11.修正_プレゼン資料（鹿児島大学_池田先生）0711

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あいりみのしま
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1 従来の薬剤探索法では見出すことができなかった新規抗 HCV 剤グアンファシンの同定鹿児島大学大学院医歯学総合研究科難治ウイルス病態制御研究センターセンター長池田正徳

2 従来技術とその問題点 C 型肝炎ウイルス (HCV) に感受性のある唯一動物モデルはチンパンジーのみであるが霊長類であるチンパンジーを使った研究は現在倫理的経済的問題からなされていない現在すべての抗 HCV 剤は唯一 HCV を高率良く増殖させることが可能なヒト肝癌細胞由来の HuH-7 細胞株のみを使って開発されている HuH-7 細胞株という特殊な細胞内環境でのみの抗ウイルス活性の評価を行っていると人体では無効な薬剤が過大評価されたり人体で有効な薬剤が過小評価されてしまう可能性がある

3 新技術の特徴従来技術との比較 HuH-7 細胞株とは異なるヒト肝癌細胞株である Li23 細胞株を第 2 の HCV 感受性細胞株として樹立し HuH-7 細胞株では見いだすことができなかった抗 HCV 活性を有する Guanfacine を見出した現在開発されている Direct Acting Antivirals (DAAs) は驚異的な治療成績を示す一方で 1) ウイルス排除後の肝発癌 2) DAA 治療の HBV 再活性化など新たな課題が出現した

4 従来技術 (DAAs) の問題点 1. HuH-7 細胞株のみによる評価 2. 薬価が高額で医療経済を圧迫 (12 週間の治療で約 700 万円 ) 3. 薬剤耐性変異を有する HCV の出現 4. ウイルス排除後の肝発癌 5. ウイルス排除後に HBV が再活性化

5 想定される用途 HuH-7 では見出すことのできなかった抗 HCV 剤の評価が可能従来の DAAs に対して耐性を示す HCV に対する薬剤候補 Drug repositioning により見いだされた薬剤なので安全性が保証されている

6 実用化に向けた課題 1. 前臨床試験における POC の取得 1. 化合物の最適化

7 企業への期待 1.Guanfacine をリード化合物とする類似化合物の合成 2. 薬剤ライブラリーの提供と Li23 細胞株を用いた抗 HCV 剤のスクリーニング

8 本技術に関する知的財産権発明の名称 : 抗 HCV 活性を有する薬剤出願番号 : 特願出願人 : 国立大学法人鹿児島大学国立大学法人岡山大学発明者 : 池田正徳武田緑加藤宣之

9 肝炎ウイルスには 5 種類ある肝炎ウイルスの種類 A 型肝炎ウイルス (HAV: Hepatitis A Virus) B 型肝炎ウイルス (HBV: Hepatitis B Virus) C 型肝炎ウイルス (HCV: Hepatitis C Virus) D 型肝炎ウイルス (HDV: Hepatitis D Virus) E 型肝炎ウイルス (HEV: Hepatitis E Virus) これ以外に TTV HGV(=GBV-C) などが報告されたが現在では肝炎ウイルスからは除外されている HDV は単独では増殖できず HBV の存在により増殖が可能

10 5 種類の肝炎ウイルス A B C D E

11 慢性肝炎に進展する肝炎ウイルス HBV(HDV) HCV B C D 慢性肝炎 :6 ヶ月以上肝臓に肝炎が持続している状態 HBV と HCV の感染者は世界人口の約 8% と推定されており死に至る最大のウイルス感染症といえる

12 HCV 感染は慢性肝炎肝硬変肝がんへ進行する 70% 急性肝炎慢性肝炎肝硬変 7%/ 年肝がん

13 HCV 感染による肝疾患の疫学抗ウイルス療法 HCV キャリア 200 万人慢性肝炎予防肝硬変肝癌 3.5 万人 / 年 HBV キャリア 110 万人アルコール NASH などウイルスの排除肝不全消化管出血 1.7 万人 / 年肝臓に関連した病気で年間 5 万人以上の方が死亡している

