バイオインフォマティクス第四回

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そうにいだ
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1 IT BIO バイオインフォマティクス第 4 回藤博幸

2 本日の講義 (1) 分子系統解析の概要 (2) 犯罪捜査への応用

3 本日の講義 (1) 分子系統解析の概要 (2) 犯罪捜査への応用

4 分子系統解析の手続き (1) 相同配列の収集系統分類の場合はオーソロガスな配列を収集 (2) 相同配列のマルチプルアラインメントの作成 (3) アラインメントから分子系統樹を構築

5 分子系統解析の手続き (1) 相同配列の収集系統分類の場合はオーソロガスな配列を収集例えば BLAST で検索して収集 (2) 相同配列のマルチプルアラインメントの作成例えば mafft で構築 (3) アラインメントから分子系統樹を構築

6 orthologous, ortholog 種分化に伴い分岐相同 (homologous, homolog) 共通祖先から分岐 paralogous, paralog 遺伝子重複に伴い分岐

7 種系統樹と遺伝子系統樹分子系統樹種系統樹 (Species Tree) オーソロガスな遺伝子のみ使用生物の進化的関係を反映遺伝子系統樹 (Gene Tree) パラロガスな遺伝子もオーソロガスな遺伝子も混在遺伝子 ( タンパク質 ) の分子進化の歴史を反映

8 種系統樹と遺伝子系統樹系統分類に利用オーソログの同定が鍵系統関係がわかれば同定できる? いたちごっこ分子系統樹種系統樹 (Species Tree) オーソロガスな遺伝子のみ使用生物の進化的関係を反映遺伝子系統樹 (Gene Tree) パラロガスな遺伝子もオーソロガスな遺伝子も混在遺伝子 ( タンパク質 ) の分子進化の歴史を反映

9 枝の先 ( 葉 ) に生物種などが配置される枝の長さは生物種間の何らかの形質の違いを反映した量を表す ( 形態の差異遺伝子の有無遺伝子中の塩基置換など ) もしそれらの違いが時間と共に増大するならば枝の長さは近似的に時間に比例有根樹 (Rooted tree) の表現例根 (root) 枝 (branch, edge) 葉 (leaf, node) 過去現在なお系統樹に含まれる操作単位 ( 生物遺伝子 ) を OTU (Operational Taxonomic Unit) とよぶ

10 有根樹と無根樹有根樹 (Rooted tree) 無根樹 (Unrooted tree) Edge ( 枝 ) Node 節 (Internal node 内部節 ) (External node 外部節 = leaf = 葉 )

11 有根樹と無根樹有根樹 (Rooted tree) 無根樹 (Unrooted tree) Node 節 (Internal node 内部節 ) (External node 外部節 = leaf = 葉 )

12 有根樹と無根樹有根樹 (Rooted tree) 無根樹 (Unrooted tree) Node 節 (External node 外部節 = leaf = 葉 )

13 主な分子系統樹推定法 (1) 距離行列法 (2) 形質状態法最節約法 (Maximum Parsimony Method) 統計的方法最尤法 (Maximum Likelihood Method) ベイズ法

14 主な分子系統樹推定法 (1) 距離行列法 (2) 形質状態法最節約法 (Maximum Parsimony Method) 統計的方法最尤法 (Maximum Likelihood Method) ベイズ法

15 距離行列法 (1) アラインメントから全ての配列ペアの間の距離を計算 (2) 距離行列 (distance matrix) の構築 (3) 距離行列に基づき系統樹を構築

16 距離行列法距離行列法として複数の系統樹構築法が提案されているがここでは現在最も広く利用されている近隣結合法 (neighbor-joining method) について説明する

17 距離行列法 (1) アラインメントから全ての配列ペアの間の距離を計算 (2) 距離行列 (distance matrix) の構築 (3) (2) の距離行列に基づき系統樹を構築 (1), (2) は様々な距離行列法で共通 (3) の部分が距離行列法の手法により異なるただし (1) には複数の手法がある

