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あゆみはまもり
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1 Jpn. J. Clin. Immunol., 37 (3)133~138 (2014)C 2014 The Japan Society for Clinical Immunology 133 総説中枢性及び末梢性免疫寛容における Aire の働き花房崇明 Function of Aire in central and peripheral immune tolerance Takaaki Hanafusa Postdoctoral Fellow, Laboratory of Dr. Mark S Anderson, Diabetes Center, University of California, San Francisco (Accepted April 3, 2014) summary Negative selection induces central tolerance in which self-reactive T cells are deleted by medullary thymic epithelial cells (mtecs) to prevent autoimmunity. The transcriptional factor, autoimmune regulator (Aire), controls the expression of tissue-specific antigens (TSAs) by mtecs for negative selection. The mechanisms by which Aire targets loci which encode TSAs are unknown in detail; recently, however, the ATF7ip-MBD1 complex was identified as an Aire-interacting transcriptional protein complex required for its targeting the loci. Lineage tracing of Aire + mtecs identified that mtecs have a post- Aire stage during the development, where they lost maturation markers but maintained intermediate TSA expression, and Aire is required for the terminal differentiation of mtec s. Extrathymic Aire-expressing cells (etacs) are identified in murine and human secondary lymphoid organs. etacs express major histocompatibility complex class II hi, CD80 lo, CD86 lo, epithelial cell adhesion molecule hi, CD45 lo bone marrow-derived peripheral antigen-presenting cell population, which is distinct from mtecs and dendritic cells. They can induce activation-induced cell death of self-reactive CD8 + T cells and unresponsiveness of self-reactive CD4 + T cells through a mechanism that does not require regulatory T cells, suggesting that peripheral Aire plays a complementary role for central tolerance. Key words autoimmune disease; immune tolerance; autoimmune regulator; thymic epithelial cell; extra-thymic Aire expressing cell 抄録自己反応性 T 細胞が胸腺において負の選択 (negative selection) によって除去されることで, 中枢性免疫寛容は維持され自己免疫疾患の発症は回避されている.Aire(autoimmune regulator) は主に胸腺髄質上皮細胞 (mtec) の核内に発現する転写調節因子である.Aire が ATF7ip-MBD1 複合体など他の転写調節因子と協調することで, mtec が末梢特異抗原 (TSA) を発現し,TSA が自己反応性 T 細胞に抗原提示され,negative selection が成立する.Aire は mtec の分化にも関与しており,mTEC は Aire の発現消失後も post-aire expressing stage を持つことが Lineage tracing によって, 最近明らかになっている. また胸腺外の二次リンパ組織でも Aire を発現する etac (extra-thymic Aire expressing cell) がヒトとマウスにおいて同定されている.eTAC は Aire 依存性に mtec とは異なる独自の TSA を発現し,mTEC による中枢性免疫寛容と相補的な末梢性免疫寛容を誘導している. 