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1 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Non Radioisotopic Kit for Measuring PKA and PKC Activities MESACUP Protein Kinase Assay Kit CODE No.5230 MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD Marunouchi 3 chome, Naka-ku Nagoya Japan TEL; (052) , FAX; (052) , URL

2 1. Introduction Phosphorylation and dephosphorylation of proteins, which are catalyzed by protein kinases and protein phosphatases respectively, were reported to regulate major cell functions (1-5). Therefore the measurement of kinase activities is indispensable for study of cell function. The radioactive method which utilizes radioactive ATP is presently used for measuring protein kinase activities. However, there are inherent drawbacks to this method. These involve limitation of installation and affection of cold ATP in the samples. MBL has developed the MESACUP Protein Kinase Assay Kit to provide a simple, reliable and non-radioactive method for measuring the activities of camp-dependent protein kinase (PKA) and protein kinase C (PKC). The kit is based on an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) that utilizes a synthetic peptide and a monoclonal antibody recognizing the phosphorylated form of the peptide (Fig. 1). This method is as sensitive as the radioactive one and is less affected by concentrations of ATP present in the reaction mixture. The assay can be performed on crude cell extracts, column fractions or purified enzymes. The assay kit is of value for purification of PKA/PKC screening of inhibitors or activators of PKA/PKC detecting pharmacological effects on PKA/PKC. 1

3 Fig.1 MESACUP Protein Kinase Assay Kit PKA or PKC present in samples catalyze phosphorylation of the PS peptide that is coated on the microwells. The biotinylated monoclonal antibody 2B9 binds to the phospho-ps peptide and is subsequently detected with streptavidin conjugated to peroxidase. A peroxidase substrate is then added to the microwell and the intensity of the color is measured photometrically at 492 nm. 2

4 2. Assay Methodology Users are recommended to read this entire section before starting the assay. (1) Contents of the MESACUP Protein Kinase Assay Kit The assay kit contains the following components. 1) Microwell strips coated with PS peptide 8 wells x 12 strips 2) 10 x Sample preparation buffer concentrate 10 ml x 1 3) Reaction buffer 1.5 ml x 3 4) Calcium solution (20 mm CaCl2) 1.5 ml x 1 5) Phosphatidylserine (PS) (500 μg/ml) 1.2 ml x 1 6) Biotinylated antibody 2B9 6.0 ml x 2 7) POD-conjugated streptavidin 6.0 ml x 2 8) 10 x Wash concentrate (10 x PBS(-)) 50 ml x 2 9) Substrate A (o-phenylenediamine) 3 tablets 10) Substrate B (H2O2) 50 ml x 1 11) Stop Solution (20% H3PO4) 40 ml x 1 (2) Materials and equipment required The following materials and equipments are required but not provided: 1) Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt (for PKA Assay) 2) Adenosine 5'-triphosphate disodium salt (ATP) 3) Water bath at 25ºC 4) Multichannel pipette μl 5) Adjustable pipettes, 2-20 μl, μl, μl, μl 6) Microplate reader (optical density at 492 nm) 7) 96-well polyvinyl plate (for example, multiwell plate for ELISA Code No. MS-7196F, Sumitomo bakelite Co. Ltd) 8) Reagent reservoir (for example, cat. no , Bio-Rad) 9) Plate washer or washing bottle 10) Distilled water 3

