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1 Printed: December 10, 2001 Revised: November 21, 2008 Revised: October 12, 2010 Revised: April For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Quantitative test kit for Human ST2 ST2 ELISA Kit CODE No wells MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD. URL TEL

2 CONTENTS 1. Intended Use Summary and Explanation Principle Materials provided Storage and Stability Species and cross reactivity Materials and equipment required Precautions Procedure Performance Characteristics Related products References

3 Before use, thoroughly read these Instructions. Intended Use The ST2 ELISA Kit is based on sandwich ELISA and capable of measuring human ST2. For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Summary and Explanation The ST2 gene, also known as T1, Fit1, or DER4, was originally identified as a responsive gene that was highly induced by stimulation of various proliferation-inducing agents including serum, PDGF (platelet-derived growth factor), FGF (fibroblast growth factor), or lysophosphatidic acid in murine fibroblasts 15), 16). Several distinct forms of gene products have been reported and named ST2, ST2L, ST2V and ST2LV. ST2 is a soluble secreted form of 37.1 kda protein which lacks an intracellular domain, whereas ST2L is a transmembrane form of 61.5 kda protein (the glycosylated forms of ST2 and ST2L are about 57 kda and 80 kda, respectively). This ST2L protein is very similar to IL-1R (interleukin-1 receptor) type I and II in structure, thus it is considered as a member of the IL-1R family 13), 14). ST2V, which is another variant form of human ST2, has been identified 11). ST2 proteins are expressed in a wide variety of types of human cells, including hematopoietic cells in various stages of differentiation, a population of the peripheral blood mononuclear cells from healthy individuals, glioblastoma and astrocytoma cell lines, and colon cancer cells in addition to fibroblast cell lines 13). Thus ST2 proteins are considered to have some role in regulating cell growth or proliferation. It has been reported that IL-33 binds to ST2 proteins. This indicates that ST2L protein is functionally independent from IL-1R. Furthermore, several studies have shown that ST2L is expressed on the cell surface of Th2 cells but not on the Th1 cells 12), 13), indicating the possibility that ST2L protein participates not only in the regulation of cell growth or proliferation, but also in the immune system including differentiation of T cells or immunological response via helper T cells. From these observations, ST2 proteins are considered to be one of the important proteins participating in various physiological phenomena. Thus, further analysis is required to understand their physiological functions. -1-

4 Principle The ST2 ELISA Kit measures soluble human ST2 protein by sandwich ELISA. The assay uses two monoclonal antibodies against two different epitopes of human ST2. Samples to be measured or standards are incubated in the microwells coated with anti-human ST2 monoclonal antibody. After washing, peroxidase-conjugated anti-human ST2 monoclonal antibody is added into the microwells and incubated. After another washing, the peroxidase substrate premixed with chromogen is added and allowed to incubate for an additional period of time. An acid solution is then added to each microwell to terminate the enzyme reaction and to stabilize the developed color. The optical density (O.D.) of each microwell is measured at 450 nm using a microplate reader. The concentration of human ST2 is calibrated from a dose response curve based on reference standards. Materials provided Each kit contains: Name Materials Quantity (for 1 kit) Microwells 96-well microwell strips coated with anti-human ST2 antibody 8-well strip 12 strips Calibrator Powder Human ST2 protein (lyophilized) 2 vials Detector Concentrate Peroxidase-conjugated anti-human ST2 monoclonal antibody ( 101 conc.) 0.2 ml 1 vial Detector Diluent Buffer for diluting Detector Concentrate 24 ml 1 bottle Assay Diluent Buffer for diluting samples (ready-to-use) 30 ml 1 bottle Wash Concentrate Buffer for washing microwells ( 10 conc.) 100 ml 1 bottle Substrate TMB/H 2 O 2 solution (ready-to-use) 20 ml 1 bottle Stop Solution 0.5 M H 2 SO 4 (ready-to-use) 20 ml 1 bottle Storage and Stability All kit components must be stored at 2-8 C. All reagents are stable for one year after manufacturing when stored at the indicated conditions. -2-

