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あいりかたづ
4 years ago
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1 NGS データ解析入門 Web セミナー : De Novo シークエンス解析編 1

2 NGS 新規ゲノム配列解析の手順シークエンス遺伝子領域の検出アセンブルデータベース検索 2

3 解析ワークフローと使用ソフトウェアシークエンスデータのインポートクオリティチェック前処理コンティグ配列の作成 CLC Genomics Workbench 遺伝子領域の検出 Blast2GO PRO データベース検索 3

4 CLC Genomics Workbench 4

コンティグ配列の作成 De Novo Assembly 遺伝子領域の検出 Find

5 CLC Genomics Workbench 使用ツールシークエンスデータのインポート NGS data import クオリティチェック前処理 Sample Reads Create Sequencing QC Report Merge Overlapping Pairs Trim Reads コンティグ配列の作成 De Novo Assembly 遺伝子領域の検出 Find Open Reading Frames Extract Annotations データベース検索 BLAST 5

シークエンスデータのインポート CLC Genomics Workbench, Biomedical Genomics Workbench ともにシークエンサー機種やファイルフォーマットに合せたインポートメニューを利用可能 Toolbar の Import アイコンから表示されるインポーターから選択してインポートを実行

6 シークエンスデータのインポート CLC Genomics Workbench, Biomedical Genomics Workbench ともにシークエンサー機種やファイルフォーマットに合せたインポートメニューを利用可能 Toolbar の Import アイコンから表示されるインポーターから選択してインポートを実行プラットフォーム Illumina PacBio Ion Torrent ファイル形式.txt.fastq.fq.qseq.bas.h5/.bax.h5.fastq.fq.fasta.fa.fna.sff.fastq.fq Ion Torrent の Unmapped BAM ファイルは Standard Import よりインポートを行う 6

7 High-Throughput Sequencing Import シークエンスデータファイル (FASTQ ファイルなど ) シークエンサー機種などに合わせてメニューを選択しシークエンスデータファイルを選択ペアエンドシークエンスデータのインポートにも対応 7

8 High-Throughput Sequencing Import シークエンスデータがインポートされ各種解析に使用できるようになる各リードの塩基配列やクオリティスコアなどを確認できる 8

9 クオリティチェック前処理クオリティチェックではインポートしたシークエンスデータに対してクオリティチェックレポートの作成や低クオリティリードの除去などを行う必要に応じてペアリードの結合やシークエンスデータのサンプリングなどのコンティグ作成前の前処理を行うクオリティチェック用ツール Create Sequencing QC Report インポートしたシークエンスデータのクオリティや PCR Duplicate の状況などを確認するためのレポートを作成 Trim Reads アダプターの除去クオリティスコアによる除去長さを指定した除去などを選択組み合わせてリードのトリミングを実行前処理用ツール Sample Reads シークエンスデータのサンプリングを行う Merge Overlapping Pairs オーバーラップしているペアリード同士の結合を行う 9

10 Create Sequencing QC Report Create Sequencing QC Reportではシークエンスデータのクオリティ情報をまとめたレポートが作成される GC 含量やクオリティスコア分布などのグラフデータや数値データを確認が可能 10

11 Trim Reads Trim Readsの使用により各リードの低クオリティ部分がカットされるその他アダプター配列の除去なども可能 11

12 Sample Reads シークエンスデータのリード配列数を減らす設定が可能シークエンスデータのデータ量がサンプルのゲノムサイズより極端に大きい場合は De Novo Assembly 実行前に本ツールでデータ量を最適な値 ( ゲノムサイズの30x) に揃える必要がある 12

13 Merge Overlapping Pairs オーバーラップ領域 Forward リード Reverse リード Merged リードペア同士のForward / Reverseリード配列間のオーバーラップ領域をマージし一つのリード配列に統合するペアエンドシークエンスを行っておりかつペアリード配列同士がオーバーラップする場合のみこの処理が必要となる先にTrim Readsを実行している場合各リード配列の末端部分がトリミングされマージが上手く実行できない場合もあるので注意する 13