5 (3) Recommended assay procedure A. Preparation of reagents 1) Sample preparation buffer Prepare only a sufficient amount for the assay because the Sample preparation buffer can not be stored. Sample preparation buffer must be prepared prior to cell preparation. Dilute 1 part of the Sample preparation buffer concentrate with 9 parts of distilled or deionized water and place it at 4ºC. Add 2-mercaptoethanol and PMSF (final concentration: 50 mm 2-mercaptoethanol and 1 mm PMSF) to the diluted sample preparation buffer, and cool it at 4ºC. Final concentration of Sample preparation buffer: 50 mm Tris-HCl ph 7.5, 5 mm EDTA, 10 mm EGTA, 50 mm 2-mercaptoethanol, 1 mm PMSF, 10 mm Benzamidine 2) ATP (0.1 M) Dissolve 60 mg ATP in 0.8 ml of H2O. Adjust the ph to 7.0 with 0.1 M NaOH. Adjust the volume to 1 ml with H2O. Dispense the solution into small aliquots and store at -20ºC. The molar absorption coefficient of ATP ε 259 = 15.4 X 10 3 (ph 7.0) Just prior to the assay, dilute 0.1 M ATP with distilled water and prepare 1 mm ATP. 3) Wash solution The Wash Concentrate must be diluted prior to use. Dilute 1 part Wash Concentrate with 9 parts distilled or deionized water. The diluted wash solution is stable for 1 month at 4ºC. 4) Substrate Solution Just prior to color development, dissolve one tablet of Substrate A in 12 ml of Substrate B. Keep the solution in the dark and use as soon as possible. If necessary, prepare the following reagents. 5) camp (10 mm) Dissolve 4 mg camp in 0.8 ml of H2O. Adjust the volume to 1 ml with H2O. Dispense the solution into small aliquots and store at -20ºC. The molar absorption coefficient of camp ε 259 = 15.4 X 10 3 Just prior to the assay, dilute it with distilled water and prepare 20 μm camp. 6) PKA Prepare according to Preparation of PKA described later in the appendix. 4

6 7) PKC Prepare according to Preparation of PKC described later in the appendix. 8) Phosphatidylserine (PS) (500 μg/ml) Agitate vigorously by sonicator or Vortex mixer prior to use. 9) 200 mm EGTA Dissolve 7.6 g of [ethylenebis (oxyethylenenitrilo)] tetraacetic acid (EGTA) in 80 ml of H2O by gradual addition of solid NaOH (at ph 5.0, EGTA is dissolved completely). Adjust the ph to 7.0 using 0.2 N NaOH and make up to 100 ml with H2O. Just prior to assay, dilute it with distilled water and prepare 20 mm EGTA. (4) Sample preparation Sample preparation must be done on ice and kept at 4ºC. The activities of PKA or PKC may be lost when the sample is not kept cold. Sub-confluent cultured cell were washed three times with cold PBS and scraped with a rubber policeman. After two washing with cold PBS, the cell pellet ( x 10 7 cells) is suspended in 1 ml of cold sample preparation buffer, and sonicated for seconds (ex. 15 seconds x 4 times). Some sonicators generate heat during cell sonication. Keep samples cool and never warm the cells during the sonication. Avoid foaming cell suspensions during the sonication. The optimal conditions for cell sonication will vary with the equipment used. Each lab should confirm the optimal conditions for their equipment. Cytosol fraction was separated by centrifugation at 100,000 x g for 1 hour at 4ºC. The activities of PKA and PKC were measured as described below. If necessary, dilute the samples with Sample preparation buffer. 5

7 B. Preparation of Component Mixture Prepare Component Mixture by mixing as described below. PKA (1 assay) PKC (1 assay) (+) (-) (+) (-) Reaction buffer (μl) Calcium solution (20 mm CaCl2) 13 (μl) 20 μm camp*, ** 13 (μl) 1 mm ATP*** (μl) 500 μg/ml phosphatidylserine**** 13 (μl) H2O (μl) 20 mm EGTA 13 (μl) *Note: camp is not required for the assay using the catalytic subunit of camp-dependent protein kinase. Add equal volume (13 μl) of H2O instead of camp solution. **Note: Negative control for assay of holo-pka, add equal volume (13 μl) of H2O instead of camp solution. ***Note: The concentration of ATP can be raised up to 2 mm in the Reaction Mixture. ****Note: Negative control for assay of PKC, add equal volume of 20 mm EGTA (ph 7.0) instead of 500 μg/ml phosphatidylserine. Final concentration of reaction mixture for PKA: 25 mm Tris-HCl ph 7.0, 3 mm MgCl2, 0.1 mm ATP, 2 μm camp, 0.5 mm EDTA, 1 mm EGTA, 5 mm 2-mercaptoethanol Final concentration of reaction mixture for PKC: 25 mm Tris-HCl ph 7.0, 3 mm MgCl2, 0.1 mm ATP, 2 mm CaCl2, 50 μg/ml phosphatidylserine, 0.5 mm EDTA, 1 mm EGTA, 5 mm 2-mercaptoethanol C. Assay Protocol 1) Prepare the reagents as described. 2) Place 108 μl component mixture in each well of polyvinyl plate and pre-incubate at 25ºC for 5 minutes. 3) Add 12 μl of kinase sample to each well and mix them. 4) Transfer 100 μl solution of reaction mixture to each PS-peptide coated well with a multichannel pipettor. 6

