノテーションの基本的方針を提案登録者に修正内容を連絡 4. 本登録登録ファイルの作成 * 全データ分配列ファイルアノテーションファイル 6. アクセッション番号発行コンタクトパーソンに通知 5. 査定作業 : 本登録登録者に修正内容を連絡 7. データの公開公開待ち登録完了 MSS を利用の前に (1) DDBJ のトップページ ( ) からの移動 1; DDBJ のトップページ登録をクリック 2; データ登録のページデータを受け付けるデータベースの一覧が表示されます Mass Submission System (MSS) をクリック

MSS の利用の前に (2) http://www.ddbj.nig.ac.jp/sub/mss_flow-j.html 3; Mass Submission System (MSS) とは MSS の登録の流れ, 登録に必要なファイル等についての説明が記載されていますので, ご利用の前に必ずお読みください MSS 申し込みフォーム http://www.ddbj.nig.ac.jp/sub/masssub-j.

4 MSS の利用の前に (2) 3; Mass Submission System (MSS) とは MSS の登録の流れ, 登録に必要なファイル等についての説明が記載されていますので, ご利用の前に必ずお読みください MSS 申し込みフォーム入力事項 1. MSS 利用経験の有無 2. コンタクトパーソン氏名, ,FAX 番号, 所属,URL 3. 登録担当者 ( コンタクトパーソンと同じ場合, 省力化 ) 4. 登録の概要登録件数, 公開予定日,Sequence technology, データの種別, 生物学的特徴 5. 補足情報

5 登録のために必要なファイル MSS の登録には, 基本的に 2 種類のファイルをご用意下さい. 1. 塩基配列ファイル FASTA 形式でエントリ毎に塩基配列を入力. 2. アノテーションファイル登録者, 所属, 連絡先, 文献, 塩基配列上の生物学的特徴 (Feature/Qualifier の情報 ) 等を記述. タブ区切りテキストファイル両ファイルは規定書式のテキストファイルです. スクリプト, 表計算ソフト, テキストエディタ等を使用し, 登録者側で作成します. データのタイプや必要に応じて以下のファイルをご用意下さい. 3. Quality score ファイル各塩基配列 (base call) に対する quality score を表示したファイル 4. AGP ファイル CON( 高次配列 ) エントリを構築するために, パーツとなる配列エントリ (primary entry) の引用情報 ( 引用領域配列の向き ) と gap の種類と長さを記載アノテーションファイル Entry,Feature,Location,Qualifier,Value の 5 つのカラムから構成 COMMON エントリ全エントリに共通する情報は COMMON エントリにまとめて記載することができます登録者 (SUBMITTER) REFERENCE 公開予定日 (DATE) など 1 件目のエントリエントリ名はそれぞれにユニークで, 配列ファイルの記載順序と一致させます 2 件目のエントリ

サンプルアノテーションファイル MSS サイト内で, サンプルアノテーションファイルを提供しています 1. データの種類の例タンパク質コード (CDS) 領域リボソーマル RNA ITS 領域マイクロサテライトマーカーミトコンドリアゲノム配列環境サンプル EST (Expressed Sequence Tag) 2.

6 サンプルアノテーションファイル MSS サイト内で, サンプルアノテーションファイルを提供しています 1. データの種類の例タンパク質コード (CDS) 領域リボソーマル RNA ITS 領域マイクロサテライトマーカーミトコンドリアゲノム配列環境サンプル EST (Expressed Sequence Tag) 2. サンプルファイルの形式 PDF 形式 ( 解説付き ) タブ区切りテキスト形式ひな型にしてアノテーションファイルの作成が可能塩基配列ファイル >ENT01 1 件目のエントリ名エントリ名は行頭の > に続けて入力します ggacaggctgccgcaggagccaggccgggagcaggtggtggaagacagacctgtaggtgg aagaggcttcgggggagccggagaactgggccagaccccacaggtgcaggctgccctgtc 1 件目の tgcgcttcagtcgtgggcgaagcctgaggaaaaagagagagaggctcaaggaagagagga 塩基配列 accgcactccagcctgggcgacagagtgagactccatctcaaaaaaaaaaaaaaaaaa // >ENT02 終端子 2 件目のエントリ名 ctcacacagatgctgcgcacaccagtggttgtaacaatgccgtttgcctccttcaggtct gaagcctgaggtgcgctcgtggtcagtgaagagggcaaaaagagagagaggctcaaagga 2 件目の tagtcattcatataaatttgaacacacctgctgtgcctagacaagtgtctttctgtaaga 塩基配列 gctgtaactctgagatgtgctaaataaaccctctttctcaaaaaaaaaaaaaaaa // 終端子 * エントリ名 : エントリ毎にユニークな文字列 ( 半角英数字 32 文字以内 ) 例 ) clone 名,isolate 名などの使用が一般的ですアノテーションファイルのエントリ名と一致させてください. エントリ名に対してアクセッション番号を発行. 終端子はエントリの終わりとしての認識記号. 入力時の注意 * 途中にスペース, 空行が入らないようにしてください * ベクター, リンカー, アダプターなどの人工配列は必ず除去してください * 配列末端の n は除去してください ( 特殊なケースを除く )