14 抗ウイルス剤の標的部位

15 C 型肝炎ウイルス治療成績 % 34% 55% 75% 89% PEG: PEG-IFN RBV: Ribavirin TPV: Telaprevir SPV: Simeprevir

16 C 型肝炎に対する DAA 製剤の開発状況 2011 PR+telaprevir (NS3) 田辺三菱社 PR+simeprevir (NS3) PR+vaniprevir (NS3) daclatasvir (NS5A) +asunaprevir (NS3) ヤンセンファーマ社 MSD 社ブリストルマイヤーズ社 2015 ledipasvir (NS5A) +sofosbuvir (NS5B) ギリアドサイエンシズ社 ombitasvir (NS5A) +paritaprevir (NS3) アッヴィ社 PR: PEG-IFN/RBV

17 1. ハーボニー (2015 年 9 月 ) C 型慢性肝炎に対する新しい経口配合剤 NS5B 阻害剤 NS5A 阻害剤 + Sofosbuvir Ledipasvir 2. ヴィキラックス (2015 年 11 月 ) NS3/4A 阻害剤 NS5A 阻害剤 + + Ritonavir Paritaprevir Ombitasvir

18 最近の抗 HCV 剤は驚異的な治療成績を達成しているがウイルス排除後の肝発癌が新たな課題となっている Development of hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis C virus infection who achieved sustained virological response following interferon therapy: A large-scale, long-term cohort study (Nagaoki Y, Chayama K et al., J Gastroenterol Hepatol, 2015) 36(3%) of 1094 patients developed HCC after SVR The cumurative rates of HCC at 5, 10, and 14 years were 4%, 6% and 12%, respectively 肝発癌予防に対する新たな戦略 : 抗腫瘍剤のなかで抗ウイルス活性を有する化合物を探索する

19 DAA による HBV 再活性化に関する注意勧告

21 DAA 時代の HCV 研究の課題 1.SVR 後 HCC 2.DAA 治療における HBV の再活性化肝発癌予防 HBV 再活性化予防

22 HCV とレプリコン Hepatitis C Virus: HCV フラビウイルス科ヘパシウイルス属 1 本鎖プラス鎖 RNA 血液を介した感染 HCV 感染者日本 :200 万人以上世界 :2 億人以上 HCV ゲノム RNA(9.6kb) 5 UTR IRES Core E1 E2 NS2 NS3 4B NS5A NS5B 3 UTR 構造領域非構造 (NS) 領域 HCV レプリコン (Lohmann et al. Science 1999) ΔC 5 UTR Neo R EMCV IRES NS3 4B NS5A NS5B 3 UTR Con-1 株遺伝子型 1b

23 HCV の生活環細胞 5 3 放出翻訳複製核粒子形成

24 全長 12 kb RNA RL アッセイシステム C P7 NS4A 5 EMCV RL Neo R C E1 E2 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B 3 IRES HCV 外来性 HCV レニラルシフェラーゼ (RL) を発現する全長 HCV RNA 複製細胞に薬剤を添加し時間後にルシフェラーゼ活性を測定する HCV RNA(%) RT-PCR による従来法 IFN- (IU/mL) 添加 24 時間後 (LightCycler PCR) よく一致する RL アッセイシステムルシフェラーゼ活性を測定 IFN- (IU/mL) 添加 24 時間後

