未経産採卵

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1 [ 報文 ] PCR 法による低温増殖性乳酸菌 Lactobacillus sakei UONUMA の判別 西脇俊和 下條明新潟県農業総合研究所食品研究センター Discrimination of the Psychrotrophic Lactic Acid Bacteria Lactobacillus sakei UONUMA Strains using PCR Analysis Toshikazu NISHIWAKI,and Sayaka SHIMOJO Niigata Agricultural Research Institute Food Research Center 要約雪室保存の漬物から分離した低温増殖性乳酸菌 Lactobacillus sakei UONUMA( ウオヌマ株 ) の産業利用において, 菌株の維持 管理, 利用者の権利保護, 利用商品の差別化を図るために PCR 法による検出方法を検討した. その結果, ウオヌマ株 DNA の識別に利用できる PCR プライマーを設計し,PCR 法により食品中からウオヌマ株を検出することが可能となった. 乳酸菌 Lactobacillus sakei は, グラム陽性, カタラーゼ陰性, 通性嫌気性の無芽胞性の桿菌であり, 動植物表面や発酵食品中など自然界に広く生息している. 清酒の伝統的な製造方法である生酛づくりは, 天然の乳酸菌による乳酸生成を活用して雑菌汚染を防止し, 清酒酵母を純粋培養する技術であり,L. sakei はその天然の有用乳酸菌の一つとして知られている (1). また, 欧米で伝統的に行われている発酵肉製造では, 発酵工程中の微生物汚染や腐敗の防止に利用されており, いわゆるバイオプリザベーションとして活用されている (2),(3). 我々は雪室保存の野沢菜漬けから, 低温増殖性を有し雑菌増殖を抑制して良好な風味の醸成に寄与する乳酸菌を分離して L. sakei UONUMA( 以下, ウオヌマ株 ) と命名し, この乳酸菌を利用した発酵食品の製造方法を開発した (4). ウオヌマ株は糖類の資化性の違いから 3 種あり, それぞれウオヌマ-1 株, ウオヌマ-2 株, ウオヌマ-3 株と区別している (4). ウオヌマ株の産業利用において, 菌株の維持 管理, 利用者の権利保護, 利用商品の差別化を図ることが重要であり, そのためにはウオヌマ株の検出技術が必要とされる. そこで本研究では,PCR 法によるウオヌマ株の検出方法を検討し, 同種異株の乳酸菌混在下でもウオヌマ株を個別に判別できる方法を開発したので報告する. 実験方法 ( 材料及び方法 ) 1. 供試菌株 Lactobacillus sakei UONUMA-1 株 ( 以下, ウオヌマ-1 株 ),UONUMA-2 株 ( 以下, ウオヌマ-2 株 ),UONUMA-3 株 ( 以下, ウオヌマ-3 株 ), Lactobacillus sakei の同種異株 (D-52, 分離株 ; X-25, 分離株 ; JCM1157 T, 基準株 ; NBRC3541, 標準株 ; NBRC107130, 標準株 ; HS-1, 市販株 ; D-1001, 市販株 ) を供試した. 2.DNA 試料の調製エッペンチューブに Lactobacilli MRS Broth(Difco 製 ) 溶液を 1ml 分注し, 供試菌体を接種して 時間培養した. 培養液を遠心分離 (13,000rpm 1 分 ) して上清を除去した後, 菌体を滅菌生理食塩水で洗浄した. 再度, 遠心分離して得た菌体ペレットからインスタジーンマトリックス ( バイオ ラッド ( 株 ) 製 ) を用いて DNA 試料を調製した. 3. ウオヌマ株特異的 DNA マーカーの同定 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 法により表 1 の RAPD プライマー 6 種類を用いて, 各菌株 DNA の増幅を行った. すなわち,DNA ポリメラーゼに TaKaRa Ex Taq(5 units/µl, タカラバイオ ( 株 ) 製 ) を 0.5µl 用い, 69

