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3 / SCAR Sequence characterized amplified region DNA DNA 34 ( GSW100 SP2-002 SR2-015 SR / / / (LP) ) 3 3 DNA DNA SCAR GSW100 SP2-002 SR2-015 SR / / / (LP)

4 SCAR PCR DNA SCAR DNA PCR SCAR ( 2008; Shimada et al. 2009) DNA SCAR SCAR (Nishihara et al. 2008) 20 PCR SCAR DNA 9 DNA -80 SCAR 4

5 DNA U (upper) L (Lower) ( ) ANS Primer Length Sequence ANSintU mer 5'-ATG TCA ACT TTT TAT TGG TCC TAA-3' ANSintL mer 5'-GAG CAC AGC AAG AAC TTT GGT AGC-3' CHI 3 Primer Length Sequence CHI3rdU mer 5'-GAG TGG TTA AGC AGA TGA CAC GAC-3' CHI3rdL mer 5'-AAG AAA ATT GAC AAC ATG CAG AAG-3' FHT 1 (U24 & L356) Primer Length Sequence FHTintU24 24 mer 5'-GAT TCA TTG TTT CCA GCC ATT TGC-3' FHTintL mer 5'-GTC ATG GAT CAC AAA ACA AGA TCA-3' FHT 1 (U906 & L1896) Primer Length Sequence FHTintU mer 5'-TTA CAC AAA AAT AGG GTC AGT TCC-3' FHTintL mer 5'-TCG TTA TAA ATA GAT GTG GTC CTC-3' FHT 1 (U1253 & L1631) Primer Length Sequence FHTintU mer 5'-TTG CAC CTG AAG TAG AAT TTT ACA-3' FHTintL mer 5'-TTC TGA CAG AAC TTC AAG CAA TTT-3' F3'5'H Primer Length Sequence F3'5'HintU mer 5'-TCC ATT GAT TAA AAT GAG GGA CCA-3' F3'5'HintL mer 5'-TAT GGT AAG TTG GGG ATG TCT GAT-3' DFR Primer Length Sequence DFRintU mer 5'-GAG CAC TTG CAT TAT TGT TCA GAA-3' DFRintL mer 5'-GTA GTG TGC TTC ATT CCC TAT GGA-3' FLS Primer Length Sequence Alta_gFLS_U mer 5'- TAG TAT TTG ATT TGA TGA AGA CAG-3' 5

6 Alta_gFLS_L mer 5'- CAT GGC TAC CTA CTA CCT ATG AGT-3' bhlh1 Primer Length Sequence bhlh_u mer 5'- AAG GTG ATC GTT GTG AAA ATG TCT-3' bhlh_l mer 5'- GGC CGT CTA GTT TGG TGG TTG GTT-3' GenElute Plant Genome DNA Miniprep Kit (SIGMA) 1 10 (code: G2N10-1KT) 70 (code: G2N70-1KT) 350 (code: G2N350-1KT) 99.5% 500 ml (Wako, code: ) 2.0 ml ( code: ) 2 x ml ( code: ) 2 x 500 ( 2 mm) ( code: ) 1 kg ExTaq DNA polymerase (TaKaRa Bio) 250U (code: RR001A) 1000U (250U x 4) (code: RR001B) 3000U (250U x 12) (code: RR001C) PCR 0.2 ml 8 (greiner bio-one) 125 (code: ) SeaKem GTG Agarose ( : CMR. TaKaRa Bio) 25 g (TaKaRa code: F0071) 125 g (TaKaRa code: F0070) 500 g (TaKaRa code: F0074) 100 Base-Pair Ladder (GE Healthcare) 100 µg (code: ) * 1 µg/µl TE buffer, 6 x ( 10 x) (XC, BPB ) 20 ( 0.05 µg/µl) 50 x TAE () 500 ml (code: ) 6