18 距離行列法 (1) アラインメントから全ての配列ペアの間の距離を計算 (2) 距離行列 (distance matrix) の構築 (3) 距離行列に基づき系統樹を構築

19 最も簡単な配列間距離 =p 距離 (p distance) N ヌクレオチドの長さの二つの配列で M サイトに差異がある場合 p-distance = M / N p 距離の問題点多重置換 ( 復帰置換や平行置換を含む ) = 同じサイトでの複数回の置換 > 数回分の変化が隠されてしまう

20 7 回現在の配列 1 CTCAAGAC CTTAAGAC CTTAAAAC CTTAGAAC ATTAGAAC ATTACAAC ATTACGAC 祖先配列 TTCAAGAC 平行復帰 ATTACGAC TCTACGAC TCCAAGAC TCCACGAC TCTACGAC 3 回現在の配列 2 実際のサイトあたりの置換数 = (3 + 7) / 8 = 1.25 p 距離 = 2 / 8 = 0.25

21 進化モデルを考え観測値から真の距離を推定する塩基の進化モデルの例 (1) JC69 全ての塩基は同じ速度で他の塩基に置換 (2) K80 トランジション ( プリン間あるいはピリミジン間の置換 ) とトランスバージョン ( プリンとピリミジン間の置換 ) では異なる速度この他にも多くの進化モデルが考えられ距離の推定が行われているアミノ酸でも同様に多くの進化モデルが考えられており観測値からの真の距離の推定が行われている

22 マルチプルアラインメント中の全ての配列のペアに対して選択した進化モデルにしたがって距離を計算種 1 種 2 種 3 種 4 種 5 マルチプルアラインメント選択された進化モデル種 1 と種 2 の距離 d12 種 1 と種 3 の距離 d12... 種 4 と種 5 の距離 d45

23 距離行列法 (1) アラインメントから全ての配列ペアの間の距離を計算 (2) 距離行列 (distance matrix) の構築 (3) 距離行列に基づき系統樹を構築

24 マルチプルアラインメント中の全ての配列のペアに対して選択した進化モデルにしたがって距離を計算種 1 種 2 種 3 種 4 種 5 マルチプルアラインメント選択された進化モデル種 1 と種 2 の距離 d12 種 1 と種 3 の距離 d12... 種 4 と種 5 の距離 d45

25 計算された配列ペアの距離を行列の形にまとめる種 1 と種 2 の距離 d12 種 1 種 2 d12 種 3 d13 d23 種 4 d14 d24 d34 種 5 d15 d25 d35 d45 種 1 種 2 種 3 種 4 種 5 距離行列種 1 と種 3 の距離 d12... 種 4 と種 5 の距離 d45 dij = dji なので上半分は表示していない

26 距離行列法 (1) アラインメントから全ての配列ペアの間の距離を計算 (2) 距離行列 (distance matrix) の構築 (3) 距離行列に基づき系統樹を構築近隣結合法について説明

27 種 5 種 1 種 2 種 4 種 3 種 5 種 4 種 1 星状系統樹種 2 種 3... 種 5 種 4 種 1... 種 4 種 3 それぞれの系統樹について距離行列から枝の長さの総和を求める任意の二つの OUT を組んだ全ての樹形を発生させる種 3 種 4 種 5 種 2 種 1

28 枝の長さの総和とは種 5 種 1 L1 種 2 L5 L2 L6 種 4 L4 L3 種 3 L1 + L2 + L3 + L4 + L5 + L6

29 距離行列からの枝の長さの求め方の基本的な考え方 ( 配列 3 つのケースを例として ) 距離行列 L1 L2 L3 種 1 種 2 d12 種 3 d13 d23 種 1 種 2 種 3 L1 + L2 = d12 L1 + L3 = d13 L2 + L3 = d23 系統樹と距離行列から連立方程式をつくる L1 = L2 = L3 = d13 d23 + d12 2 d12 d13 + d23 2 d13 d12 + d23 2 方程式を解いて L1 + L2+L3 を求める