5 Species cross reactivity Species Human Mouse Rat Samples serum, cell culture supernatant * Not Tested Not Tested Reactivity + * This kit was used in reference 2). Materials and equipment required Microplate reader (450 nm) Automatic plate washer or wash bottle Adjustable micropipette Multichannel micropipette 96-well polyvinyl plate (optional) Microplate holder (optional) Uncoated microwell strips (for using an automatic plate washer) Disposable reagent vessels Paper towels Distilled water Precautions 1. Allow all the components to come to room temperature (20-25 C) before use. 2. Microwells which are not immediately required should be returned to the ziplock pouch, which must be carefully resealed to avoid moisture absorption. 3. Fresh samples should be used. Aliquot each sample and store below -20 C if necessary. Avoid repeated freezing and thawing. Never store the samples at 4 C, as samples might be affected by storage at this temperature. 4. When Wash Concentrate is stored at 2-8 C, some precipitation or turbidity may appear. However it does not affect the reagent efficiency. Dissolve the Wash Concentrate completely when preparing the Wash Solution. 5. Assay Diluent contains sodium azide (0.09%) as preservative. Azide may react with copper or lead in plumbing system to form explosive metal azide. Therefore, always flush with plenty of water into a drain when disposing materials containing azide. 6. Stop Solution is 0.5 M sulfuric acid. As it is a corrosive material, protect eyes and skin and handle with care. 7. This kit is intended for research use only. Not for use in diagnostic procedures. -3-

6 Procedure Preparation of Reagents 1. Wash Solution Prepare Wash Solution by diluting 100 ml of Wash Concentrate with 900 ml of distilled water. This Wash Solution is stable for 2 weeks at 4 C. 2. Detector Solution Prepare Detector Solution by diluting the Detector Concentrate, 1:101 with the Detector Diluent. Example: Total volume Detector Concentrate Detector Diluent 10.1 ml 100 µl 10 ml 2.02 ml 20 µl 2 ml *Detector Solution must be prepared just prior to use. *Use disposable new pipette tips and vessel to avoid contamination of microbe. 3. Calibrators Reconstitute Calibrators by dissolving lyophilized Calibrator Powder with distilled water. The volume of distilled water and precise procedures are indicated in the attached document Preparation of Calibrators. *If reconstituted Calibrators are needed to be stored, prepare appropriate aliquots and freeze them below -20 C. Avoid repeated freezing and thawing. 4. Other reagents (Microwells, Substrate and Stop Solution) are ready-to-use. Preparation of samples 1. Sample type Serum samples can be used. Each investigator should established appropriate methods of specimen collection and preparation for using other biomedical fluids. Example: human serum Blood for measurement of ST2 was collected in Venoject -II Tube AUTOSEP tube (TERUMO, Japan; cat# VP-AS109K). The blood was allowed to clot at room temperature for exactly 60±10 minutes. Thereafter, the serum was separated by centrifugation twice for 10 minutes at 3,000 rpm at 4 C, and then transferred to a new plastic test tube. -4-

7 2. Dilution Dilute each sample with Assay Diluent. If you test human serum, dilute 1:5 with Assay Diluent. Each investigator should establish appropriate condition of sample dilution. Example: Total volume Serum Assay Diluent 150 µl 30 µl 120 µl 300 µl 60 µl 240 µl 3. Storage Using fresh sample is recommended. (If necessary, store the sample below -20 C without repeat freezing and thawing.) Assay procedure STEP 1. (Sample incubation) Duplicate assay is recommended. 1) Add 100 µl of diluted samples and Calibrators to Microwells. Because the reaction starts on the transfer to the well, this transfer should be completed as quickly as possible. If you test a large number of samples, prepare 120 µl of diluted samples or Calibrators in a disposable 96-well polyvinyl plate for each microwell plate, in the same order as the assay run, then transfer 100 µl of each sample to Microwells simultaneously using multichannel pipette. Because the reaction starts on the transfer to the wells, this transfer should be completes as quickly as possible. 2) Incubate for 60 minutes at room temperature (20-25 C). STEP 2. (Washing) Manual wash: Aspirate or discard the well contents, then fill each well with Wash Solution using wash bottle. Aspirate or discard the Wash Solution in the wells. Repeat this step another 3 times. Tap the plate on a paper towel to remove any remaining Wash Solution. Autowasher: Wash 4 times with Wash Solution. Tap the plate on a paper towel to remove any remaining Wash Solution. * Each laboratory is recommended to confirm its own appropriate washing condition. * Wash Solution should be used at room temperature (20-25 C). -5-