骨髄由来である etac は mtec や樹状細胞 (DC) とは異なる新規の抗原提示細胞と考えられている. はじめに自己免疫疾患は, 自己と非自己の識別機構に異常カリフォルニア大学サンフランシスコ校糖尿病センター Mark S Anderson 研究室所属日本学術振興会海外特別研究員が生じ, 免疫寛容が破綻することで発症する. 胸腺内では, 自己反応性 T 細胞が負の選択 (negative selection) によって除去され, 中枢性免疫寛容 (central tolerance) が成立する.Autoimmune regulator(aire) は Aire 遺伝子によって encode されるタンパクであり, 負の選択のために, つまり臓器特異的自己免疫反応を回避するために重要な役割を果たす. 胸腺は皮質と髄質に分けられるが,Aire は主に胸腺の間質を構成する胸腺髄質上皮細胞 (medullary thymic epithelial cell: mtec) の核内に発現する転写調節因子である. 胸腺内では,Aire 依存性に多数の末梢組織特異抗原 (tissue-restricted self-antigen; TSA) を mtec が発現し, それらを認識する自己反応性 T 細胞が negative selection によって除去され

2 134 日本臨床免疫学会会誌 (Vol. 37 No. 3) る ( 図 1 ) 1). 近年,Aire は TSA の転写調節因子としての役割に加え,mTEC の成熟過程においても重要な役割を果たしている可能性があることが分かってきた 2). またヒトとマウスにおいて胸腺外の末梢二次リンパ組織にも Aire を発現する extra-thymic Aire expressing cell(etac) 細胞が同定され,eTAC は mtec と同様に免疫寛容において重要な役割を果たすことが分かってきた 3, 4). 本稿では,TSA の転写調節因子としての及び mtec の分化誘導因子としての Aire の役割と, 近年同定された etac について概説したい. APECED Aire 遺伝子は常染色体劣性遺伝形式をとる自己免疫性多内分泌腺症カンジダ症外胚葉ジストロフィー (autoimmune polyendocrinpathy-candidiasisectodermal dystrophy; APECED) あるいは自己免疫性多内分泌腺症 1 型 (autoimmune polyendocrinopathy type 1: APS type 1) の原因遺伝子としてクローニングされた 5, 6).APECED はフィンランドに多くの疾患家系が存在する,21 番染色体 (21q22.3) 上の Aire 遺伝子欠損による単一遺伝子疾患である. APECED の症状としては, 副甲状腺機能低下症, 副腎皮質機能低下症 (Addison 病 ), 1 型糖尿病などの自己免疫性多腺性内分泌疾患口腔カンジダ症, 食道カンジダ症状などの皮膚粘膜カンジダ症歯牙のエナメル質形成不全, 爪形成不全などの外胚葉形成不全症があり, 確定診断は Aire 遺伝子の変異によって行われる 7). 皮膚粘膜カンジダ症は IL-17 や IL-22 などの Th17 サイトカインに対する自己抗体が産生されることが原因と考えられている 8).Aire 欠損マウスにおいては,mTEC における TSA の発現が著明に低下し, ヒトの APECED と同様に 1 型糖尿病など様々な臓器特異的な自己免疫疾患を発症することが分かっている 9). そのため,Aire 欠損マウスは APECED のモデルマウスとして用いられ, 自己免疫疾患の発症機序における Aire の役割の解析が進められている. Aire と Treg 自己反応性 T 細胞を除去するという負の選択に加え,mTEC は制御性 T 細胞 (Treg) を産生する働きを持つ.Treg は負の選択から漏れ出した末梢の自己反応性 T 細胞を制御する働きを持つ.Foxp3 (forkhead box P3) は, 制御性 T 細胞 (Treg) に選択的に発現する転写調節因子であり,Aire と同様に免疫寛容の誘導において重要な働きを担っている. Foxp3 遺伝子が欠損すると Treg 欠損機能異常が起こり,IPEX 症候群 (immune dysregulation, polyendocirnopathy, X-linked) が生じる 10). ヒトにおいては,APECED の症例で Treg の数が減少しその免疫抑制機能が低下しているという報告があるが 11), Aire 欠損マウスでは Treg の数や機能に異常は無く, Treg の T 細胞受容体 (TCR) のレパトアにも変化が無いという報告と 12, 13),Aire + mtec が Treg の分化に関与しているという報告があり 14, 15),Treg の分化における Aire の役割については, 更なる検討が必要である. 図 1 mtec における転写因子としての Aire の働き転写調節因子である Aire は,mTEC の核内で発現し, 他の転写制御因子 ( 図中灰色楕円形 ) と複合体を形成し, 組織特異抗原 (TSA) の発現を増強させている. これらの TSA が mtec によって直接, あるいは胸腺内樹状細胞 (DC) によって取り込まれ処理された後に,CD4 + T 細胞及び CD8 + T 細胞に抗原提示されることで, 自己反応性 T 細胞が除去される. 文献 1 より改変.