8 5) Incubate at 25ºC for 5-20 minutes (use water bath). 6) Add 100 μl of stop solution to each well. 7) Aspirate or discard the well contents. Fill the well with Wash Solution and then completely aspirate or discard the contents. Wash 5 times. Tap the plate on a paper towel to remove any remaining Wash Solution. Be carefully not to dry the well. 8) Add 100 μl of biotinylated antibody 2B9 to each well. 9) Incubate at 25ºC for 60 minutes. 10) Wash the microplate following the STEP 7 procedure. 11) Add 100 μl of POD-conjugated streptavidin to each well. 12) Incubate at 25ºC for 60 minutes. 13) Wash the microplate following the STEP 7 procedure. 14) Add 100 μl of Substrate solution to each well. 15) Incubate at 25ºC for 3-5 minutes. 16) Add 100 μl of Stop solution to each well. 17) Read the O.D. of each well at 492 nm with a microplate reader. 3. Storage and Stability 2-8ºC, 18 months References 1. Montimity, M. R. and Bilezikjian, L. M. Nature 56, (1987) 2. Wolf, M. et al. Nature 317, (1985) 3. Nishizuka, Y. Science 233, (1986) 4. Nishizuka, Y. Nature 334, (1988) 5. Edelman, A. M. et al. Ann. Rev. Biochem. 56, (1987) 6. Beavo, J. A. et al. Methods Enzymol. 38, (1974) 7. Inagaki, M. et al. J. Biol. Chem. 260, (1985) Warning: For research use only. Not recommended or intended for diagnosis of disease in humans or animals. Do not use internally or externally in humans or animals. Biotinylated antibody 2B9 contains 0.09% sodium azide as a preservative. Sodium azide may react with copper or lead in plumbing systems to form explosive metal azides. Therefore, be sure to flush drain with plenty of water when disposing materials containing azide into a drain. 7

9 Appendix Preparation of PKA Dissolve 500 units of the catalytic subunit of PKA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., Cat. No. P-2645) in 1 ml of 1 mg/ml bovine serum albumin, 50 mm 2-mercaptoethanol, 50% (w/v) sucrose and 2 mm EGTA. Dispense the solution into small aliquots and store at -70ºC. The PKA solution should be stable up to three months at -70ºC. Before use, dilute the PKA solution further to units/ml with Component Mixture. Alternatively PKA can be prepared from bovine heart according to the method of Beavo et al. 6). Preparation of PKC PKC is prepared from rat brain by the method of Inagaki et al. 7). Five rat brains (9 g) are homogenized with a Potter-Elvehjem Teflon-glass homogenizer with 90 ml of Buffer A. The homogenate is centrifuged for 90 min. at 75,000 x g. The soluble supernatant, used as the crude extract (70 ml, 105 mg of protein), is applied to a DEAE-cellulose column (2.0 x 17 cm) equilibrated with Buffer B at a flow rate of 36 ml/h. The column is washed with 300 ml of Buffer B. The sample is eluted from the column by application of M linear concentration gradient of NaCl in 500 ml of Buffer B at a flow rate of 20 ml/h. Fractions of 5.5 ml are collected. Using the MESACUP Protein Kinase Assay Kit, each fraction is assayed for protein kinase C activity in the presence of CaCl2 and phosphatidylserine or in the presence of EGTA. PKC is eluted as a sharp peak between 80 and 130 mm NaCl. Buffer A: 25 mm Tris-HCl, ph 7.5 containing 50 mm 2-mercaptoethanol, 2 mm [ethylenebis(oxyethylenenitrilo)] tetraacetic acid (EGTA), 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 0.005% leupeptin, and 0.25 M sucrose. Buffer B: 25 mm Tris-HCl, ph 7.5 containing 50 mm 2-mercaptoethanol, 2 mm EGTA, and 0.002% leupeptin. DEAE-cellulose (DE52) from Whatman Bio Systems Ltd., England. Phosphatidylserine (pig brain) from Serdary Research Laboratories, Inc. Chloroform is removed from this phospholipid by a stream of nitrogen, and the phospholipid is sonicated in water for 1 min to produce a suspension of 0.5 mg/ml. 8