8 STEP 3. (Incubation with HRP-conjugated anti-st2 antibody) 1) Add 100 µl of Detector Solution into each well. For testing many samples, prepare the Detector Solution in a disposable reagent vessel, and then pour it into each well using multichannel pipette. 2) Incubate for 60 minutes at room temperature (20-25 C). STEP 4. (Washing) Wash the wells again following the STEP 2. procedure. STEP 5. (Substrate incubation) 1) After the washing, add 100 µl of Substrate into each well. Because the enzyme reaction starts on the transfer to the well, this transfer should be completed as quickly as possible. For testing many samples, prepare the Substrate in a reagent vessel, then pour it into each well using multichannel pipette. This vessel should be different from the one that was used for pouring Detector Solution. * Substrate should be used at room temperature (20-25 C). * Use disposable new pipette and vessel, as Substrate is easily oxidized by metal ions and can be contaminated by microbes. * Once Substrate is poured into the vessel, do not return to the bottle. 2) Incubate for 30 minutes at room temperature (20-25 C). STEP 6. (Stopping reaction) Add 100 µl of Stop Solution into each well. For testing many samples, prepare the Stop Solution in a reagent vessel, and then pour it into each well using multichannel pipette. Reading Measure the absorbance of each well at 450 nm using a plate reader. If a dual wavelength plate reader is available, set the test wavelength at 450 nm and the reference at 620 nm. * Reading should be done within 30 minutes after stopping the reaction. * Ensure that the back of the plate is clean and dry, and that no air bubbles are present on the surface of the liquid in the wells before reading. -7-

9 Calculation of results 1) Calculate the mean absorbance value of each Calibrator. 2) Plot on graph paper and construct a calibration curve. [Absorbance on the vertical axis, concentration (ng/ml) on the horizontal axis] 3) Read the ng/ml corresponding to the absorbance of sample from the calibration curve. Report the ST2 concentration of samples by multiplying dilution factor. (e.g. human serum: 5) * If absorbance of sample exceeds the one of the Calibrator 1, dilute the sample and measure again. Example of calibration curve Concentration of Human ST2 in normal sera Serum samples from 168 healthy donors were measured with the ST2 ELISA Kit. The results were as follows. (Calculated as described in Calculation of results.) Maximum Minimum Mean SD = 2.0 ng/ml = 0.1 ng/ml = 0.5 ng/ml = 0.3 ng/ml Mean + 2SD = 1.1 ng/ml -7-

10 Performance Characteristics Sensitivity The ST2 calibrator which is consisted of the recombinant ST2 protein was diluted serially and the limit of detection (LOD) was measured. The estimated LOD was ng/ml (The Mean + 2 SD of a zero sample was smaller than the Mean - 2 SD of ng/ml sample.). This value does not indicate the limit of quantitation (LOQ) that guarantees the accuracy and reproducibility. Reproducibility 1. Intra-assay Intra-assay reproducibility was determined by assaying the sera 8 times. ST2 concentrations of the serum samples were calculated as described in Calculation of results. Sample serum 1 serum 2 serum 3 serum 4 serum 5 Number of determinations Mean (ng/ml) C.V. (%) Inter-assay Inter-assay reproducibility was determined by 5 independent Intra-assay. ST2 concentrations of the serum samples were calculated as described in Calculation of results. Sample serum 1 serum 2 serum 3 serum 4 serum 5 Number of determinations Mean (ng/ml) C.V. (%) * From eight replicates of each serum sample in 5 separate assays. * Mean or C.V. of the Mean which obtained from each Intra-assay. Recovery test Recombinant human ST2 was added to samples at different concentrations. ST2 concentrations of the serum samples were calculated as described in Calculation of results. -8-