2 添付 10x PCR buffer 2µl, 添付 2.5mM dntps 2µl,20µM RAPD プライマー 1.2µl, 滅菌水 13.3µl,DNA 試料 1µl を添加, 混合 ( 合計 20µl) し, サーマルサイクラー (TaKaRa PCR Thermal Cycler Touch Dice, タカラバイオ ( 株 ) 製 ) を用いて増幅反応を行った. 反応条件は, 前加熱を 94 5 分行った後, 変性 94 5 分, アニーリング 37 1 分, 伸長反応 72 2 分を 40 サイクル行い, 最終伸長反応を 72 5 分とした. 得られた RAPD 増幅産物からウオヌマ株に特異的な DNA 断片を検出して精製を行った. すなわち,RAPD 増副産物 10µl に 6x Loading Dye(TOYOBO( 株 ) 製 )10µl と TE 溶液 (10mM Tris-HCl buffer,1mm EDTA,pH 8.0) 40µl を混合した後,2%(w/v) アガロースゲルに添加し, 100V 35 分電気泳動した. 泳動終了後,DNA 染色液 ( ビューアブルステイン KANTO, 関東化学 ( 株 ) 製 ) に 5 分間浸漬した. 蒸留水でゲルを洗浄した後, ウオヌマ株 DNA 試料に特異的に出現したバンドを切り出し, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen 製 ) を用いて DNA の抽出, 精製を行った. 表 1 RAPD 法で用いたプライマー次に, この DNA の塩基配列決定に必要な試料量を得るために大腸菌によるサブクローニングを行った. すなわち,TA Cloning Kit(Invitrogen 製 ) を用いて,pCR2.1 プラスミドベクターに挿入した後, コンピテントセルに導入した. これを X-Gal( 和光純薬工業 ( 株 ) 製 ) 及びアンピシリン ( 和光純薬工業 ( 株 ) 製 ) を含む LB 寒天培地で 37 1 晩培養した後, 白色のコロニーを採取し, LB 液体培地 (100µg/ml アンピシリンを含む )2ml を用いて 37 1 晩培養した. 菌体洗浄後,PureLink HQ Mini Plasmid Purification Kit(Invitrogen 製 ) を用いてプラスミド DNA を抽出, 精製した. 精製したプラスミド DNA のシーケンス解析は, シーケンスプライマーに T7 Promoter (5 TAATACGACTCACTATAGGG 3 ) 及び M13 Reverse (5 CAGGAAACAGCTATGAC 3 ) を用いて ( 株 ) ファスマック ( 神奈川県 ) に委託した. その解析データによりウオヌマ株に特異的な DNA の塩基配列を決定した. を表 2 のように設計し,PCR によってウオヌマ株 DNA 試料から特異的な DNA バンドを検出できるかどうかを検討した.PCR は以下の条件で行った.DNA ポリメラーゼに KOD FX Neo(TOYOBO( 株 ) 製 ) を 0.5µl 用い, 添付 2mM dntps 5µl,10µM Forward 及び Reverse プライマー ( 設計したプライマー合成は ( 株 ) ファスマック ( 神奈川県 ) に依頼.) 各 0.75µl, 添付 2x PCR buffer 12.5µl, 滅菌水 4.5µl,DNA 試料を 1µl 添加, 混合 ( 合計 25µl) し, 増幅反応を行った. 反応条件は, 前加熱を 94 2 分行った後, 変性 秒, アニーリング 秒, 伸長反応 68 1 分を 40 サイクルとした. 増幅終了後, 反応液 1µl に 6x Loading Dye 1µl と TE 溶液 4µl を混合した後,2%(w/v) アガロースゲルに添加し,100V 35 分電気泳動した. 