30 種 5 種 1 種 2 種 4 種 5 種 1 種 3 種 3 種 4... 種 4 それぞれの系統樹について距離行列から枝の長さの総和を求める枝の長さの総和が最小になるペアリングを選択種 3 種 4 種 5 種 2 種 1

31 種 5 種 1 種 2 枝の長さの総和が最小のペアを選択することの意味種 4 種 3 種 5 種 1 種 3 枝の長さは距離 (= サイトあたりの置換数 ) から計算される種 4 種 3... 種 4 種 4 種 5 枝の長さの総和が最小であるとは距離行列から計算されるその系統樹の形の上で生じた置換の総数が最小であることを意味する種 2 種 1

32 種 5 種 1 種 2 種 4 種 3 今種 1 と種 3 のペアリングにおいて枝の長さの総和が最小になったする種 5 種 1 種 3 種 5 種 1 種 3 種 4... 種 4 種 4 種 4 種 3 種 4 種 5 種 2 種 1 種 1 と種 2 を OUT から外し種 1 と種 2 をペアとした新たな OUT を考え距離行列を再構築

33 距離行列の更新種 2 種 4 d24 種 5 d25 d45 種 1-3 d2,1-3 d4,1-3 d5,1-3 種 2 種 4 種 5 種 1-3 d2,1-3= d4,1-3= d5,1-3= d12 + d23 d13 2 d14 + d34 d13 2 d15 + d35 d13 2

34 更新された距離行列をもとに同じ処理を繰り返す OUT の数が 3 になったところで繰り返しを停止する上記の例であれば種 2 種 4 種 2 種 5 種 2 種 1-3 種 5 種 1-3 種 4 種 1-3 種 4 種 5 の 3 つの樹形から枝の長さの総和が最小のものを選択種 2 と種 5 がペアをつくったものが最小であったとするここで OUT 数が 3 となりこの結果の系統樹は次のようになる

35 種 1 種 3 種 2 種 5 種 2 無根系統樹が得られる近隣結合法では進化速度の一定性は仮定されていないので一つの内部節から分岐した外部節への枝の長さが異なることに注意

36 分子系統解析では系統樹は無根系統樹として作成される根の導入は外群 (outgroup) を用いてなされる進化速度の一定性が成立する場合 (= 分子時計が成立している場合 ) を除き注目するグループの根を決められない多くの場合分子時計の一定性は仮定できない

37 外群の利用研究対象である群 : 内群 (ingroup) 内群に対して遠い関係であることがわかっているもの : 外群 (outgroup), 外群を含めて系統樹を構築全体としては無根系統樹だが内群の根 (root) を決めることができる今種 1~4( 哺乳類 ) の系統関係を調べたい根を導入するために種 5( 爬虫類 ) を外群として導入種 5 種 1 内群の根種 2 種 3 種 4

38 最尤法ベイズ推定プログラム PHYLIP ( 最尤法最節約法距離行列法など PAUP* ( 最尤法最節約法距離行列法など Molphy ( 最尤法 RAxML ( 最尤法 MEGA ( 最尤法 MrBayes ( ベイズ推定を導入した系統樹推定

39 本日の講義 (1) 分子系統解析の概要 (2) 犯罪捜査への応用

40 ルイジアナ州ラファイエット Maria Jones (20) 看護師既婚 Robert White (34) 消化器科の医者既婚いわゆる W 不倫離婚妻と離婚することを約束するが守らない

41 Maria Jones (20) 看護師 Robert White (34) 消化器科の医者既婚妻と離婚することを約束するが守らない 10 年間つきあったがついに別れることを決心 1994 年 7 月異常に嫉妬深く支配的 (Maria が他の男性を見ただけで彼らを殺すなどという )