25 OR6 アッセイシステムを用いて見出した抗 HCV 剤候補医薬品やサプリメント論文発表本来の薬効や機能治療剤としての現状スタチン剤 Hepatology ( 06) 高脂血症治療剤臨床試験 ( 全国 ) フルバスタチン (EC 50 ; 0.9 mm) 治癒率 70%? テプレノン Liver Int ( 11) 抗潰瘍剤臨床試験 ( 岡山 ) (EC 50 ; 5 mg/ml) ミゾリビン (EC 50 ; 100 mm) BBRC ( 05) リウマチ治療剤ビタミン D2 生理活性物質 (EC 50 ; 4 mm) AAC ( 07) 栄養補助剤ハイドロキシウレア (EC 50 ; 60 mm) Arch Virol ( 10) 慢性骨髄性臨床試験 ( 横浜 ) 白血病治療剤 Antiviral Ther ( 10) 国内外特許出願ラロキシフェン (EC 50 ; 1 mm) JGV( 12) 骨粗鬆症治療剤 N-251 (EC 50 ; 3 mm) PLoS ONE ( 13) 抗マラリア剤臨床試験予定オンコスタチンM (EC 50 ; 0.7 ng/ml) FEBS Lett ( 09) IL6ファミリー ( 肝分化誘導抗腫瘍効果 ) 5-HETE (EC 50 ; 2 mm) 国内特許出願アラキドン酸代謝産物

26 2 種類の肝細胞株における相違点 HuH-7 細胞肝細胞がん日本人男性 57 歳岡山大学 (1982 年 ) IL28B SNP:rs T/G ( インターフェロン治療抵抗性 ) 全長 HCV RNA 複製細胞システム OR6 細胞 (Ikeda et al. BBRC 2005) Li23 細胞肝細胞がん日本人男性 56 歳国立がんセンター (1987 年 ) IL28B SNP:rs T/T ( インターフェロン治療感受性 ) 全長 HCV RNA 複製細胞システム ORL8 細胞 (Kato et al. Virus Res 2009) HuH-7 細胞と Li23 細胞はリバビリンやメトトレキサートなどの抗 HCV 剤に対して異なる薬剤感受性を示す

27 図 3 肝細胞およびウイルス株の背景細胞株年齢性別人種細胞の由来 IL28B SNP rs rs HuH-7 57 男日本人肝細胞癌 T/G C/T Li23 56 男日本人肝細胞癌 T/T C/C HCV 株遺伝子型臨床 Core a.a. (70/91) ISDR HCV RNA 複製細胞 HuH-7 Li23 O 1b ヘルシーキャリアー Q/L 0 OR6 ORL8 1B-4 1b ヘルシーキャリアー R/L 0 1B-4R 1B-4RL KAH5 1b 急性肝炎 Q/L 1 KAH5R KAH5RL IL28B SNP で rs が T/T だと IFN 感受性 rs が C/C だと IFN 感受性 ISDR の変異が 2 個以上だと IFN 感受性 Core aa70 が野生型 (R) だと IFN 感受性 Core aa91 が野性型 (L) だと IFN 感受性

全長 HCV 増殖レポーターアッセイ系による薬剤感受性の評価 C P7 NS4A 5 EMCV RL Neo R C

KAH5R ORL8 1B-4RL KAH5RL IFN-α (IU/ml) 0.94 0.58 0.44 0.

06 0.05 IFN-λ1 (ng/ml) >40.00 10.00 1.45 0.02 0.08 0.

37 0.31 0.35 0.19 0.24 0.25 PTV (µm) 0.58 0.39 0.86 0.08 0.

28 全長 HCV 増殖レポーターアッセイ系による薬剤感受性の評価 C P7 NS4A 5 EMCV RL Neo R C E1 E2 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B 3 IRES HuH-7 Li23 OR6 1B-4R KAH5R ORL8 1B-4RL KAH5RL IFN-α (IU/ml) IFN-γ (IU/ml) IFN-λ1 (ng/ml) > OSM (ng/ml) CsA (μg/ml) PTV (µm) IFN: Interferon OSM: Oncostatin M CsA: Cyclosporine A PTV: Pitavastatin EC 50

29 2 種類の肝細胞株を用いたメトトレキサートに対する薬剤感受性の違い Ueda et al. BBRC 2011 HuH-7 細胞と Li23 細胞はメトトレキサートに対して異なる薬剤感受性を示す