3 Aire 135 Aire の転写調節因子としての役割 Aire は TSA の転写調節因子として働くと考えられているが, その詳細な分子メカニズムが徐々に明らかになってきている.Aire は 58 kda のタンパクであり,HSR/CARD(homogeneously staining region/ caspase recruitment domain) を介して 670 kda 以上のオリゴマーを形成し機能する 16 18) ( 図 2 ). 最近になり Aire は他の典型的な転写因子のように標的遺伝子のプロモーター領域の特定の配列に結合することで転写を活性化させるのではなく, 様々な転写調節因子と相互作用し, エピジェネティックに TSA の遺伝子発現を制御していることが分かってきた.Aire が転写調節因子である CBP(transcriptional coactivator CREB-binding protein) や転写伸長因子である P-TEFb(positive transcription elongation factor b) と相互作用し,RNA ポリメラーゼを活性化することで TSA の転写伸張反応を促進するという報告 19 21), Aire が PHD(plant homology domain)1 を介して, TSA のプロモーター領域の遺伝子抑制マークである非メチル化 H3K4(histone H3 tails with hypo methylation at Lys4; H3K4me0) を認識することで,TSA の発現を選択的に誘導するという報告 22 24),PHD1 を介して DNA-PK(DNA-dependent protein kinase) を含むタンパク複合体と結合することで,RNA ポリメラーゼによる TSA の転写が開始されるという報告 18) などがあり,Aire は多様な転写調節作用を持つと考えられている. また 2014 年 Waterfield らは,Aire が SAND(Sp100, AIRE-1, NucP41/75, and DEAF-1; TAD, transcriptional activation domain) を介して, メチル化された CpG 配列を認識する ATF7ip- MBD1(activating transcription factor 7 interacting protein, methyl CpG binding protein 1) 複合体と協調し, プロモーター領域の CpG 配列がメチル化され, その発現が抑制されている TSA を選択的に発現誘導する可能性を報告している 25). mtec の分化と Aire 最近の CreER-loxP システムを用いた lineage tracing によって,Aire+ mtec にはその成熟過程で Aire 発現後に Aire の発現が消失する post-aire stage があることが分かってきた.Post-Aire mtec では MHC- Class II,CD80,CD86 といった maturation marker の発現は低下するものの, 中等度の TSA の発現は依然続いており,Post-Aire mtec も免疫寛容に関して何らかの働きをもっているものと考えられている 26) ( 図 3 ). また松本らは Aire 欠損 mtec では通常の Aire + mtec に比べ, 樹状突起の形成に乏しく丸みを帯び,mTEC が terminal differentiaion において発現すると考えられているハッサル小体の形成が不良であることや 27),Aire 欠損 mtec では post-aire mtec において CD80 の発現が低下せずに強いままであり, Aire 欠損 mtec では正常な mtec の分化プロセスがとられていないことを示した 28). これらのことから彼らは Aire 遺伝子単一が mtec における多数の TSA の発現を制御しているという従来の考え方に加え,Aire が mtec の分化誘導作用を持ち,Aire 欠損にともなう mtec の分化障害が二次的に TSA 遺伝子の発現低下をもたらす可能性を示している 29, 30). 図 2 Aire タンパクの domain 構造と Aire の協調因子 Aire は HSR を介してオリゴマー化することで機能する. また HSR は CARD としても働く可能性がある. タンパクを核内へ移行させる NLS も同定されている.Aire は ATFip7-MBD1 複合体,DNA-PK,TAD,P-TEFb などと協調して末梢特異抗原の発現を制御している. また Aire は遺伝子抑制と関連するヒストンマークである H3K4me0 とも結合することで, 末梢特異抗原の発現を調節していると考えられている. 文献 18, 25 より改変. HSR: homogeneously staining region, CARD: caspase recruitment domain, NLS: Nuclear localization signal, SAND: Sp100, AIRE-1, NucP41/75, and DEAF-1: TAD, transcriptional activation domain, PHD: plant homology domain, PRR: proline-rich region, TAD: transcriptional activation domain, ATFip7: activating transcription factor 7 interacting protein, MBD-1: methyl CpG binding protein 1, H3K4me0: histone H3 tails with hypomethylation at Lys4, DNA-PK: DNA-dependent protein kinase, P-TEFb: positive transcription elongation factor b.

4 136 日本臨床免疫学会会誌 (Vol. 37 No. 3) 図 3 胸腺内における mtec の分化 Aire + mtec は Pre-Aire mtec(aire MHC class II low CD80 ) から分化する. その後,Aire + mtec は成熟マーカーである MHC class II と CD80 を強く発現し Aire 依存性に末梢特異抗原を発現する (Aire + MHC class II high CD80 high ). Aire + mtec は Post-Aire mtec へと分化し,Aire を発現しなくなる.Post-Aire mtec の成熟マーカーの発現は低下するが (MHC class II low CD80 low-inter ), 中等度の末梢特異抗原の発現は持続する. 