7 登録ファイルのチェックツール (UME) 構文チェックツール Parser を使用し, ファイルのフォーマットチェックを行ってください 2. タブを選択 3.Execute で実行 1. アノテーションファイルと配列ファイルを指定最新版を使用して下さい DDBJ 大量登録用ツール UME (Utilities for MSS Error check) Parser for unix, transchecker for unix Unix (Solaris) UME の主な機能データチェック機能 (Check タブ ) 1) 構文チェックツール Parser の機能構文とフォーマットを検証 2) transchecker の機能アミノ酸翻訳の可否とその配列を検証 ( 登録データが CDS feature を含む場合 ) 3) FFconv の機能擬似的なフラットファイルを作成 4) CON エントリの配列の構築 AGP ファイルとピースエントリの配列ファイルを用いて構築登録用ファイルの整形 (Process タブ ) Cleaner の機能余分な制御コードやスペースを削除 *UME には, 塩基配列とアノテーション, 並びに AGP ファイルを作成する機能は実装されていません. ゲノムデータの登録の受付パターン 1. Taxonomic Division(complete genome sequence) Complete genome; シーケンシング gap のない Finishing した配列 CDS,tRNA,rRNA 等のアノテーションが必須.locus_tag の使用 2. WGS (Whole Genome Shotgun) 原則, 冗長な raw read sequences ではなく, 種々 (de novo assembly, mapping base assembly 等 ) の方法によってつなぎ合わせたシーケンシング gap のない contig(overlapping reads) 配列. Finishing の途上 CDS 等のアノテーションの記載が可能. 未記載も可能 3. CON division シーケンシング gap を用いた断片配列の連結構造.scaffolds/supercontigs (assembled contigs separated by gaps) や, より上位の連結構造は,scaffold CON, または,chromosome CON エントリとして登録を受付 WGS エントリ ( 又は CON エントリ ) をピース (primary; 引用 ) エントリとして用い, シーケンシング gap を挿入したより長い ( 高次 ) 配列 CDS 等のアノテーションの記載が可能. 未記載も可能

8 NGS 由来ゲノム配列の登録 complete, WGS,CON Complete ゲノム配列 Finishing 配列 : 主にバクテリアゲノム. アノテーション必須 MSS で登録受付 Raw reads DNA seq (DRA に登録 ) MSS で登録受付 ;WGS, CON コンティグ (WGS) スーパーコンティグ (CON) assembly _gap assembly _gap assembly _gap assembly _gap assembly _gap assembly _gap アノテーションファイルの具体例微生物の complete ゲノム配列の登録 Entry Feature Location Qualifier Value COMMON SUBMITTER contact Hanako Mishima ( 中略 ) ENT01 source strain NM-1 登録配列全体の形状が環状で, 最初と最後の塩基が連続する場合に記載 TOPOLOGY mol_type organism genomic DNA Microcystis aeruginosa note strain coidentity: NBRC circular CDS gene dnaa /locus_tag は, 当該ゲノムの登録において割り当てられた prefix を使用し, CDS,tRNA,rRNA,ncRNA など遺伝子関連の feature 配下に記載します product chromosomal replication initiator protein DnaA codon_start 1 transl_table 11 locus_tag MLP_00010 trna product trna-ile locus_tag anticodon MLP_t0010 (pos: ,aa:asp) ncrna ncrna_class autocatalytically_spliced_intron locus_tag MLP_ncr0010

9 WGS エントリのアノテーションファイル contig 名以外が, すべて同じ内容の場合,COMMON フィールドにアノテーションを記載することが可能 ( 全件分の入力は不要 ) エントリ名に該当する箇所にメタ文字を使用して記載可能 CON エントリの登録に必要なファイル 1. アノテーションファイルエントリの共通情報, 生物学的特徴を記載. 2. 塩基配列ファイル ( 任意 ) FASTA 形式でエントリ毎に配列を入力. 3. AGP ファイル AGP ファイルには,CON エントリを構築する際のピースエントリの順序, 種類, 方向等が記載されます. gap の位置や長さを含め, このファイルの情報に基づいて CON エントリの配列は構築されます. 公開フラットファイル上に表示されます.