42 Maria Jones (20) 看護師関係が悪化する前定期的にビタミン B12 の注射をしていた Robert White (34) 消化器科の医者既婚 1994 年 8 月深夜に Maria が息子とベッドで眠っている所に Robert がやってきてもう一度注射をしたいという Maira は疲れており深夜であることから断ったが注射されてしまう Maira は何かがおかしいと感じたこれまで感じたことのない強い痛みを覚えた

43 2 週間後 Maira のリンパ節が腫れ上がった ( ウイルス感染を意味する ) 12 月の定期検診で HIV 陽性 HCV 陽性であることが判明 Maira は Robert を疑い 1995 年 1 月に警察に訴えた

44 当初警察は Maira の訴えをまじめに捉えていなかったしかし (1) の期間に Maria が関係を持った男性は全員 HIV 陰性であった (2) Maira について問い合わせた時に Robert は嘘をついていた (3) Robert の患者の記録の中に 8 月初頭に 2 つの血液サンプルがとられているにも関わらず適切な検査記録がないものがあることを警察が見つけた血液サンプルの一方は AIDS 患者からのもので他方は C 型肝炎の患者からのものであった 2 人の患者は Robert から研究のために血液サンプルが欲しいといわれ提供していた

45 Robert の注射によって Maria は HIV と HCV に感染した可能性が高いしかし検察は Maira の HIV が他の人から感染したのではなく Robert の患者のサンプルに由来するという確固とした証拠を必要とした (1) Maria から分離した HIV, (2) Robert の患者から分離した HIV, (3) 同じ地域の他の AIDS 患者から分離した HIV で分子系統解析が行われた

46 配列データの入手法については今回の資料の最後に書いてある今回のデータは既に論文になっており NCBI から入手可能今回は mafft で作成したアラインメントデータ (hivpol.aln) を用いて系統樹を構築する

47 P1.BCM.RT P4.BCM.RT P7.BCM.RT P3.MIC.RT P5.MIC.RT P2.BCM.RT P1.MIC.RT P2.MIC.RT P3.BCM.RT P5.BCM.RT V1.BCM.RT V2.BCM.RT P6.MIC.RT V1.MIC.RT V2.MIC.RT P4.MIC.RT P6.BCM.RT LA04.RT LA21.RT LA24.RT LA31.RT LA10.RT cccataagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc cccataagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc cccataagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc ttaaattttcccataagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc ttaaattttcccataagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc cccataagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc ttaaattttcccataagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc ttaaattttcccataagtcctattgaaactgtaccagtaaaattagagc cccataagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc cccataagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc cccataagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc cccataagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc ttaaattttcccataagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc ttaaattttcccataagtcctgttgaaactgtaccagtaaaattaaagc ttaaattttcccataagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc ttaaattttcccataagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc cccataagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc cccattagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc cccattagtcctattgraactgtaccagtaaaattaaagc cccattagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc cccattagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc cccattagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagc

48 準備したファイルでは配列の名前を短くしてあります V で始まる名前 victim = Maria から分離された HIV の RT P で始まる名前 patient=robert の患者から分離された HIV の RT LA で始まる名前 Lafeyette で生活する AIDS 患者から分離された HIV の RT RT = Reverse Transcriptase 逆転写酵素

49 得られたアラインメントを使って MEGA で系統樹を作成 (1) MEGAを起動してmafftで作成したアラインメントの読み込み (2) MEGA 形式へのデータの変換 (3) モデル選択 (1) 近隣結合法による系統樹の構築

50 得られたアラインメントを使って MEGA で系統樹を作成 (1) MEGAを起動してmafftで作成したアラインメントの読み込み (2) MEGA 形式へのデータの変換 (3) モデル選択 (1) 近隣結合法による系統樹の構築