10 A: MgCl2 dependency B: CaCl2 dependency Fig. 2 A. MgCl2 dependence of phosphorylation of PS peptide by protein kinase C. (Left) The PS peptide plate was phosphorylated by incubation with 100 μg/ml cell cytosol, 2 mm CaCl2, 0.1 mm ATP, 50 μg/ml phosphatidylserine, 0.5 mm EDTA, 1 mm EGTA, 5 mm 2-mercaptoethanol, 25 mm Tris-HCl ph7.0 and various concentrations of MgCl2 (activity: ), or by incubation with 100 μg/ml cell cytosol, 0.1 mm ATP, 0.5 mm EDTA, 3 mm EGTA, 5 mm 2-mercaptoethanol, 25 mm Tris-HCl ph 7.0 and various concentrations of MgCl2 (basal: ) at 25ºC for 5 min. B. CaCl2 dependence of phosphorylation of PS peptide by protein kinase C. (right) The PS peptide plate was phosphorylated by incubation with 100 μg/ml cell cytosol, 3 mm MgCl2, 0.1 mm ATP, 50 μg/ml phosphatidylserine, 0.5 mm EDTA, 1 mm EGTA, 5 mm 2-mercaptoethanol, 25 mm Tris-HCl ph 7.0 and various concentrations of CaCl2 at 25ºC for 5 min. 9

11 A: PKC B: PKA Fig. 3 Measurement of activities of camp-dependent protein kinase (PKA) and protein kinase C in cell cytosol using the MESACUP Protein Kinase Assay Kit A. Protein kinase C activities were measured by the MESACUP Protein Kinase Assay Kit. The PS peptide plate was phosphorylated by incubation with 30 μg/ml cell cytosol, 3 mm MgCl2, 2 mm CaCl2, 0.1 mm ATP, 50 μg/ml phosphatidylserine, 0.5 mm EDTA, 1 mm EGTA, 5 mm 2-mercaptoethanol and 25 mm Tris-HCl ph 7.0 (+), or by incubation with 30 μg/ml cell cytosol, 3 mm MgCl2, 2 mm CaCl2, 0.1 mm ATP, 0.5 mm EDTA, 3 mm EGTA, 5 mm 2-mercaptoethanol and 25 mm Tris-HCl ph 7.0 (-) at 25ºC for 10 min. B. camp-dependent protein kinase activities were measured by the MESACUP Protein Kinase Assay Kit. The PS peptide plate was phosphorylated by incubation with 30 μg/ml cell cytosol, 3 mm MgCl2, 0.1 mm ATP, 2 μm camp, 0.5 mm EDTA, 1 mm EGTA, 5 mm 2-mercaptoethanol and 25 mm Tris-HCl ph 7.0 (+), or by incubation with 30 μg/ml cell cytosol, 3 mm MgCl2, 0.1 mm ATP, 0.5 mm EDTA, 1 mm EGTA, 5 mm 2-mercaptoethanol and 25 mm Tris-HCl ph 7.0 (-) at 25ºC for 10 min. 10

$Fig. 4 Elution profiles of camp-dependent protein kinase and protein kinase C. The crude extract from rat brain was applied on a DEAE-cellulose column. A. The results of SDS-PAGE of fractions. B.$