11 serum 1 (A) additional rhst2 (ng/ml) ST2 concentration observed (ng/ml) (B) recovery (ng/ml) (B/A) recovery rate (%) serum 2 (A) additional rhst2 (ng/ml) ST2 concentration observed (ng/ml) (B) recovery (ng/ml) (B/A) recovery rate (%) serum 3 (A) additional rhst2 (ng/ml) ST2 concentration observed (ng/ml) (B) recovery (ng/ml) (B/A) recovery rate (%) out of range - - serum 4 (A) additional rhst2 (ng/ml) ST2 concentration observed (ng/ml) (B) recovery (ng/ml) (B/A) recovery rate (%) out of range

12 Dilution test Serum samples were diluted with Sample Diluent. Each serum was serially diluted from 1/1 to 1/128 with Sample Diluent, then ST2 concentrations of the serum samples were calculated as described in Calculation of results. Related products D065-3 Anti-ST2 (Human) mab D066-3 Anti-ST2 (Human mab D067-3 Anti-ST2 (Human) mab D067-4 Anti-ST2 (Human) mab-fitc D067-5 Anti-ST2 (Human) mab-pe 7650 Human IL-33 Cytokine domain Detection Kit 5332 Ab-Match Assembly Mouse IL-33 kit 5310 Ab-Match Universal kit PM033 Anti-IL-33 (Human) pab M138-3 Anti-IL-33 (Human) mab M161-3 Anti-IL-33 (Mouse) mab M187-3 Anti-IL-33 (Mouse) mab M188-3 Anti-IL-33 (Mouse) mab B Recombinant IL-33 (Human) B Recombinant IL-33 (Mouse) -10-

13 References 1) Pastorelli, L., et al., PNAS 107, (2010) 2) Mok, M. Y., et al., Rheumatology 49, (2010) 3) Pecaric-Petkovic, T., et al., Blood 113, (2009) 4) Shimizu, M., et al., Hum. Mol. Genet. 14, (2005) 5) Shimpo, M., et al., Circulation 109, (2004) 6) Tajima, S., et al., Chest 124, (2003) 7) Weinberg, E. O., et al., Circulation 107, (2003) 8) Oshikawa, K., et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 165, (2002) 9) Oshikawa, K., et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 164, (2001) 10) Kuroiwa, K., et al., HYBRIDOMA 19, (2000) 11) Tominaga, S., et al., Biochem. Biohys. Res. Commun. 264, (1999) 12) Löhning, M., et al., PNAS. 95, (1998) 13) Yanagisawa, K., et al., J. Biochem. 121, (1997) 14) Yanagisawa, K., et al., FEBS Lett. 318, (1993) 15) Lanahana, A., et al., Mol. Cell. Biol. 12, (1992) 16) Tominaga, S., FEBS Lett. 258, (1989) Manufacturer MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD. URL TEL US Patent 7,087,