51 MEGA の起動 2 下部ウィンドウに MEGAと入力 1 左下のスタートをクリック 3MEGA のアイコンが出てくるのでクリックして起動

52 起動画面左上に注目

53 メニューバーの File をクリック

54 Open A File/Session を選択

55 ファイル選択のウィンドウが表示される

56 前ページのファイル選択ウィンドウを拡大したものスクロールバーで表示位置を変更しながらファイルを探して選択

57 ファイルがおかれているフォルダを選択してクリック

58 1 2 3 ファイルを選択すると File name ウィンドウにファイル名が現れるこの状態で Open をクリック

59 アラインメントを表示するウィンドウが表意される

60 得られたアラインメントを使って MEGA で系統樹を作成 (1) MEGAを起動してmafftで作成したアラインメントの読み込み (2) MEGA 形式へのデータの変換 (3) モデル選択 (1) 近隣結合法による系統樹の構築

61 Utilities をクリックアラインメントを表示するウィンドウが表意される

62 Convert to MEGA Format を選択

63 OK をクリック

64 MEGA 形式のデータを保存するファイル名を入力するウィンドウが開く * の部分を書き換える拡張子 (.meg) は変更してはいけない

65 前ページのファイル名入力ウィンドウを拡大ファイル名を * から書き換える

66 変換が終了したことを示すメッセージ OK をクリック

67 MEGA 形式に変換されたアラインメントが表示される

68 得られたアラインメントを使って MEGA で系統樹を作成 (1) MEGAを起動してmafftで作成したアラインメントの読み込み (2) MEGA 形式へのデータの変換 (3) モデル選択 (1) 近隣結合法による系統樹の構築

69 2 Find Best DNA.Protein Models (ML) をクリック 1 Models をクリック

70 現在 active ばファイル (=hivpol.meg) を使用するかを聞いてくるウィンドウが開く Yes をクリック

71 モデル選択の計算のオプション確認のウィンドウが開く黄色の部分が Automatic Nucleotide Complete deletion になっていることを確認して Compute をクリック

72 計算経過を示すウィンドウが開く

73 結果画面出力行がモデル列に情報量基準とパラメータが書かれている

74 BIC, AICc : 情報量基準この表が BIC でソートされている情報量は小さい方が良い lnl: 対数尤度大きい方が良い BIC 最小の T92+G モデルを今回使用することにするこのウィンドウは閉じる

75 得られたアラインメントを使って MEGA で系統樹を作成 (1) MEGAを起動してmafftで作成したアラインメントの読み込み (2) MEGA 形式へのデータの変換 (3) モデル選択 (1) 近隣結合法による系統樹の構築とbootstrap 解析

76 1 Phylogeny をクリックしプルダウンメニューから 2 Construct/Test Neighbor-Joining Tree を選択

77 現在 active なファイル (=hivpol.meg) を使用するかを問い合せるウィンドウが開くので Yes をクリック

78 計算の設定を問い合わせるウィンドウが開く黄色の部分が変更可能

79 Bootstrap 法デフォルトのリサンプリング回数は 500 まんで右端をクリックした時に現れる上下の矢印の上向矢印をクリックし 1000 にする

80 Model/Method はデフォルトは No. of differences になっているモデル選択の結果に従い T92+G に変更する Tamura 3-parameter モデルは 1992 に提案されておりこれが T92 に相当すると考えられるのでこれを選択

81 Tamura の 3 パラメータを選択すると Rates among Sites では Gamma Distributed が自動的に選択されるこれがモデル選択の +G の部分

82 Compute をクリックして計算

83 計算の進行状況を示すウィンドウが表示

84 計算が終わると系統樹が別のウィンドウに表示される

85 Victim (Maria) から単離された HIV は Robert の患者から単離された HIV に近縁 ( ただし bootstrap support (bootstrap probability ともよぶ ) 小さい )

86 デフォルトでは Original Tree が表示されている Bootstrap consensus tree のタブを選択

87 1000 回の bootstrap サンプルのそれぞれについて構築された系統樹のコンセンサスが示される系統樹の枝振り ( トポロジー ) についてのみコンセンサスが示されており枝の長さには意味はないコンセンサスでも Victim 由来 HIV は Patient 由来 HIV に近い再び Original tree タブを選択