12 Fig. 4 Elution profiles of camp-dependent protein kinase and protein kinase C. The crude extract from rat brain was applied on a DEAE-cellulose column. A. The results of SDS-PAGE of fractions. B. Activities of camp-dependent protein kinase (left) or protein kinase C (right) were measured by the MESACUP Protein Kinase Assay Kit. C. Western blot analysis of PKC Each fraction was run on a 12.5% polyacrylamide gel. The protein bands were transferred to a nitrocellulose membrane. The membrane was stained with monoclonal antibody against PKC. A. B. 11

13 C. 12

14 はじめに MESACUP Protein Kinase Assay Kit はラジオアイソトープを必要としない camp 依存性蛋白質リン酸化酵素 (PKA) とカルシウムリン脂質依存性蛋白質リン酸化酵素 (PKC) 活性測定試薬です camp 依存性蛋白質リン酸化酵素 (PKA) とカルシウムリン脂質依存性蛋白質リン酸化酵素 (PKC) は細胞内情報伝達機構において重要な役割を果たしています 1) PKA および PKC の機能を解明するうえで両キナーゼの活性を測定する事は必須です PKC のアイソタイプは 11 種類報告されておりいずれも C 末端側にキナーゼドメイン N 末端側にレギュレタリードメインを配した形になっています PKC の SDS-PAGE におけるみかけの分子量は最も小さい PKCλで 71~74 kda 最も大きい PKCμで 110 kda と報告されています 2, 3) レギュレタリードメインには PKCμを除くすべてのアイソフォームにおいて偽基質配列 R-F-A-R-K-G-A-L-R-Q-K-N-V と呼ばれる部分が存在しこの部分が分子内でキナーゼドメインの活性中心と相互作用することによりキナーゼ活性を常時 OFF に保っているものと考えられますこの偽基質配列の 7 番目の A を S に置換したペプチドは PKC の非常によい基質であることが報告されています 4) またこの A を S に置換したペプチド R-F-A-R-K-G-S-L-R-Q-K-N-V:PS ペプチドには PKA に最もリン酸化されやすいと考えられている配列 R-R/K-X-S/T が存在しますそこでこの PS ペプチドのリン酸化体を化学合成し抗原にしてリン酸化状態を特異的に認識するモノクローナル抗体 2B9 を得ましたそして PS ペプチドとモノクローナル抗体 2B9 とを用いて新たな PKA PKC 活性測定用試薬 MESACUP Protein Kinase Assay Kit の開発を行いました MESACUP Protein Kinase Assay Kit は crude cell extracts 組織抽出物での活性を測定することができますラジオアイソトープを必要としないため RI 施設のない研究室においてのキナーゼ研究に利用できます特徴 1) ラジオアクティブ ATP を必要としないため RI 施設のない研究室でも PKA PKC の活性測定ができ廃液等の処理も通常に行えます 2) 高濃度 ATP (2 mm) 存在下でも測定できます 3) 多数サンプルを短時間で測定が可能です 4) 長期間保存することができます (4ºC 18 ヶ月 ) 13

15 測定原理図 1 MESACUP Protein Kinase Assay Kit の測定原理を示します PS ペプチドを感作したマイクロプレートにサンプルを反応させますリン酸化された PS ペプチドとビオチン標識モノクローナル抗体 2B9 を反応させさらにストレプトアビジン-ペルオキシダーゼを反応させた後 o-フェニレンジアミン (OPD) と過酸化水素を添加してペルオキシダーゼにより発色させることにより酵素反応溶液中のキナーゼの活性量を間接的に測定します 14