14 はじめに ST2 遺伝子は T1 Fit1 DER4 遺伝子という名前でも知られ, マウス線維芽細胞において 血清 PDGF( 血小板由来増殖因子 ) FGF( 線維芽細胞増殖因子 ) イソホスファチジン酸など 様々な増殖因子により発現が強く誘導される遺伝子として同定されました 15), 16) 現在 その遺伝子産物には複数の異なるタイプの蛋白分子が報告されており ST2 ST2L ST2V ST2LV と命名されています ST2 は 37.1 kda の可溶性 分泌型タンパク質で ST2L は 61.5 kda の細胞膜貫通型タンパク質 ( 糖鎖が付加した ST2 ST2L はそれぞれ約 57 kda 80 kda) です この ST2L タンパク質は IL-1R( インターロイキン 1 受容体 ) タイプ I II に高いホモロジーを有することより IL-1R ファミリーメンバーであると考えられています 13), 14) また ST2V は 3 つ目のタイプの ST2 として 単離 同定されたタンパク質です 11) これらの ST2 タンパク質は 線維芽細胞に加え 様々な分化段階の血球細胞や健常人の末梢血単核球集団 グリア芽細胞腫株や星状細胞腫株 結腸癌細胞など 多様なヒト細胞において発現していることが報告されており 13) 細胞の成長 増殖制御において何らかの役割を果たしている可能性が示唆されています また ST2L に結合するリガンド分子として IL-33 が報告されています 更に ST2L がヘルパー T 細胞のうち 2 型 (Th2 細胞 ) に発現していることが示され 12), 13) 細胞の成長 増殖制御にとどまらず このタンパク質がヘルパー T 細胞の分化やこれを介した免疫応答など 免疫機構にも関与する可能性が示唆されています これらの知見より ST2 は様々な生理現象において重要な役割を担う因子の一つであると考えられ 生理機能を明らかにするために更なる解析が求められています 測定原理 ST2 ELISA Kit は 異なるエピトープを認識する 2 種のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ ELISA 法にて ヒト ST2 を測定する試薬です 抗ヒト ST2 モノクローナル抗体を感作したマイクロカップに サンプルを添加し 抗原 - 抗体反応をさせます 洗浄後 ペルオキシダーゼ標識抗ヒト ST2 モノクローナル抗体を添加して反応させ 抗体 - 抗原 - 標識抗体の複合物を形成させます 洗浄後 テトラメチルベンチジンと過酸化水素の溶解液を基質溶液として添加し 酵素 ( ペルオキシダーゼ ) により発色させ 反応停止後 吸光度 (A450) を測定してヒト ST2 を検出します -12-

15 キット構成 名称内容数量 Microwells 96-well microwell strips coated with anti-human ST2 antibody 8-well strip 12 strips Calibrator Powder Human ST2 protein (lyophilized) 2 vials Detector Concentrate Peroxidase-conjugated anti-human ST2 monoclonal antibody ( 101 conc.) 0.2 ml 1 vial Detector Diluent Buffer for diluting Detector Concentrate 24 ml 1 bottle Assay Diluent Buffer for diluting samples (ready-to-use) 30 ml 1 bottle Wash Concentrate Buffer for washing microwells ( 10 conc.) 100 ml 1 bottle Substrate TMB/H 2 O 2 solution (ready-to-use) 20 ml 1 bottle Stop Solution 0.5 M H 2 SO 4 (ready-to-use) 20 ml 1 bottle 保存 2-8 o C にて保存してください 有効期間 製造後 12 か月 交差性 種 ヒト マウス ラット 検体 血清, 培養上清 * 未検討 未検討 交差性 + * 参考文献 2) で本キットが使用されています 準備するもの マイクロプレートリーダー プレートウォッシャーまたは洗浄ビン マイクロピペット マルチチャンネルマイクロピペット 1 次反応準備用マイクロプレート ( ポリビニル製 96 ウェルプレートなど ) マイクロカップ専用ホルダー ダミーのマイクロカップ ( 自動洗浄機使用時 ) リザーバー ペーパータオル 精製水 -13-