88 1 Original tree タブを選択しオリジナルの系統樹を表示 2 メニューバーの File をクリック 3 Export Current Tree (Newick) を選択

89 Newick 形式のデータを保存するファイル名を聞いてくるので Hivpol.nwk とファイル名を指定して Save をクリック

90 hivpol.nwk をメモ帳で開く (((((((((((((((V1.MIC.RT: ,V2.MIC.RT: )0.8910: ,P6.MIC.RT: )0.1770: ,V1.BCM.RT: )0.1240: ,P 5.BCM.RT: )0.1580: ,V2.BCM.RT: )0.6510: , P6.BCM.RT: )0.2560: ,(P3.MIC.RT: ,(P5.MIC.RT: ,(P4.BCM.RT: ,(P1.BCM.RT: ,P7.BCM.RT: )0.3290: )0.6290: )0.3700: )0.1450: )0.1300: ,(P2.MIC.RT: ,(P3.BCM.RT: ,P4.MIC.RT: )0.3170: )0.3800: )0.2950: ,P2.BCM.RT: )0.1530: ,LA32.RT: )0.1380: ,(LA08.RT: ,LA05.RT: )0.4190: )0.2030: ,P1.MIC.RT: )0.3350: ,LA1 8.RT: )0.0810: ,((((LA29.RT: ,LA06.RT: ) : ,LA12.RT: )0.1500: ,(LA28.RT: ,LA07.RT : )0.5010: )0.0890: ,((LA10.RT: ,LA23.RT: )0.4210: ,((((LA04.RT: ,LA25.RT: )0.2190: ,LA27.RT: )0.1520: ,(LA22.RT: ,LA30.RT: )0.2420: )0.0260: ,((LA17.RT: ,LA13.RT: )0.5080: ,(LA31.RT: ,(LA14.RT: ,(LA21.RT: ,LA24.RT: )0.8140: )0.2290: )0.1320: ) : )0.0090: )0.0210: )0.0200: )0.1420: ,LA16.RT: )0.5290: ,(LA26.RT: ,LA02.RT: )0.5290: ); Newick 形式とは系統樹の情報をテキストとして記述したもの

92 1998 年 Robert White は二級殺人について有罪判決をうけ現在 50 年の禁固刑に服している合衆国の法廷ではじめて分子系統解析が利用されたのがこの事件

93 モデル選択のモデルとは何か距離の最尤推定とは何か bootstrap support (bootstrap probablity) とは何か? Newick 形式とは何か?

94 参考文献 Samuelsson, T. (2012) Genomics and Bioinformatics - An Introduction to Programming Tools - Cambridge Univ Press

95 今回の配列データの入手と mafft によるマルチプルアラインメント

96 配列データは NCBI に登録されている AY AY 配列を取得 Multi FASTA 形式のファイルで保存 mafft で multiple alignment MEGA で系統解析