16 キット構成構成品名容量 1) Microwell strips coated with PS peptide 8 wells x 12 strips 2) 10 x Sample preparation buffer concentrate 10 ml x 1 3) Reaction buffer 1.5 ml x 3 4) Calcium solution (20 mm CaCl2) 1.5 ml x 1 5) Phosphatidylserine (PS) (500 μg/ml) 1.2 ml x 1 6) Biotinylated antibody 2B9 6.0 ml x 2 7) POD-conjugated streptavidin 6.0 ml x 2 8) 10 x Wash concentrate (10 x PBS(-)) 50 ml x 2 9) Substrate A (o-phenylenediamine) 3 tablets 10) Substrate B (H2O2) 50 ml x 1 11) Stop Solution (20% H3PO4) 40 ml x 1 操作法準備する試薬器具 1) Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt;camp (for PKA assay) 2) Adenosine 5'-triphosphate disodium salt;atp (ph 7.0) 3) ウォーターバス 4) 8 あるいは 12 連式マルチチャネルピペット μl 5) 可変式ピペット 2-20 μl, μl, μl, μl 6) マイクロプレートリーダー (O.D. at 492 nm) 7) 96 穴ポリビニルプレート (ex, Sumitomo bakelite Co. Ltd, Cat. No. MS-7196F) 8) リザーバー (ex, Bio-Rad, Cat. no ) 9) プレートウォッシャーまたは洗浄ビン 10) 精製水試薬の調製 1) Sample preparation buffer( 操作前に実施 ) Sample preparation buffer はサイトゾル画分抽出用およびキナーゼサンプル希釈用として使用します Sample preparation buffer は保存できませんので用時調製して下さい 1 10 x Sample preparation buffer concentrate(10 倍濃縮品 ) を精製水で 10 倍希釈します 2 希釈した溶液に最終濃度 50 mm 2-mercaptoethanol 及び 1 mm PMSF になるように 2-mercaptoethanol 及び PMSF を加え Sample preparation buffer とし 4ºC に冷却します Sample preparation buffer の組成及び最終濃度 50 mm Tris-HCl ph 7.5, 5 mm EDTA, 10 mm EGTA, 50 mm 2-mercaptoethanol, 1 mm PMSF, 10 mm Benzamidine 2) 洗浄液 ( 操作前に実施 ) 10 x Wash concentrate (10 x PBS(-)) を精製水で 10 倍希釈し洗浄液とします洗浄液は 4ºC 保存で 1 ヶ月安定です 15

17 3) 酵素基質溶液 ( 反応直前に実施 ) 酵素基質溶液は保存できないので発色反応直前に調製します室温に戻した 12 ml の Substrate B に 1 錠の Substrate A を加えて溶解し酵素基質溶液とします注意 : 酵素基質溶液はできる限り遮光して下さいまた酵素基質溶液は金属イオンによって酸化されやすいので精製水で十分にすすいだきれいな器具を使用して下さい 4) 0.1 M ATP ATP 60 mg を 0.8 ml の精製水に溶解し 0.1 M NaOH で ph 7.0 にあわせ 1 ml にします使用直前に精製水で 1 mm に調製して下さい 0.1 M ATP は凍結融解の繰り返しを避けるため小分けして -20ºC で凍結保存して下さいモル分子吸収係数 ATP ε 259 = 15.4 X 10 3 (ph 7.0) 必要に応じて下記の試薬を調製して下さい 5) 10 mm camp の調製 camp 4 mg を 1 ml の精製水に溶解します使用直前に精製水で 20 μm に調製して下さい 10 mm camp は凍結融解の繰り返しを避けるため小分けして -20ºC で凍結保存して下さいモル分子吸収係数 ATP ε 259 = 15.4 X 10 3 (ph 7.0) 6) 200 mm [ethylenebis (oxyethylenenitrilo)] tetraacetic acid (EGTA) 溶液の調製 1 EGTA 7.6 g に蒸留水 80 ml を加え攪拌します 2 NaOH 錠剤を少量ずつゆっくりと加えます (ph 5.0 で溶解します ) N NaOH で ph 7.0 に合わせたのち精製水で 100 ml にします 4 使用直前に精製水で希釈し 20 mm EGTA に調製します 7) Phosphatidylserine (PS) (500 μg/ml) 使用直前にソニケーターあるいはボルテックスミキサーで十分攪拌して下さい 8) PKA 後述の Appendix を参照して下さい 9) PKC 後述の Appendix を参照して下さい cell cytosol の調製 cell cytosol に熱が加わった場合 cell cytosol 中の PKA PKC が失活する場合がありますので cell cytosol の調製は必ず氷中で行なって下さい 1) 抽出用緩衝液には Sample preparation buffer を使用します培養した細胞を冷却した PBS で 3 回洗浄し rubber policeman を用いて細胞を集めます集めた細胞を冷却した PBS で 2 回洗浄し細胞数を x 10 7 個に調整します調整した細胞を冷却した Sample preparation buffer 1 ml に加え氷中で秒間 (ex. 15 秒 x 2~4 回 ) ソニケーションします注意 : ソニケーターの機種によりソニケーション時にサンプルに熱が発生する機種があります cell cytosol をソニケーションするときには cell cytosol に熱がかからないように注意して下さいまたソニケーションするときにはサンプルを泡立てないで下さいソニケーターの最適設定条件は機種によって異なります各施設にて最適設定条件を設定する事をお勧めします 2) 4ºC で 100,000 x g 60 分間遠心します 3) 上清をサンプルとしますサンプルは必要に応じて Sample preparation buffer を用いて希釈して下さい 16