文献 26, 30 より改変. etac 近年の研究で,Aire が様々な末梢組織で発現していることが明らかになっているが, その多くは mrna レベルでの発現についての報告であり, その全てでタンパクレベルでの Aire の発現が確認されている訳ではない 31). またリンパ節の fibroblastic reticular cell やリンパ管内皮細胞が Aire 非依存性に TSA を発現し, 末梢性免疫寛容を誘導しているという報告もある 32 35). こうした中,2008 年 Gardner らは,Aire-GFP(green fluorescent protein) レポーターマウスを用いて,GFP 陽性細胞つまり Aire 発現細胞が, 胸腺以外のリンパ節や脾臓などの二次リンパ組織にも存在することを報告し, 彼らはその細胞を etac と名付けた.eTAC は mtec と同様に Aire 依存性に多様な TSA を発現し, 自己反応性 CD8 陽性 T 細胞を activation-induced cell death に誘導することで末梢での免疫寛容を誘導している可能性を明らかにした.eTAC は樹状細胞 (dendritic cell; DC) や mtec に近い遺伝子発現プロファイルを有しているが,eTAC が発現する TSA は mtec が発現する TSA とは異なっており,eTAC は独自の免疫寛容を誘導する新規の細胞集団であることが示唆されていたが, その特徴は不明な点が多かった 3).2013 年 Gardner らは,eTAC について以下のような新知見を報告している.mTEC が内胚葉由来の間質細胞であるのに対して,eTAC は骨髄由来であり,eTACs は DC lineage が発現する転写因子 Zbtb46 36) を発現し,MHC class II high であるが,CD11c low,cd45 low, CD80 low であり,CD11c +,CD45 +,CD80 + DC や CD 11c,CD45.CD80 + mtecs と異なる細胞表面マーカーの発現パターンをしており, 既存の DC や mtec とは異なる抗原提示細胞 (antigen-presenting cell; APC) である ( 図 4 ). etac はヒトのリンパ節でも同定され, マウスと同様に,T 細胞領域である傍皮質と B 細胞領域である濾胞の境界に etac は存在し, 免疫染色において MHC-class II 陽性であるものの CD11c,CD45,CD11b はマウスの場合と同様に染色されない.eTAC は自己反応性 CD4 陽性 T 細胞を unresponsive な状態にすることで免疫寛容を導く. その免疫寛容の機序は Treg 非依存性であり,eTAC が MHC class II を強発現する一方で, Co-stimulatory molecule( 細胞共刺激分子群 ) である CD80 と CD86 の発現が弱いことが免疫寛容を誘導している可能性がある. こういったことから彼らは, etac による末梢性免疫寛容が胸腺での mtec による中枢性免疫寛容と相補的な役割を担っているのではないかと考えているが,eTAC の分化,eTAC における Aire の役割の詳細などは明らかになっていない点が多い 4).

5 Aire 137 図 4 mtec と etac の比較 mtec は内胚葉由来の間質細胞であり,CD45, CD11c, MHC class II +, CD80 +, CD86 + である.mTEC は Aire 依存性に末梢組織特異抗原を発現し自己反応性 T 細胞を除去することで中枢性免疫寛容を誘導している. 一方 etac は骨髄由来であり, リンパ節や脾臓などの二次リンパ組織に存在し,CD45 low, CD11c low, MHC class II high, CD80 low, CD86 low である.eTAC は Aire 依存性に mtec とは異なる末梢特異抗原を発現し, 自己反応性 CD8 陽性 T 細胞を activation-induced cell death に, 自己反応性 CD4 陽性 T 細胞を unresponsiveness にすることで末梢性免疫寛容を誘導しており, 両者は相補的な役割を担っていると考えられている. 最後に自己免疫疾患の発症原因は不明な点が多く, 根本的な治療が無いのが現状である.Aire は単一遺伝子疾患である APECED の原因遺伝子であるが,mTEC での中枢性免疫寛容及び etac での末梢性免疫寛容における Aire の働きの詳細を明らかにすることで, 自己免疫疾患の病態が解明され, 新規治療法の発見につながることが期待される. 文 1) Anderson, M.S., Su, M.A.: Aire and T cell development. Curr Opin Immunol. 23: , ) Matsumoto, M., et al.: Which model better fits the role of aire in the establishment of self-tolerance: the transcription model or the maturation model? Front Immunol. 4: 210, ) Gardner, J.M., et al.: Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321: , ) Gardner, J.M., et al.: Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4(+) T cells. Immunity. 39: , ) Nagamine, K., et al.: Positional cloning of the APECED gene. Nat Genet. 17: , ) Finnish-German, A.C.: An autoimmune disease, APECED, caused by mutations in a novel gene 献 featuring two PHD-type zinc-finger domains. Nat Genet. 17: , ) Kisand, K., Peterson, P.: Autoimmune polyendocrinopathy candidiasis ectodermal dystrophy: known and novel aspects of the syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1246: 77 91, ) Kisand, K., et al.: Chronic mucocutaneous candidiasis in APECED or thymoma patients correlates with autoimmunity to Th17-associated cytokines. J Exp Med. 207: , ) Anderson, M.S., et al.: Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298: , ) Bennett, C.L., et al.: The immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3. Nat Genet. 27: 20 21, ) Kekalainen, E., et al.: A defect of regulatory T cells in patients with autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy. J Immunol. 178: , ) Anderson, M.S., et al.: The cellular mechanism of Aire control of T cell tolerance. Immunity. 23: , ) Daniely, D., et al.: Diversity of TCRs on natural Foxp3+ T cells in mice lacking Aire expression. J Immunol. 184: , ) Aschenbrenner, K., et al.: Selection of Foxp3+ regulatory T cells specific for self antigen expressed