97 NCBI をググるクリック

98 1 AY を入力 2 Search をクリック

99 前ページの入力ウィンドウを拡大したもの

100 Genes の中の PopSet をクリック

101 前ページの Genes 部分を拡大 PopSet をクリック

102

103 前ページのトップを拡大 FASTA をクリック

104 Multi-Fasta 形式で配列が表示される

105 前ページの図のトップを拡大画面右上の Send to をクリック

106 Send to をクリックすると図のようなメニューが出てくる File をチェックすると下部のメニューが出てくるので最下段の Create File をクリック

107 OK をおしてファイルを保存

108 ダウンロードされたファイルには Multi-Fasta 形式で塩基配列が含まれている >gi gb AY HIV-1 clone P1.BCM.RT from USA reverse transcriptase (pol) gene, par CCCATAAGTCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAAT GGCCACTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGAAAAGGAAGGAAAAAT TTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAA TGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTTAATAAGAGAACTCAGGACTTCTGGGAAGTTCAATTAGGAA TACCACATCCTGCAGGGTTAAAAAAGAAAAAATCAGTAACAGTGCTGGATGTGGGTGATGCATATTTTTC AGTTCCCTTAGATAAAGAGTTCAGGAAGTATACTGCATTTACCATACCTAGTATAAACAATGAGACACCA GGGATTAGATATCAGTACAATGTGCTTCCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAAAGTAGCA TGACAAAAATCTTAGAGCCTTTTAGAAAACAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGATCT GTATGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAATAAAAATAGAGGAACTAAGACAACATCTGTTG AAGTGGGGACTTACCACACCAGACAAAAAACATAAGAAGGAACCCCCATTCCTTTGGAT >gi gb AY HIV-1 clone P2.BCM.RT from USA reverse transcriptase (pol) gene, par CCCATAAGTCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAGCAAT GGCCACTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGAAAAGGAAGGAAAAAT TTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAA TGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTTAATAAGAGAACTCAAGACTTCTGGGAAGTTCAATTAGGAA TACCACATCCTGCAGGGTTAAAAAAGAAAAAATCAGTAACAGTGCTGGATGTGGGTGATGCATATTTTTC AGTTCCCTTAGATAAGGAGTTCAGGAAGTATACTGCATTTACCATACCTAGTATAAACAATGAGACACCA GGGATTAGATATCAGTACAATGTGCTTCCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAAAGTAGCA TGACAAAAATCTTAGAGCCTTTTAGAAAACAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGATTT GTATGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAATAAAAATAGAAGAACTAAGACAACATCTGTTG AAGTGGGGACTTACCACACCAGACAAAAAACATCAGAAGGAACCTCCATTCCTTTGGAT >gi gb AY HIV-1 clone P3.BCM.RT from USA reverse transcriptase (pol) gene, par CCCATAAGTCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAAT GGCCACTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGAAAAGGAAGGAAAAAT TTCAAAGATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAAACAGTACTAGA TGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTTAATAAGAGAACTCAAGACTTCTGGGAAGTTCAATTAGGAA TACCACATCCTGCAGGGTTAAAAAAGAAAAAATCAGTAACAGTGCTGGATGTGGGTGATGCATATTTTTC AGTTCCCTTAGATAAAGAGTTCAGGAAGTATACTGCATTTACCATACCTAGTATAAACAATGAGACACCA GGGATTAGATATCAATACAATGTGCTTCCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAAAGTAGCA TGACAAAAATCTTAGAGCCTTTTAGAAAACAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGATCT GTATGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAATAAAAATAGAGGAACTAAGACAACATCTGTTG AAGTGGGGATTTATCACACCAGACGAAAAACACCAGAAGGAACCTCCATTCCGTTGGAT

109 準備したファイルでは配列の名前を短くしてあります V で始まる名前 victim = Maria から分離された HIV の RT P で始まる名前 patient=robert の患者から分離された HIV の RT LA で始まる名前 Lafeyette で生活する AIDS 患者から分離された HIV の RT RT = Reverse Transcriptase 逆転写酵素

110 ダウンロードしたファイルを Mafft でアラインして Clustal 形式のアラインメントを作成する

111 Mafft を起動する 1 左下スタートをクリック

112

113 2. 検索ウィンドウに mafft と入力上部に mafft のインストール場所が表示されるこの mafft のアイコンをクリック

114 1. このウィンドウに mafft と入力 2. 表示された mafft をクリック

115 3. mafft の入力画面がたちあがる

116 Input file? (fasta ここに入力ファイルを記入 ( 次のようにする )

117 4. 入力ファイルを指定するために multi-fasta format のファイルが置かれた Directory を表示する ( ここからは Windows OS 上での処理 ) 左下のスタートをクリックし出て来たパネル左上のドキュメントを選択