18 リン酸化反応用溶液の調製下記試薬を混合しリン酸化反応用溶液とします PKA (1 assay) PKC (1 assay) (+) (-) (+) (-) Reaction buffer (μl) Calcium solution (20 mm CaCl2) 13 (μl) 20 μm camp*, ** 13 (μl) 1 mm ATP*** (μl) 500 μg/ml phosphatidylserine**** 13 (μl) H2O (μl) 20 mm EGTA 13 (μl) 注意 *:PKA 触媒サブユニットのアッセイには camp は添加せずに同量の精製水を加えます注意 **:PKA のコントロールは camp の代わりに精製水を加えます注意 ***:ATP の濃度はサンプルとして 2 mm まで影響を受けません注意 ****:PKC のコントロールは phosphatidylserine の代わりに phosphatidylserine と同量の 20 mm EGTA (ph 7.0) を加えますリン酸化反応溶液の組成と最終濃度 PKA 用 :25 mm Tris-HCl ph 7.0, 3 mm MgCl2, 0.1 mm ATP, 2 μm camp, 0.5 mm EDTA, 1 mm EGTA, 5 mm 2-mercaptoethanol PKC 用 :25 mm Tris-HCl ph 7.0, 3 mm MgCl2, 0.1 mm ATP, 2 mm CaCl2, 50 μg/ml phosphatidylserine, 0.5 mm EDTA, 1 mm EGTA, 5 mm 2-mercaptoethanol PKA または PKC 活性の測定方法 1) サンプルリン酸化反応用溶液その他の試薬を調製準備します 2) リン酸化反応 1 前処理用のプレート 1 ウェルにつきリン酸化反応用溶液 108 μl を分注して 25ºC で 5 分間インキュベートします 2 インキュベートしたリン酸化反応用溶液 108 μl にサンプル 12 μl を加えて混合します混合したサンプルを Microwell strips coated with PS peptide 1 ウェルにつき 100 μl 分注しリン酸化反応を開始させます 3) 25ºC で 5 20 分間インキュベート後 Stop solution を 1 ウェルにつき 100 μl 分注しリン酸化反応を停止させます注意 : 実験の目的により反応時間の変更を行って下さい 17