10 AGP ファイルの入力例 AGP ファイルには,CON エントリを構築する際のピースエントリの順序, 種類, 方向,gap 情報が記載されます AGP ファイルのフォーマットを,"UME" (Utilities for MSS Error check) でチェックすることが可能ですゲノム登録に必要なファイル一覧ファイルの種類アノテーション通常 (complete) WGS CON 必須必須必須塩基配列必須必須任意 Quality score * 例外となるケースもあり不要任意不要 AGP 不要不要必須

BioProject Database DDBJ MSS 登録先のデータベースが異なっても,Project ID を用いてデータを結びつけるゲノム規模, 大規模転写物配列の登録の際に必要とされる Project ID やゲノム配列のアノテーションに付加されます locus_tag prefix の申請を行います複数のデータベースに跨って登録される塩基配列データを関連付けます

表示例 : ABC_00001 (ABC が prefix に該当 ) 2. INSDC では prefix を一元的に管理し, 公開する /locus_tag の使用例 AP009256 Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 ゲノム配列 Feature Location locus_tag product CDS 1.

11 BioProject Database DDBJ MSS 登録先のデータベースが異なっても,Project ID を用いてデータを結びつけるゲノム規模, 大規模転写物配列の登録の際に必要とされる Project ID やゲノム配列のアノテーションに付加されます locus_tag prefix の申請を行います複数のデータベースに跨って登録される塩基配列データを関連付けます動画マニュアルも掲載していますのでご利用の前に閲覧して下さいデータは INSDC 間で交換し, 共有されます公開データ ( フラットファイル ) 上にも表記される locus_tag/qualifier 1. アノテーションや配列の更新時に, 遺伝子関連 Feature の tracking を目的に割り当てられる一意な tag. prefix+ 数字などで表記. 表示例 : ABC_00001 (ABC が prefix に該当 ) 2. INSDC では prefix を一元的に管理し, 公開する /locus_tag の使用例 AP Bifidobacterium adolescentis ATCC ゲノム配列 Feature Location locus_tag product CDS 該当 featureにidを BAD_0001 割り当てる CDS BAD_0002 CDS BAD_1630 CDS complement( ) BAD_1631 rrna complement( ) BAD_r0001 5SrRNA rrna complement( ) BAD_r S rrna rrna complement( ) BAD_r S rrna trna complement( ) BAD_t0001 trna-ala trna complement( ) BAD_t0002 trna-ala trna BAD_t0054 trna-thr chromosomal replication initiator protein DnaA DNA polymerase III, b subunit DnaN ribonuclease P protein component 50S ribosomal protein L34

12 BioProject の申請 (1) D-way 経由で Project ID の登録をできますログイン ID を取得後,Web 経由で申請します D-way へログイン新規のログイン ID の取得 BioProject の申請 (2) (1) (2) 登録者 ( 所属先 ) や外部リンク先などを入力配列のタイプや実験関連などを入力 (3) 配列の由来生物情報を入力 (4) grant, 文献等を入力

13 複数のデータベースに跨る塩基配列の登録の流れ大規模塩基配列エントリでは, 複数のデータベースに登録しそれぞれアクセッション番号の取得を求められる場合があります. ここでは代表的な例についてフローチャートを示します A) NGS 由来全長規模のゲノム配列 B) NGS 由来トランスクリプトーム (TSA データ ) A) NGS 由来ゲノム配列の登録手続きの流れ登録の手順 - 以下の手続きが必要です - 1 BioProject ID の取得 2 overlapping assembly を DDBJ-MSS で登録 3 discontiguous contig (CON) を DDBJ-MSS で登録 ( オプション ) 4 DRA へ raw reads data を登録 ( オプション ) D-way ログイン 1 BioProject DB (Project ID の取得 ) BioProject ID の発行 locus_tag prefix の取得 ( オプション ) 4 DRA (Raw reads を登録 ) アクセッション番号発行準備中 BioSample ( リソース情報を登録 ) 2 DDBJ-MSS Overlapping assembly を登録アクセッション番号発行 WGS, complete genome 3 DDBJ-MSS CON の登録アクセッション番号発行高次配列の登録