泳動終了後, アガロースゲルをエチジウムブロマイド溶液に浸漬し, マルチイメージャー (Fluor-S Multimanager, バイオ ラッド ( 株 ) 製 ) で DNA バンドを可視化, 検出した. 5. ウオヌマ株検出 PCR 法の検証前項で確立した PCR 法により複数の菌体混合物中でもウオヌマ株を個別に検出可能か検証を行った. ウオヌマ-1~3 株を含む L. sakei 種 10 株の懸濁液をそれぞれ A660nm=1.0 に調整して等量ずつ混合し, 調製した DNA 試料を用いて前項の方法でウオヌマ株 DNA の検出を行った. 次に, 本 PCR 法が食品中のウオヌマ株 DNA の検出に適用可能か検証した. すなわち, 作製した農産物ペースト ( ごぼう, ほうれんそう, ばれいしょ, にんじん, にがうり, かぐらなんばん, えだまめ, かき及びキャベツをそれぞれ使用 ) 及び市販キムチ (3 製品 ) にウオヌマ株を接種し ( ウオヌマ-1~3 株の懸濁液をそれぞれ A660nm=1.0 に調整後, 等量混合し, その菌体混合液を試料に 1%(v/w) 接種 ),5 10 日間保存した. その後, 滅菌バッグに試料 10g を採取し, 滅菌生理食塩水 90ml を添加してストマッカーを用いて懸濁した. この懸濁液 50ml を遠心分離し, 得られた菌体ペレットを滅菌生理食塩水で洗浄した後, 再度, 遠心分離した. 得られた菌体ペレットに TE 溶液を 2ml 添加して懸濁した後, 懸濁液 200µl をエッペンチューブに採取し, インスタジーンマトリックスを用いてウオヌマ株検出用 DNA 試料を調製した. この試料を用いて前項の方法により DNA を検出してウオヌマ株 DNA の判別を行った. 実験結果及び考察 4. ウオヌマ株検出 PCR 法の検討 得られた塩基配列情報を基に,RAPD プライマーの配 列を含む 19~23 塩基のウオヌマ株検出 PCR プライマー 1. ウオヌマ株特異的 DNA マーカーの同定及び PCR プライマーの設計 70

3 ウオヌマ株を含む L. sakei 種の乳酸菌 DNA を 6 種の RAPD プライマーを用いて RAPD 法により増幅した結果を図 1 に示した. ウオヌマ-1 株は RAPD6 プライマーにより約 1,200bp, ウオヌマ-2 株は RAPD6 プライマーにより約 1,300bp, ウオヌマ-3 株は RAPD2 プライマーにより約 1,100bpの固有の明瞭なバンドが検出された. そこで, これらのバンドから DNA を抽出し, 大腸菌によるサブクローニング, プラスミド DNA のシーケンス解析を経て, 塩基配列を決定し, 得られた塩基配列情報を基に 19 ~23 塩基の PCR プライマーを表 2 のように設計した. PCR プライマーは, 使用した RAPD プライマーの配列を含み,20 塩基前後で 3 末端が G または C となるように設計した. 設計したプライマーにより増幅される DNA (DNA マーカー ) の分子サイズは, ウオヌマ-1 株検出 PCR プライマー (U1-F 及び U1-R) の場合は 1,165bp, ウオヌマ-2 株検出 PCR プライマー (U2-F 及び U2-R) では 1,263bp, ウオヌマ-3 株検出 PCR プライマー (U3-F 及び U3-R) では 1,086bp であった. 図 1 RAPD 法による L. sakei 種乳酸菌の DNA 電気泳動像 A, RAPD2 プライマー ; B, RAPD6 プライマー 1, ウオヌマ-1 株 ; 2, ウオヌマ-2 株 ; 3, ウオヌマ-3 株 ; 4, 分離株 (D-52); 5, 分離株 (X-25); 6, 基準株 (JCM1157) 7, 標準株 (NBRC3541); 8, 標準株 (NBRC107130) 9, 市販株 (HS-1); 10, 市販株 (D-1001); M, サイズマーカー丸印はウオヌマ株 DNA 固有のバンド 表 2 ウオヌマ株検出 PCR プライマーの塩基配列及び DNA マーカーのサイズ 下線部は RAPD プライマー配列部分 図 2 ウオヌマ株検出 PCR プライマーによる検出 A, ウオヌマ -1 株検出プライマー ; B, ウオヌマ -2 株検出プライマー C, ウオヌマ -3 株検出プライマー 1, ウオヌマ -1 株 ; 2, ウオヌマ -2 株 ; 3, ウオヌマ -3 株 ; 4, 分離株 (D-52); 5, 分離株 (X-25); 6, 基準株 (JCM1157) 7, 標準株 (NBRC3541); 8, 標準株 (NBRC107130) 9, 市販株 (HS-1); 10, 市販株 (D-1001); M, サイズマーカー 71