118 ドキュメントを選択ファイルがドキュメントフォルダにある場合

119 5. ドキュメント directory が表示される Directory から mafft のウィンドウにファイルをドラッグするとファイル名が入力されるファイル名が入力されたら enter キーをおす

120 Fasta format の入力ファイルのアイコンを mafft の入力画面にドラッグする

121 6. Output すなわちアラインメントを出力するファイル名を聞かれる入力ファイル名を参考に Z ドライブ上のファイル ( 新規でも既存の者でも良い ) を指定し Enter キーをおす出力オプションを聞いてくるので 2 を指定する Clustal 形式 /Fasta 形式 Sorted Order/Input Order 説明はアラインメントを見ながら

1. 入力ファイルが Z: ファイル名の形で記入されるエンターキーをおす 3. 6 つのアウトプット形式が出力される 2. Output file?

122 1. 入力ファイルが Z: ファイル名の形で記入されるエンターキーをおす 3. 6 つのアウトプット形式が出力される 2. Output とアラインメントの出力ファイルを聞いてくるので Z: ファイル名としてドキュメントフォルダのファイル名を持つファイルに保存するようにしてエンターキーをおす

123 6 つ出力形式 1 Clustal format/ Sorted 2 Clustal format / Input order 3 Fasta format / Sorted 4 Fasta format / Input Order 5 Phylip format / Sorted 6 Phylip format / Input Order Clustal と Fasta は説明済み Phylip は系統解析の際に説明

124 Sorted と Input Order 入力ファイル fasta format > 配列 1 atgccttgcccaccgctg > 配列 2 atgggttgggcacccctg > 配列 3 atgcgttggccaccgctg > 配列 4 atgccctggcccccgctc Sorted Input Order 配列 1 配列 4 配列 2 配列 3 ATGCCTTGCC ATGCCCTGGC ATGGGTTGG ATGCGTTGGCA Guide-tree は次のようになっているとする配列 1 配列 2 配列 3 配列 4 ATGCCTTGCC ATGGGTTGG ATGCGTTGGCA ATGCCCTGGC 配列 1 配列 4 配列 2 配列 3

125 7. アラインメントのオプションを聞いてくる 1 の auto オプションを指定して enter auto オプション小規模データ丁寧に大規模データそれなりにアライン

126 アラインメントのオプションを聞いてくる ( 正確さ優先か速度優先か ) 1 の auto オプションを指定して enter auto オプション小規模データ丁寧に大規模データそれなりにアライン

127 t7 8. 指定したファイルやオプションをコマンドライン形式で確認してくる問題なければ Y を入力して enter

128 ( 前ページのウィンドウを拡大 )

129 9. ウィンドウ中に出力が表示 (END) が表示された時点で出力ファイルに書き込まれている

130 ( 前ページのウィンドウを拡大 )

131 点数 (4) (3) (2) (1) 達成目標 (3) に加え配列の取得アラインメント系統樹の構築までの一連の処理をこれまでマナ b だツールやサイトを使って実行できる (2) に加え MEGA を操作して近隣結合法で系統樹を作成できる (1) に加え系統樹の作成方法の中の距離行列法特に近隣結合法について説明できるまた相違度ではなく進化距離を推定する必要性について説明できる系統樹に関する用語を説明できる ( 種系統樹と遺伝子系統樹, 根葉節枝, 有根系統樹無根系統樹,)

バイオインフォマティクス第五回

バイオインフォマティクス第五回 IT BIO バイオインフォマティクス第 5 回藤博幸本日の講義 (1) 前回の近隣結合法による系統樹構築の補足 (1-1) モデル選択モデルとは? (1-2) ブートストラップ法 (1-3) Newick 形式 (2) 最尤法による系統樹構築外群導入による根の同定本日の講義 (1) 前回の近隣結合法による系統樹構築の補足 (1-1) モデル選択モデルとは? (1-2) ブートストラップ法