19 4) マイクロプレートを洗浄液で 5 回洗浄しますマイクロカップ内の反応液を完全に除去後カップ内に洗浄液を十分に満たし洗浄液を捨てます同様に 4 回行ないます (5 回洗浄 ) 注意 : 洗浄中にマイクロカップを乾燥させないで下さい洗浄後 Microwell strips をペーパータオル等で包み Microwell strips を下向きにして軽く叩いて残っている洗浄液を完全に除去しますこの場合も乾燥しないように十分注意して下さい 5) Biotinylated antibody 2B9 を 1 ウェルにつき 100 μl 分注し 25ºC で 60 分間反応させます 6) 4) と同様に Microwell strips を洗浄液で 5 回洗浄します 7) POD-conjugated streptavidin を 1 ウェルにつき 100 μl 分注し 25ºC で 60 分間反応させます 8) 4) と同様に Microwell strips を洗浄液で 5 回洗浄します 9) 酵素基質溶液を 1 ウェルにつき 100 μl 分注し 25ºC で 3-5 分間反応させます 10) Stop solution を 1 ウェルにつき 100 μl 分注し酵素反応を停止させ 492 nm の吸光度を測定します操作上または使用上の注意事項 1) 本試薬は研究用試薬ですヒトの体内に用いたり診断の目的に使用しないで下さい 2) 本試薬の構成品のうち Biotinylated antibody 2B9 には 0.09% アジ化ナトリウム (NaN3) を添加してあります濃度は 0.09% ですので毒物には該当しませんが誤って目や口に入ったり皮膚に付着した場合は水で十分に洗い流すなどの応急措置を行い必要があれば医師の手当てを受けて下さいまたアジ化ナトリウムは配管中で爆発性のアジ化銅やアジ化鉛を形成することが報告されていますこれらの物質の形成を防ぐためアジ化ナトリウムを含んだ廃液は十分量の水で洗い流して下さい貯法有効期間 2~8ºC, 18 months 参考文献 1. Edelman, A. M. et al. Ann. Rev. Biochem. 56, (1987) 2. Nishizuka, Y. et al. Science 258, (1992) 3. Johannes, F-J. et al. J. Biol. Chem. 269, (1994) 4. House, C. and Kemp E. B. Science 238, (1987) 5. Beavo, J. A. et al. Methods Enzymol. 38, (1974) 6. Inagaki, M. et al. J. Biol. Chem. 260, (1985) 18

20 Appendix 1) A-キナーゼサンプル Protein Kinase: Catalytic subunit (Sigma Cat. No. P-2645) を用います Sigma Cat. No. P-2645 は凍結乾燥品ですので 1 mg/ml bovine serum albumin, 2 mm EGTA, 50 mm 2-mercaptoethanol, 50% (w/v) sucrose を含む溶液で溶解 ( たとえば 50 U/mL) して使用して下さい残った酵素は凍結融解の繰り返しを避けるため適当に小分け分注し -70ºC に保存して下さい活性は約 3 ヶ月間安定ですまた牛の心臓から Beavo らの方法 5) で精製が可能です 2) C-キナーゼの精製稲垣らの方法 6) に従って行って下さい 1 ポッター型テフロンホモジナイザーを用いてラット脳をホモジナイズします (5 個 /90 ml Buffer A 5 ストローク ) 2 4ºC で 75,000 x g 90 分間遠心します 3 上清を DEAE-cellulose column サンプルとします 4 DEAE-cellulose column (2.0 x 17 cm) を Buffer B で平衡化します 5 3のサンプル (70 ml, 蛋白量 105 mg) を DEAE-cellulose column にアプライし流速 36 ml/h で流します 6 Buffer B 300 ml で DEAE-cellulose column を洗浄します 7 Buffer B 500 ml で流速 20 ml/h M NaCl の濃度勾配で溶出させ各 tube 5.5 ml で溶出分画を集めます 8 MESACUP Protein Kinase Assay Kit を用いて各分画を CaCl2 及び phosphatidylserine 存在下あるいは EGTA 存在下で C-キナーゼの活性を測定します C-キナーゼは 80~130 mm NaCl の間をピークとして溶出されます Buffer A: 25 mm Tris-HCl (ph 7.5), 50 mm 2-mercaptoethanol, 2 mm [ethylenebis(oxyethylenenitrilo)] tetraacetic acid (EGTA), 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 0.005% leupeptin, 0.25 M sucrose. Buffer B: 25 mm Tris-HCl (ph 7.5), 50 mm 2-mercaptoethanol, 2 mm EGTA, 0.002% leupeptin. DEAE-cellulose (DE52); Whatman Bio Systems Ltd., England. Phosphatidylserine (pig brain); Serdary Research Laboratories, Inc. クロロフォルムを蒸発させ 1 分間ソニケートして 0.5 mg/ml の懸濁液を作製します 19

Microsoft Word _Cdc2.Cdk1 Kinase Assay_Kit_130214_..doc

Microsoft Word _Cdc2.Cdk1 Kinase Assay_Kit_130214_..doc Printed: May 29, 1997 Revised: February 14, 2013 (Ver. 6.1) For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Non Radioisotopic Kit for Measuring Cdc2/Cdk1 Kinase Activity MESACUP Cdc2/Cdk1