16 操作上の留意点 1. キットの構成品は 室温 (20-25 o C) に戻してから使用して下さい 2. 抗体感作マイクロカップは湿気をきらいますので 十分室温に戻してから開封して下さい また 開封後はアルミ袋のチャックを確実に締めて保存して下さい 3. 検体は新鮮なものを用いて下さい 検体を保存する場合は 小分けして -20 o C 以下で凍結保存して下さい また 凍結融解の繰り返しは避けて下さい 4. Wash Concentrate は 2-8 o C に保存したとき 白濁が認められる場合がありますが 試薬性能に影響はありません Wash Solution 調製時 十分に溶解してから使用して下さい 5. 本試薬の構成品のうち Assay Diluent には 0.09% アジ化ナトリウム (NaN 3 ) を添加してあります 濃度は 0.09% ですので毒物には該当しませんが 誤って目や口に入ったり 皮膚に付着した場合は水で十分に洗い流すなどの応急処置を行い 必要があれば 医師の手当てを受けて下さい また アジ化ナトリウムは 配管中で爆発性のアジ化銅やアジ化鉛を形成することが報告されています これらの物質の形成を防ぐため アジ化ナトリウムを含んだ廃液は十分量の水で洗い流して下さい 6. 本試薬の構成品のうち Stop Solution には 0.5 M 硫酸 (H 2 SO 4 ) を用いています 使用の際には十分注意して取り扱って下さい 7. 本試薬は研究用試薬です ヒトの体内に用たり 診断の目的に使用しないで下さい 操作法 試薬の調製 1. Wash Solution [ 洗浄液 洗浄液 ] Wash Concentrate 100 ml に精製水 900 ml を加えて希釈し Wash Solution とします Wash Solution は 4 o C で保存すると およそ 2 週間安定です 2. Detector Solution [ 標識抗体溶液 標識抗体溶液 ] ( 測定直前に実施 ) Detector Concentrate を Detector Diluent で 101 倍希釈して Detector Solution とします 例 : 合計量 Detector Concentrate Detector Diluent 10.1 ml 100 µl 10 ml 2.02 ml 20 µl 2 ml * Detector Solution は保存出来ませんので 必要量を用時調製して下さい * コンタミネーションを防ぐため Detector Solution の調製には ディスポーサブルの新し い器具を使用して下さい -14-

17 3. Calibrators [ST2 タンパク タンパク質標準液 ] ( 測定直前に調製 ) Calibrator Powder を精製水で溶解して Calibrators を作製します 精製水の量と詳細な操作法はキット添付の文書 Calibrator の調製方法 に記載してあります * Calibrator Powder は 操作直前に溶解して使用して下さい * 溶解後の Calibrators を保存する場合には 適当に小分けして-20 o C 以下で凍結保存して下さい また 凍結融解の繰り返しは避けて下さい その他の試薬試薬はそのままごはそのままご使用使用くださいください 4. その 検体の準備 1. 検体の種類 検体 種類 施設ごとにサンプリングの方法 適切な処理 測定手順を確立されることをお勧めします 以下に 例をご紹介します 例 : ヒト血清 2. 検体 血液を採血管 (Venoject -II Tube AUTOSEP チューブ [TERUMO, Japan; cat# VP-AS109K]) に採取し 室温にて 60±10 分程度静置します その後 4 o C 3,000 rpm で 10 分間遠心します 2 回遠心を繰 り返すと 血清が分離します この血清を別の新しいプラスチック容器に移します 検体の希釈 サンプルは Assay Diluent を用いて希釈して下さい 血清は 5 倍希釈としてください 例 : 合計量血清 Assay Diluent 150 µl 30 µl 120 µl 300µL 60 µl 240 µl * 検体希釈倍数は用いるサンプルによって異なります 最適な検体希釈倍数は各研究室ごと 3. 検体 に設定してください 検体の保存 検体は新鮮なものを用いて下さい 検体を保存する場合は 小分けして -20 o C 以下で凍結 保存して下さい また 凍結融解の繰り返しは避けて下さい -15-