7 (and/or ) TE (ph 8.0) () 500 ml (code: ) 1.5 ml (TreffLab, TOHO code: 30050) 1,000 (RAININ) GPS GPS-1000S ( ) 960 GPS-250S ( ) 960 GPS-10GS ( ) C20 DNase/RNase 10mg/mL () 10mL (Code ) GenElute TM Plant Genome DNA Miniprep (SIGMA) Wash Solution Micro Smash MS-100 (TOMY SEIKO) ABI Mupid-2plus (ADVANCE, code: M-2P) (65 C ) (TOMY MX105 ) GenElute TM Plant Genome DNA Miniprep (SIGMA) 7

8 GenElute TM Plant Genome DNA Miniprep (SIGMA) 65 C Elution buffer ( + 1 ) 65 C 1 GenElute Filtration Column 1 GenElute Nucleic Acid Binding Column 1 collection tube 3 1) (70-80 mg) 2 ml [ ( 2 mm) 1/3 ] DNA 80 C 80 C 2) Micro Smash TM MS-100 (TOMY) 5,500 rpm 20 [ (4-5 )] 3) 350 µl Buffer part A 50 µl Buffer part B (SDS SDS ) 4) 65 C 10 ( Buffer part A Buffer part B 5) precipitation solution 1.5 ) 5) Precipitation solution 130 µl 5 6) 5) GenElute Nucleic acid Binding Column 500 µl column preparation solution 15,000 rpm 1 9) 7) 15,000 rpm 5 GenElute Filtration Column 8) 15,000 rpm µl Binding Solution 9) 700 µl 6) GenElute Nucleic acid Binding Column 15,000 rpm 1 ( 8

9 ) 10) collection tube ( ) 500 µl wash solution 15,000 rpm 1 collection tube 500 µl wash solution 15,000 rpm 3 11) collection tube 65 C elution buffer 100 µl 15,000 rpm 1 15,000 rpm 1 12) DNA 20 C µl 6 x loading dye 1 µl 4 µl µl 10 ng lambda phage DNA TAE 0.7% CMR Seakem GTG Agarose (Takara Bio) µl 100 V 30 (1 g/ml ) 30 Lambda phage DNA ng/µl 7) 20 C DNA 9

10 lambda phage DNA 15 lambda phage DNA DNA 10

11 1) 100 pmol/µl PCR 20 pmol/µl 2) PCR (1 ) 14.8 µl 10 x ExTaq reaction buffer (ExTaq ) 2.0 µl 2.5 mm dntp mix (ExTaq ) 1.6 µl Upper primer (20 pmol/µl) 0.5 µl Lower primer (20 pmol/µl) 0.5 µl ExTaq DNA polymerase (Takara Bio) 5U/µl 0.1 µl DNA ( ng/µl ) 0.5 µl 20.0 µl SCAR PCR ( DNA ) PCR + 1 DNA 1 µl 13.8 µl [10 PCR ( )] µl 10 x ExTaq reaction buffer (ExTaq ) 22.0 µl 2.5 mm dntp mix (ExTaq ) 17.6 µl Upper primer (20 pmol/µl) 5.5 µl Lower primer (20 pmol/µl) 5.5 µl ExTaq DNA polymerase (Takara Bio) 5U/µl 1.1 µl µl PCR 19.5 µl PCR DNA ( ng/µl ) 0.5 µl 11

12 3) PCR 94 C C C C 1 72 C 5 10 C PCR 5 µl 6 x loading dye 1 µl TAE 1.6% DNA 100 bp (GE Healthcare ) DNA 12

13 PCR DNA 1) ANS (ANSintU683&ANSintL1142) A: 300 bp 500 bp B: 500 bp C: 300 bp 350 bp D: 300 bp 2 M M M ANS (ANSintU683&ANSintL1142) M 100 bp 13

14 2) CHI 3 (CHI3rdU173&CHI3rdL763) A: 500 bp 600 bp B: 600 bp 900 bp C: 600 bp D: 900 bp E: 700 bp F: 600 bp, 700 bp bp 600 bp 700 bp 900 bp M M M 3 CHI (CHI3rdU173&CHI3rdL763) M 100 bp 14