6 138 日本臨床免疫学会会誌 (Vol. 37 No. 3) and presented by Aire+ medullary thymic epithelial cells. Nat Immunol. 8: , ) Malchow, S., et al.: Aire-dependent thymic development of tumor-associated regulatory T cells. Science. 339: , ) Bjorses, P., et al.: Localization of the APECED protein in distinct nuclear structures. Hum Mol Genet. 8: , ) Halonen, M., et al.: APECED-causing mutations in AIRE reveal the functional domains of the protein. Hum Mutat. 23: , ) Zumer, K., et al.: The mechanism of tissue-restricted antigen gene expression by AIRE. J Immunol. 190: , ) Pitkanen, J., et al.: The autoimmune regulator protein has transcriptional transactivating properties and interacts with the common coactivator CREB-binding protein. J Biol Chem. 275: , ) Oven, I., et al.: AIRE recruits P-TEFb for transcriptional elongation of target genes in medullary thymic epithelial cells. Mol Cell Biol. 27: , ) Giraud, M., et al.: Aire unleashes stalled RNA polymerase to induce ectopic gene expression in thymic epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109: , ) Org, T., et al.: The autoimmune regulator PHD finger binds to non-methylated histone H3K4 to activate gene expression. EMBO Rep. 9: , ) Koh, A.S., et al.: Aire employs a histone-binding module to mediate immunological tolerance, linking chromatin regulation with organ-specific autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105: , ) Abramson, J., et al.: Aire s partners in the molecular control of immunological tolerance. Cell. 140: , ) Waterfield, M., et al.: The transcriptional regulator Aire coopts the repressive ATF7ip-MBD1 complex for the induction of immunotolerance. Nat Immunol. 15: , ) Metzger, T.C., et al.: Lineage tracing and cell ablation identify a post-aire-expressing thymic epithelial cell population. Cell Rep. 5: , ) Yano, M., et al.: Aire controls the differentiation program of thymic epithelial cells in the medulla for the establishment of self-tolerance. J Exp Med. 205: , ) Nishikawa, Y., et al.: Temporal lineage tracing of aire-expressing cells reveals a requirement for aire in their maturation program. J Immunol. 192: , ) Matsumoto, M.: Contrasting models for the roles of Aire in the differentiation program of epithelial cells in the thymic medulla. Eur J Immunol. 41: 12 17, ) Matsumoto, M.: Role of aire in the development of autoimmune disease. Arerugi. 62: 20 24, ) Hubert, F.X., et al.: A specific anti-aire antibody reveals aire expression is restricted to medullary thymic epithelial cells and not expressed in periphery. J Immunol. 180: , ) Nichols, L.A., et al.: Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179: , ) Lee, J.W., et al.: Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8: , ) Cohen, J.N., et al.: Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. J Exp Med. 207: , ) Fletcher, A.L., et al.: Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. J Exp Med. 207: , ) Satpathy, A.T., et al.: Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. J Exp Med. 209: , 2012.

今後の展開現在でも自己免疫疾患の発症機構については不明な点が多くあります今回の発見により今後自己免疫疾患の発症機構の理解が大きく前進すると共に今まで見過ごされてきたイントロン残存の重要性が生体反応の様々な局面で明らかにされることが期待されます図 1 Jmjd6 欠損型の胸腺をヌードマウス

今後の展開現在でも自己免疫疾患の発症機構については不明な点が多くあります今回の発見により今後自己免疫疾患の発症機構の理解が大きく前進すると共に今まで見過ごされてきたイントロン残存の重要性が生体反応の様々な局面で明らかにされることが期待されます図 1 Jmjd6 欠損型の胸腺をヌードマウス PRESS RELEASE(2015/11/05) 九州大学広報室 819-0395 福岡市西区元岡 744 TEL:092-802-2130 FAX:092-802-2139 MAIL:koho@jimu.kyushu-u.ac.jp URL:http://www.kyushu-u.ac.jp 免疫細胞が自分自身を攻撃しないために必要な新たな仕組みを発見 - 自己免疫疾患の発症機構の解明に期待 -

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