18 測定の手順 STEP 1. <1 次反応 Duplicate での測定 次反応 > での測定 (2 重測定 ) を推奨推奨しますします 1) 希釈調製した Calibrators と検体を 120 µl ずつ 1 次反応準備用マイクロプレートに実 際のアッセイと同じ配列で添加します マルチチャンネルピペットを用い 1 次反応準備 用マイクロプレートに準備した検体を 100 µl ずつ Microwells に移します * マイクロカップに検体を添加した時点から反応が始まりますので 操作は短時間のうち に行って下さい 2) 室温 (20-25 o C) で 1 時間静置反応させます STEP 2. < 洗浄 > 用手法 : 反応液を捨てたのち 洗ビンを用いて Wash Solution を各ウェルに満たし 同じ ように捨てます これを 4 回行います その後 プレートをペーパータオルなどにパン パンとたたきつけて完全に洗浄液を除去してください 自動洗浄機 ( マイクロプレート専用機 ): Wash Solution で 4 回洗浄下さい その後 プレ ートをペーパータオルなどにパンパンとたたきつけて完全に洗浄液を除去してくださ い * 自動洗浄機を用いた場合 使用する自動洗浄機によって最適洗浄回数が異なる場合があ ります あらかじめ各施設で用いる自動洗浄機の最適洗浄回数を確認することをお勧め します * Wash Solution は必ず室温 (20-25 o C) に戻して使用して下さい 次反応 > STEP 3. <2 次反応 1) マイクロカップに残った Wash Solution を完全に除去した後 リザーバーに移した Detector Solution をマルチチャンネルピペットで 100 µl ずつ各ウェルに添加します 2) 室温 (20-25 o C) で 1 時間静置反応させます STEP 4. < 洗浄 > STEP 2. と同様にマイクロカップを洗浄します STEP 5. < 酵素反応 > 1) マイクロカップに残った Wash Solution を完全に除去した後 Substrate をリザーバー に移し マルチチャンネルピペットで 100 µl ずつ各ウェルに添加します 2) 室温 (20-25 o C) で 30 分間静置反応させます * Substrate は必ず室温 (20-25 o C) に戻した後 使用して下さい -17-

19 * Detector Solution を入れたリザーバーと Substrate を入れるリザーバーは 必ず別のものを使用して下さい * Substrate は金属イオンにより酸化されやすいので取り扱いはディスポーザブルの新しい器具を使用して下さい * 金属イオンや微生物などによるコンタミネーションを防ぐため 試薬ボトルからリザーバーへ Substrate を移す際にもディスポーザブルのピペットを使用して下さい また 一度リザーバーに移した Substrate は試薬ボトルへ戻さないで下さい STEP 6. < 反応停止 > リザーバーに移した Stop Solution をマルチチャンネルピペットで 100 µl ずつ各ウェルに添加し 反応を停止します 吸光度の測定 自動分光光度計 ( マイクロプレート専用機 : 垂直透過型 ) にマイクロカップをセットして 波長 450nm の吸光度 ( 副波長 620 nm) を測定します * 吸光度の測定は反応停止後 30 分以内に行ってください * プレートの裏側は汚れのない乾いた状態を保つようにしてください また 吸光度を測 定する前にウェル内に気泡がないことを確認してください 濃度算出 1) Calibrators を多重測定している場合にはそれぞれ平均値を算出します 2) グラフ用紙に標準曲線を作成します [ 横軸に ST2 タンパク質の濃度 (ng/ml) 縦軸に吸光度をとります ] 3) この標準曲線を用いて 検体の吸光度の平均値から濃度を読み取り 検体の希釈倍率を乗じた値 ( 血清の場合 5 倍 ) を測定結果とします * 検体の吸光度が Calibrator 1(4 ng/ml) の吸光度を超えた場合 あるいは 分光光度計 の信頼範囲を超えた場合には 検体をさらに希釈して再測定してください -17-

20 標準曲線の例 absorbance at 450 nm human ST2 concentration (ng/ml) 正常人血清の濃度正常人血清 168 例を測定した場合 下記の結果になりました ( 濃度の算出法に関しては 濃度算出の項を参照してください ) 最大値最小値平均値 = 2.0 ng/ml = 0.1 ng/ml = 0.5 ng/ml SD = 0.3 ng/ml 平均値 + 2SD = 1.1 ng/ml 性能 感度最小検出濃度は ng/ml です リコンビナント ST2 を希釈して測定したとき ng/ml 測定値の平均 +2 SD が ng/ml 測定値の平均 2 SD より小さくなりました -18-