4 2. ウオヌマ株検出 PCR 法の確立設計したウオヌマ株検出 PCR プライマーを用いて L. sakei 種の乳酸菌 DNA の PCR を行った結果を図 2 に示した. ウオヌマ-1 株検出 PCR プライマーでは, ウオヌマ-1 株の DNA に対して約 1.2kbp の位置に単一のバンドが検出され,DNA マーカーの分子サイズ (1,165bp) から想定される位置と一致した. ウオヌマ-1 株以外の DNA に対してもバンドが検出されたが, 約 1.6kbpの位置であり, ウオヌマ-1 株の DNA マーカーとは明らかに異なっていた. 一方, ウオヌマ-2 株検出 PCR プライマーではウオヌマ-2 株のみに, ウオヌマ-3 株検出 PCR プライマーではウオヌマ-3 株のみにそれぞれ単一のバンドが検出された. このことから設計したプライマーによって増幅される DNA の泳動バンドはウオヌマ株を個別に識別可能な DNA マーカーとして利用できることが明らかとなった. 3. ウオヌマ株検出 PCR 法の検証ウオヌマ株検出プライマーによる PCR 法が複数の菌体混合物中の識別に利用できるかどうかの検証を行った. 図 3 に示したように ウオヌマ-1 株検出 PCR プライマーを用いた場合, ウオヌマ-1 株を含む試料については, ウオヌマ-1 株の DNA マーカーが示す約 1.2kbp の位置にバンドが確認された. ウオヌマ-1 株以外の菌株を含む試料でも約 1.6kbp の位置を示すバンドが検出されたが, ウオヌマ-1 株の DNA マーカーの位置とは明らかに異なり, 容易にウオヌマ-1 株の DNA と区別できることが確認された. ウオヌマ-2 株及びウオヌマ-3 株検出 PCR プライ マーを用いた場合は, それぞれウオヌマ-2 株及びウオヌマ-3 株の DNA マーカーが示す位置にバンドが検出された. 以上により菌体混合物中でもウオヌマ株を個別に識別可能であることが明らかとなった. ウオヌマ株の産業利用で想定される加工原料は, 主として野菜等の農産物が挙げられる. 農産物から調製する DNA 試料には, クロロフィル, ポリフェノール, 塩類など PCR の酵素反応を阻害する物質の混在が予想される. また, 発酵物を原料とした場合, 発酵微生物が多数混在し, ウオヌマ株と同種の乳酸菌が存在する可能性もある. そこで, 各種農産物のペースト及び市販キムチにウオヌマ株を接種したものを試料とし, 本 PCR 法がウオヌマ株識別に適用可能かを検証した. まず, ウオヌマ株を接種した農産物ペーストから試料を調製して実施した. この操作により得られる DNA 試料は, 農産物由来の色素で着色しており, 相当量の PCR 阻害物質の混入が予想された. しかし, 図 4 に示したように, ウオヌマ株を接種した農産物ペースト試料は, ウオヌマ-1~3 株の DNA マーカーが検出され,DNA 増幅の阻害は見られなかった. ごぼう, ばれいしょを試料とした場合, ウオヌマ-1 株検出 PCR プライマーによる増幅で約 1.6kbp のバンドが確認されたが, ウオヌマ-1 株の DNA マーカーとは異なることが容易に識別できた. 一方, ウオヌマ株非接種の農産物ペースト試料については, ごぼう, かきの場合を除き, バンドが検出されなかった. ごぼう, かきについては, 複数のバンドが確認されたが, ウオヌマ株検出 DNA マーカーとは異なる位置であった. 図 3 菌体混合物からのウオヌマ株 DNA の検出 A, ウオヌマ-1 株検出プライマー ; B, ウオヌマ-2 株検出プライマー ; C, ウオヌマ-3 株検出プライマー ; 1, ウオヌマ-1 株 ; 2, ウオヌマ-2 株 ; 3, ウオヌマ-3 株 ; 4, L. sakei 10 株混合 ( ウオヌマ株を含む ); 5, L. sakei 7 株混合 ( ウオヌマ株を除く ); M, サイズマーカー矢印はウオヌマ株 DNA マーカー 72