コンティグ配列の作成リード配列データのクオリティチェック前処理が終了したら De Novo Assembly によってコンティグの作成を行うコンティグのカバレッジやリード配列のバリアントなどを確認したい場合は作成コンティグに対してリード配列データのマッピングを実行する De

14 コンティグ配列の作成リード配列データのクオリティチェック前処理が終了したら De Novo Assembly によってコンティグの作成を行うコンティグのカバレッジやリード配列のバリアントなどを確認したい場合は作成コンティグに対してリード配列データのマッピングを実行する De Novo Assembly ショートリードデータを用いてゲノム配列のアセンブルを実行する ( ロングリードおよびトランスクリプトーム配列のアセンブルは非対応 ) Map Reads to Contigs コンティグ配列を参照ゲノム配列として使用しリード配列のマッピングを行う 14

15 De Novo Assembly Word size (K-mer) 設定マッピング実行の設定 Scaffolding 設定パラメータ設定画面ではアセンブル実行時のWord size (K-mer) の値やペアリード使用時のScaffolding さらにアセンブルと同時にマッピングも行うかどうかなどの設定を行うことができる 15

16 De Novo Assembly Simple Contigs Mapping data Simple Contigs を選択した場合各コンティグが一覧になって表示されそのまま配列解析用ツールに使用することが可能アセンブル結果の統計値 ( コンティグ配列の最長塩基数や N50 など ) をまとめたレポートも出力される 16

遺伝子領域の検出ゲノムシークエンスデータより作成したコンティグ配列には非遺伝子領域の配列も含まれておりそのままではデータベース検索に使用できないためコンティグ上の遺伝子領域を検出しその領域のみの配列データを作成する必要がある CLC Genomics Workbench では本機能については基本的に原核生物ゲノム配列の解析しか実行できないため真核生物ゲノムの解析には Biobam

17 遺伝子領域の検出ゲノムシークエンスデータより作成したコンティグ配列には非遺伝子領域の配列も含まれておりそのままではデータベース検索に使用できないためコンティグ上の遺伝子領域を検出しその領域のみの配列データを作成する必要がある CLC Genomics Workbench では本機能については基本的に原核生物ゲノム配列の解析しか実行できないため真核生物ゲノムの解析には Biobam 社 Blast2GO PRO ソフトウェアを使用する Find Open Reading Frames 配列データ上の ORF (Open Reading Frame) 領域を検出してアノテーション付加を行う ( 真核生物ゲノムのようなエクソンイントロン構造をもつ配列データには非対応 ) Extract Annotations 配列データ上の任意のアノテーション領域の配列の抽出を行う 17

18 Find Open Reading Frames Find Open Reading Frames を実行するともとの配列データ上に ORF 領域を示すアノテーションが追加される用いるスタートコドンやストランドなどの各種パラメータ設定を調整することが可能 18

19 Extract Annotations Extract Annotations では配列データ上の任意のアノテーション領域の配列を抽出することができる 19

データベース検索抽出された各遺伝子配列に対し BLAST で相同性検索を実行することで各遺伝子の機能情報などを取得する CLC Genomics Workbench では BLAST ツールの他検索に用いるデータベースのダウンロードやカスタム作成用のツールが搭載されている BLAST ローカルコンピュータを使用して BLAST 検索を行う BLAST at NCBI NCBI

20 データベース検索抽出された各遺伝子配列に対し BLAST で相同性検索を実行することで各遺伝子の機能情報などを取得する CLC Genomics Workbench では BLAST ツールの他検索に用いるデータベースのダウンロードやカスタム作成用のツールが搭載されている BLAST ローカルコンピュータを使用して BLAST 検索を行う BLAST at NCBI NCBI サーバーで BLAST 検索を行う Download BLAST Database NCBI などで公開されている様々なカテゴリーごとに分類されたターゲット配列をダウンロードする Create BLAST Database 配列データを BLAST 解析用の Database データとして登録する Manage BLAST Database 登録した Database データの管理を行う 20