15 3) FHT 1 (FHTintU24 & FTHintL356) A: 400 bp 2 B: 400 bp bp C: 400 bp M 1 D: 400 bp bp 4 3 B 4 FHT 1 (FHTintU24 & FTHintL356) M 100 bp 15

16 4) FHT 1 (FTHintU906 & FTHintL1898) A: 330 bp B: 330 bp 750 bp C: 750 bp 5 3 B M M 5 FHT 1 (FTHintU906 & FTHintL1898) M 100 bp 16

17 5) FHT 1 (FHTintU1253 & FHTintL1631) A: 400 bp 600 bp B: 600 bp C: 400 bp 6 3 A 6 FHT 1 (FHTintU1253 & FHTintL1631) M 100 bp 17

18 6) F3'5'H (F3'5'HintU1363& F3'5'HintL1974) A: 300 bp B: 650 bp C: 300 bp 650 bp 7 C A 7 F3'5'H (F3'5'HintU1363& F3'5'HintL1974) M 100 bp 18

19 7) DFR (DFRintU853& DFRintL1267) A: 420 bp B: 350 bp 420 bp 500 bp D: 350 bp 420 bp 500 bp 8 A B 350 bp 420 bp 500 bp bp 420 bp 500 bp 8 DFR (DFRintU853& DFRintL1267) M 100 bp 19

20 8) FLS (Alta_gFLS_U2724& Alta_gFLS_L3422) A: 320 bp B: 370 bp C: 420 bp D: 320 bp 370 bp E: 370 bp 420 bp F: 600 bp G: 320 bp 420 bp 9 C G 9 FLS (Alta_gFLS_U2724& Alta_gFLS_L3422) M 100 bp 20

21 9) bhlh1 (bhlh_u336&bhlh_l629) A: 850 bp 1.3 kb B: 1.3 kb C: 850 bp 10 3 A 850bp 1.3kb 10 bhlh1 (bhlh_u336&bhlh_l629) M 100 bp 21

22 SCAR ANS CHI 3 FHT (U24 & L356) FHT (U906 & L1898) FHT (U1253 & L1631) F3'5'H DFR FLS bhlh 1 A A B B A C A C A 2 C F B B A C B G A 3 A C B B A A A C A PCR () ANS CHI 3 FHT (U24 & L356) FHT (U906 & L1898) FHT (U1253 & L1631) F3'5'H DFR FLS bhlh B B A B B A A F C A C A A A A A B B A A B A A F A B A A B A C A B A B A A A A B B C B C A A A C B A A B B A A A A A SCAR 22

23 GeneCleanII kit( ) DNA pcr4topo(invitrogen ) pgem-teasy(promega ) llustra TempliPhi 100 Amplification Kit (GE Healthcare ) DNA PCR PCR M13RV M13M4 BigDye(R) Terminators version 1.1 Cycle Sequencing Kit ABI 3130xl ABI 10 4 Genetyx-Mac ver

24 24

25 25

26 26

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30 GenElute TM Plant Genome DNA Miniprep (SIGMA) DNA ng/ l 94 C C C C 1 72 C 5 10 C 1.6% 30

31 DNA DNA DNA 2 Nishihara, M., Nakatsuka, T., Mizutani-Fukuchi, M., Tanaka, Y., Yamamura, S. (2008) Gentians: From gene cloning to molecular breeding. Floricultural and Ornamental Biotechnology, published by Global Science Books, UK. pp Shimada, N., Nakatsuka, T., Nakano, Y., Kakizaki, Y., Abe, Y., Hikage, T. and Nishihara M. (2009) Identification of gentian cultivars using SCAR markers based on intron-length polymorphisms of flavonoid biosynthetic genes. Scientia Horticulturae 119:

32 32

2

2 2 3 4 TTT TCT TAT TGT TTC TCC TAC TGC TTA TCA TAA TGA TTG TCG TAG TGG CTT CCT CAT CGT CTC CCC CAC CGC CTA CCA CAA CGA CTG CCG CAG CGG ATT ACT AAT AGT ATC ACC AAC AGC ATA ACA AAA AGA ATG ACG AAG AGG GTT

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