5 図 4 農産物ペースト及び市販キムチからのウオヌマ株 DNA の検出 A, ごぼう ; B, ほうれんそう ; C, ばれいしょ ; D, にんじん ; E, にがうり ; F, かぐらなんばん ; G, えだまめ ; H, かき ; I, キャベツ, J, 市販キムチ (1); K, 市販キムチ (2); L, 市販キムチ (3) N, ウオヌマ株非接種 ; U, ウオヌマ株接種 1, ウオヌマ-1 株検出プライマー ; 2, ウオヌマ-2 株検出プライマー 3, ウオヌマ-3 株検出プライマー ; M, サイズマーカー 市販キムチにウオヌマ株を接種した試料については, ウオヌマ-1~3 株の DNA マーカーが検出された. ウオヌマ株非接種の試料については, 複数のバンドが検出された試料があったが, ウオヌマ株検出 DNA マーカーの位置とは異なっていた. 本研究の供試試料においてはウオヌマ株の識別が可能であったが, 供試していない他の農産物や加工食品を試料とした場合に識別が困難となることも想定される. 本法とは別に,L. sakei 種の DNA を検出するプライマーが開発されており (Forward; 5 -GCT GGA TCA CCT CCT TTC-3, Reverse; 5 -ATG AAA CTA TTA AAT TGG TA-3 ) (5), 上述の方法で調製した DNA 試料を用いて L. sakei 種の識別が可能である. したがって, この L. sakei 種識別 PCR 法と本法の併用によりウオヌマ株の識別が確実となる. 以上の結果から, 本技術は, 食品からウオヌマ-1~3 株の有無を個別に確認することができ, 発酵微生物混在下でもウオヌマ株 DNA の識別が可能であることから, ウオヌマ株の維持 管理, 加工利用の場面でも実用化できると判断された. 引用文献 (1) 黒瀬直孝, 浅野忠男, 川北貞夫, 垂水彰二, 米麹からの低温発酵性 Leuconostoc citreum の分離と諸性質, 生物工学, 82 (5), (2004). (2) Chaillou, S., Champomier-Verges, MC., Cornet, M., Crutz-Le Coq, AM., Dudez, AM., Martin, V., Beaufils, S., Darvon-Rongere, E., Bossy, R., Loux, V. and Zagorec, M., The complete genome sequence of the meat-borne lactic acid bacterium Lactobacillus sakei 23K, Nat. Biotechnol., 23 (12), (2005). (3) Nyquist, O. L., McLeod, A., Brede, D. A., Snipen, L., Aakra, A. and Nes, I. F., Comparative genomics of Lactobacillus sakei with emphasis on strains from meat, Mol. Genet. Genomics, 285, (2011). (4) 西脇俊和, 下條明, 新規乳酸菌およびこの乳酸菌を利用した発酵食品の製造方法, 特許第 号 (2014). (5) Berthire, F. and Ehrlich, S. D., Genetic diversity within Lactobacillus sakei and Lactobacillus curvatus and design of PCR primers for its detection using randomly amplified polymorphic DNA. Int. J. Sys. Bacteriol., 49, (1999). 73

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