21 再現性 1. 同時再現性試験 血清 5 例を用いて 同時に 8 回測定したところ 下表の結果が得られました Sample serum 1 serum 2 serum 3 serum 4 serum 5 Number of determinations Mean (ng/ml) C.V. (%) ( 測定結果は 検体希釈倍数を乗じた後の値です ) 2. 日差再現性試験 血清 5 例を 8 重測定した平均値を求め これを測定日を変えて 5 回くりかえしたところ 下表の結果が得られました Sample serum 1 serum 2 serum 3 serum 4 serum 5 Number of determinations Mean (ng/ml) C.V. (%) ( 測定結果は 検体希釈倍数を乗じた後の値です ) * 各血清サンプルは 8 重測定しました 添加回収試験血清 4 例を用いて 添加回収試験を行ったところ 下表の結果が得られました ( 測定結果は 検体希釈倍数を乗じた後の値です ) serum 1 (A) additional rhst2 (ng/ml) ST2 concentration observed (ng/ml) (B) recovery (ng/ml) (B/A) recovery rate (%)

22 serum 2 (A) additional rhst2 (ng/ml) ST2 concentration observed (ng/ml) (B) recovery (ng/ml) (B/A) recovery rate (%) serum 3 (A) additional rhst2 (ng/ml) ST2 concentration observed (ng/ml) (B) recovery (ng/ml) (B/A) recovery rate (%) out of range - - serum 4 (A) additional rhst2 (ng/ml) ST2 concentration observed (ng/ml) (B) recovery (ng/ml) (B/A) recovery rate (%) out of range

23 希釈試験血清を Assay Diluent で希釈し測定したところ 下表の結果が得られました ( 測定結果は 検体希釈倍数を乗じた後の値です ) Concentration of ST2 (ng/ml) Dilution Serum 1 Serum 2 Serum 3 Serum 4 Serum 5 Serum 6 関連製品 D065-3 Anti-ST2 (Human) mab D066-3 Anti-ST2 (Human mab D067-3 Anti-ST2 (Human) mab D067-4 Anti-ST2 (Human) mab-fitc D067-5 Anti-ST2 (Human) mab-pe 7650 Human IL-33 Cytokine domain Detection Kit 5332 Ab-Match Assembly Mouse IL-33 kit 5310 Ab-Match Universal kit PM033 Anti-IL-33 (Human) pab M138-3 Anti-IL-33 (Human) mab M161-3 Anti-IL-33 (Mouse) mab M187-3 Anti-IL-33 (Mouse) mab -19-

24 M188-3 Anti-IL-33 (Mouse) mab B Recombinant IL-33 (Human) B Recombinant IL-33 (Mouse) 参考文献 1) Pastorelli, L., et al., PNAS 107, (2010) 2) Mok, M. Y., et al., Rheumatology 49, (2010) 3) Pecaric-Petkovic, T., et al., Blood 113, (2009) 4) Shimizu, M., et al., Hum. Mol. Genet. 14, (2005) 5) Shimpo, M., et al., Circulation 109, (2004) 6) Tajima, S., et al., Chest 124, (2003) 7) Weinberg, E. O., et al., Circulation 107, (2003) 8) Oshikawa, K., et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 165, (2002) 9) Oshikawa, K., et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 164, (2001) 10) Kurosawa, K., et al., HYBRIDOMA 19, (2000) 11) Tominaga, S., et al., Biochem. Biohys. Res. Commun. 264, (1999) 12) Löhning, M., et al., PNAS. 95, (1998) 13) Yanagisawa, K., et al., J. Biochem. 121, (1997) 14) Yanagisawa, K., et al., FEBS Lett. 318, (1993) 15) Lanahana, A., et al., Mol. Cell. Biol. 12, (1992) 16) Tominaga, S., FEBS Lett. 258, (1989) 製造元 株式会社医学生物学研究所 URL TEL US Patent 7,087,