30 細胞株による IFN-λ1 に対する感受性 RLU (%) OR6 ORL IFN-λ1 (ng/ml) IFN-λ1 (ng/ml) OR ORL8

31 ORL6 と ORL8 のリバビリンに対する感受性 RLU (%) Cell number (%) Core OR6 EC 50 : >100 mm リバビリン (mm) ORL8 EC 50 : 8.7 mm リバビリン (mm) kda 21 NS5B b-actin ORL8 は患者血中濃度 (10-14mM) で抗 HCV 活性を示す

1 1 10 IFN-λ1 (ng/ml) ORL8 RLU (%) 100 10 1

32 OR6 および ORL8 細胞における IFN-λ1 と RBV 併用効果 1000 OR6 RLU (%) (-) IFN-λ1 (ng/ml) ORL8 RLU (%) RBV (-) RBV 12.5µM RBV 25µM RBV 50µM 0.1 (-) IFN-λ1 (ng/ml)

33 HuH-7 および Li23 細胞由来の JFH-1 感受性細胞株 C P7 NS4A 5 EMCV RL C E1 E2 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B 3 IRES HCV strain genotype clinical condition HCV permissive cells HuH-7 Li23 JFH 1 2a Fulminant hepatitis RSc D7 HCV JFH-1 株は現在感染性 HCV 粒子産生が可能な唯一の HCV 株

34 HCV 培養細胞系 C NS4A 5 RL Neo R EMCV IRES NS3 NS4B NS5A NS5B 3 C P7 NS4A 5 EMCV RL Neo R C E1 E2 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B 3 IRES 細胞株 HuH-7 Li23 HCV 株 Sub full Sub full O so OR6 ND ORL8 1B-4 s1b-4r 1B-4R ND 1B-4RL KAH5R skah5r KAH5R ND KAH5RL JFH1 RSc D7

35 Li23 細胞で Guanfacine HCl は抗 HCV 活性を示す細胞薬剤解析 -24h 0h 72h Relative RL Activity (%) (-) Guanfacine-HCl (µm) EC 50 : µm Cell Viavility (%) (-) Guanfacine-HCl (µm) CC 50 : 128 µm Guanfacine-HCl (µm) (-) Core β-actin 21 kda 42 kda

36 HCV JFH-1 株においても Guanfacine HCl は抗 HCV 活性を示す細胞薬剤解析 -24h 0h 72h Relative RL Activity (%) Cell Viavility (%) EC 50 : 1.23 µm (-) Guanfacine-HCl (µm) CC 50 : 139µM 0 (-) Guanfacine-HCl (µm)

37 HuH-7 系細胞では Guanfacine HCl は抗 HCV 活性を示さない細胞薬剤解析 -24h 0h 72h OR6 RSc JRN/35B Relative RL Activity (%) (-) Relative RL Activity (%) (-) Guanfacine-HCl (µm) Guanfacine-HCl (µm)

38 Guanfacine ( エスタリック ) 降圧剤 (α2 アドレナリン受容体作動薬 ) アドレナリン受容体のうち α2 受容体のみが抑制性の G タンパク (Gi) 共役型でありセカンドメッセンジャーの camp を減少させる 2005 年効果がないため販売中止となった製造 : 日本チバガイギー発売 : ノバルティス販売 : 持田製薬 camp を抑制して作業記憶を改善 2013 年より小児の ADHD に対して治験開始塩野義 /Shire( アイルランド ) が日本で申請準備中 (2015 年 8 月 )

39 お問い合わせ先国立大学法人鹿児島大学産学官連携推進センター知的財産部門鹿児島市郡元 TEL: FAX:

日本内科学会雑誌第105巻第3号

日本内科学会雑誌第105巻第3号 Direct acting antivirals(daa) で変わる C 型肝炎治療坂本直哉 Key words direct-acting antivirals,protease inhibitor,ns5a inhibitor,polymerase inhibitor, interferon-free protocol はじめに 1.HCV の遺伝子構造と感染ライフサイクル C 型肝炎ウイルス