21 データベースの作成ローカル BLAST を使用する場合 Download BLAST Databases で nr/nt などのデータベースをダウンロードしたりカスタム作成の配列データを Create BLAST Databases でデータベース登録が可能 21

22 BLAST ローカル BLAST のパラメータ設定画面では BLAST プログラム (BLASTN や BLASTP など ) の選択とターゲットの BLAST database の種類などを指定する 22

23 BLAST BLAST に使用したクエリー配列ごとにヒットしたターゲット配列数とその中で一番相同性が高い配列の詳細情報などがテーブル表示されるテーブルの各行をダブルクリックすると二番目以降にヒットしたターゲット配列も確認が可能 23

24 Blast2GO PRO 24

25 Blast2GO Pro Gene Ontology Annotation BLAST と InterProScan による配列データへのアノテーション付け取得した Gene Ontology 情報を使用した遺伝子機能エンリッチメント解析やグラフ作成 Genome Characterization 真核生物ゲノム用 Augustus と原核生物用 Glimmer プログラムを用いた配列データ内の遺伝子領域予測 RNA-seq FASTQ ファイルのクオリティチェック (FastQC) とトリミング RNA-Seq De Novo Assembly (Trinity) 新規転写物の発現量測定 (Fasta+Fastq) とサンプル間比較解析 Volcano Plot や MA plot Heatmap などのグラフ作成 25

26 遺伝子領域の検出 De Novo Assembly で作成したコンティグ配列などの DNA 配列データを用いて配列内の遺伝子やタンパク質コード領域を予測原核生物と真核生物解析用の 2 種類のプログラムを搭載真核生物用プログラム (Augustus) 原核生物用プログラム (Glimmer) 26

27 Eukaryotic GeneFinding 真核生物ゲノム用プログラムでは実行時に近縁生物種や RNA-Seq マッピングデータを参照することが可能 27

28 Eukaryotic GeneFinding 解析が終了すると遺伝子領域の詳細をまとめた GFF ファイルと CDS 配列リストさらに解析結果をまとめたレポートが出力される 28

29 Eukaryotic GeneFinding GFF ファイルは専用のビューワーでエクソン / イントロンなどの遺伝子構造を表示可能 29

30 Eukaryotic GeneFinding CDS 配列リストは配列名をまとめたテーブルと DNA 配列またはアミノ酸配列のビューワーが表示される 30

CloudBlast Biobam 社専用のクラウドサーバー上で BLAST を安全にかつ高速に実行する (Computation Units

31 データベース検索 CLC Genomics Workbench と同様に NCBI BLAST と Local BLAST を使用できる他高速なクラウドベースの BLAST ツール CloudBlast も使用可能 Local BLAST 用のデータベース作成機能も搭載 CloudBlast Biobam 社専用のクラウドサーバー上で BLAST を安全にかつ高速に実行する (Computation Units を消費 ) NCBI Blast NCBI サーバーで BLAST 検索を行う Local Blast ローカルコンピュータを使用して BLAST 検索を行う 31

32 CloudBlast どの BLAST を使用する場合でも BLAST プログラムと BLAST データベースを設定する CloudBlast と NCBI Blast ではレディメイドの BLAST データベースを使用するが Local Blast ではユーザー定義のデータベースを作成する必要がある 32

33 CloudBlast BLAST を実行すると CDS 配列リストに各配列のトップヒット配列の情報が表示される Blast Result ビューでヒットした配列の詳細情報を確認が可能 33

34 データベース検索後は BLAST 実行後はヒットした配列の詳細情報をグラフ化や Gene Ontology などの遺伝子機能解析が可能 34

35 お問い合わせ先 : フィルジェン株式会社 TEL (9:00~17:00) FAX biosupport@filgen.jp 35

NGSデータ解析入門Webセミナー

NGSデータ解析入門Webセミナー NGS データ解析入門 Web セミナー : RNA-Seq 解析編 1 RNA-Seq データ解析の手順遺伝子発現量測定シークエンスマッピングサンプル間比較機能解析など 2 CLC Genomics Workbench 使用ツールシークエンスデータメタデータのインポート NGS data import Import Metadata クオリティチェック Create Sequencing