14 B) NGS 由来 TSA の登録手続きの流れ登録の手順 - 以下の手続きが必要です - 1 BioProject ID の取得 2 DRA へ raw reads data を登録 3 TSA を DDBJ-MSS で登録 D-way ログイン準備中 1 BioProject DB (Project ID の取得 ) アクセッション番号発行 2 DRA (Raw reads を登録 ) BioProject ID の発行 BioSample ( リソース情報を登録 ) 3 DDBJ-MSS TSA を登録アクセッション番号発行ゲノムエントリの公開データの例 Latimeria chalumnae ( シーラカンス ) のドラフトゲノム WGS (overlapping assembly) の公開データ複数のデータベースに跨ってデータ (DDBJ MSS, BioProject, DRA) を登録. WGS の公開データには,BioProject ID と DRA (raw reads data) のアクセッション番号を表示 WGS エントリのアクセッション番号 BioProject ID DRA (raw reads; Run Data) のアクセッション番号

15 登録の申し込みと問い合わせ登録の申し込みは下記のウェッブページより行って下さい. 大量登録システム (MSS) 利用申し込みご不明な点がございましたら, 下記のアドレス宛てにメールを送信して下さい. 参考資料 I. TSA (Transcriptome Shotgun Assembly) データの登録 II. Quality score

I. TSA (Transcriptome Shotgun Assembly) データの登録 TSA (Transcirptome Shotgun Assembly) とは EST アセンブルに相当する配列データは, 正しくアセンブルされておらず自然界に存在していない転写物配列を含んでいる可能性がありますが, 近年, その需要が高まってきました.

16 I. TSA (Transcriptome Shotgun Assembly) データの登録 TSA (Transcirptome Shotgun Assembly) とは EST アセンブルに相当する配列データは, 正しくアセンブルされておらず自然界に存在していない転写物配列を含んでいる可能性がありますが, 近年, その需要が高まってきました. アセンブルされた mrna 配列データを, Transcriptome Shotgun Assembly (TSA) division で受付ています. TSA エントリを登録するためには, その登録に先立ってアセンブリの元となる 1 次転写産物 (primary transcripts) の配列データ ( プライマリーエントリ ) が DDBJ/EMBL-Bank/GenBank の EST division, DDBJ Trace Archive, DDBJ Sequence Read Archive (DRA) の何れかに登録されている必要があります. ( 注意 ); プライマリーエントリが TSA 登録者と異なる登録者に帰属する配列データである場合は, TPA (Third Party Annotation) として扱います. cdna1 cdna2 cdna3 cdna4 Raw reads DNA seq (DRA) NGS 由来 TSA の概略 DDBJ MSS で登録受付コンティグ (TSA1) コンティグ (TSA2) コンティグ (TSA3) コンティグ (TSA4)

17 TSA の登録に必要なファイル 1. アノテーションファイル次世代シーケンサー由来の raw reads が primary ( 引用 ) エントリの場合,CONTIG 行での引用情報は不要 Sanger 法由来の EST が primary エントリの場合には, 引用エントリの情報 ( 引用エントリのアクセッション番号, 引用領域, 配列の向き ) が必要 CDS 等のフィーチャの入力が可能 2. 配列ファイル -FASTA 形式 - TSA エントリの登録例 Entry Feature Location Qualifier Value COMMON DIVISION division TSA Keyword と division を入力 KEYWORD keyword TSA keyword Transcriptome Shotgun Assembly DBLINK project Project ID と DRA エントリを入力 sequence read archive ( 中略 ) DRR FA0001 source organism Homo sapiens mol_type mrna tissue_type liver note contig: contigfa0001 CDS gene GAPD product glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase codon_start 1 FA0002 source organism Homo sapiens mol_type mrna contig 名を入力 tissue_type liver mol_type mrna note contig: contigfa0002

Quality score 各塩基位置における読み取り精度 quality score を表示したファイル. 登録に於いては任意のファイル Quality score の例 >ZZ000001.

18 Quality score 各塩基位置における読み取り精度 quality score を表示したファイル. 登録に於いては任意のファイル Quality score の例 >ZZ Phrap Quality (Length:959, Min:3, Max:66) ( 中略 ) //

Sequence Read Archive 2013 年年 10 月 25 日第 10 回シーケンサー利利用技術講習会 ( 理理研横浜 ) 1

Sequence Read Archive 2013 年年 10 月 25 日第 10 回シーケンサー利利用技術講習会 ( 理理研横浜 ) 1 Sequence Read Archive 1 塩基配列列データベースアノテーション DDBJ アセンブリ DDBJ Center アライメントシークエンシングとサンプリング Sequence Read Archive 2 増大する SRA データ千兆塩基目前 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/traces/sra/ 3 SRA は INSDC の一員 INSDC:

ゲノム配列の登録 ～大量登録システム(MSS) ～

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