1. MEGA 5 をインストールする 1.1 ダウンロード手順 MEGA のホームページ ( から MEGA 5 software をコンピュータにインストールする 2. 塩基配列を決定する 2.1 Alignment E

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1 MEGA 5 を用いた塩基配列解析法および分子系統樹作成法 Ver.1 Update: ウイルス 疫学研究領域井関博 < 内容 > 1. MEGA 5 をインストールする 1.1 ダウンロード手順 2. 塩基配列を決定する 2.1 Alignment Explorer の起動 2.2 シークエンスデータの入力 テキストファイルから読み込む場合 波形データから読み込む場合 2.3 Forward 配列と Reverse 配列のアライメントと Consensus 配列の作成 3. 分子系統樹を作成する

2 1. MEGA 5 をインストールする 1.1 ダウンロード手順 MEGA のホームページ ( から MEGA 5 software をコンピュータにインストールする 2. 塩基配列を決定する 2.1 Alignment Explorer の起動 1 MEGA 5 のアイコンをダブルクリック 2 Align タブから Edit/Build Alignment を選択する ( 図 1) 図 1 メインウィンドウのタブ上で左クリックすると選択項目が出る 3 M5: Alignment Editor のウィンドウが開くので Create a new alignment を選 択して OK をクリック ( 図 2) 図 2 以前に作業途中で保存したファイルから始めるときには Open a saved alignment session を選択する

3 4 Data type for alignment のウィンドウが開き Are you building a DNA or Protein sequence alignment? と聞いてくるので DNA を選択する 5 M5: Alignment Explorer の作業ウィンドウが開く ( 図 3) 図 3 これ以降の塩基配列の修正作業は Alignment Explorer 上で行う 2.2 シークエンスデータの入力 テキストファイルから読み込む場合 <Forward PCR primer を用いてシークエンスした配列を入力する> 1 M5: Alignment Explorer の Edit タブから Insert Sequence From File を選択する 2 解析するシークエンスファイル ( テキストファイル ) を選択する * 自分でテキストファイルを作成する場合は FASTA 形式にする ( 図 4) 図 4 > の後に配列の名前を入れ 改行して塩基配列を ペーストする

4 3 M5: Alignment Explorer にシークエンスデータが入力される ( 図 5) 図 5 配列が青く反転している場合は いずれかの塩基の上で左クリック すれば解除される 4 波形データを見ながら配列を編集する ( 波形データから読み込む場合 を参照 ) <Reverse PCR primer を用いてシークエンスした配列を入力する> 1 M5: Alignment Explorer の Edit タブから Insert Sequence From File を選択し Reverse PCR primer を用いてシークエンスした配列の入力されたファイルを選択する 2 Forward PCR primer を用いてシークエンスした配列と同様に 波形データを見ながら配列を編集する 3 配列名の部分をクリックして配列情報が青く反転した状態で Data タブから Reverse Complement を選択する ( 図 6) これにより Forward PCR primer を用いてシークエンスした配列と同じ向きになる (5 3 ) 図 6 配列が青く反転している状態でないと Reverse Complement できないので注意

5 2.2.2 波形データから読み込む場合 <Forward PCR primer を用いてシークエンスした配列を入力する> 1 Sequencer タブから Edit Sequencer File を選択する ( あるいは波形のアイコンをクリックする )( 図 7) 図 7 緑の枠で囲ったアイコンを左クリックする 2 Forward PCR primer を用いてシークエンスした配列の波形データファイルを選択する 3 Trace Editor のウィンドウが開き 波形データが見られるようになる 4 波形を見ながら配列を修正する 開始部と末端部付近は波形が乱れて正確に配列が認識されないため Edit タブから Mask Upstream あるいは Mask Down Stream を選択することで カーソルの位置より前あるいは後ろの配列を認識させなくすることができる ( 図 8) 図 8 ここでは C を左クリックで青く反転させた後 緑の枠で囲った左側の アイコン (Mask Upstream) を選択した

6 5 修正が終わったら Data タブから Add to Alignment Explorer を選択する すると 修正を行った配列のうちでマスクをしなかった部分のみが Alignment Explorer のウィンドウに読み込まれる 6 Reverse 配列も同様に修正し Reverse Complement を行ってから Alignment Explorer のウィンドウに読み込ませる 2.3 Forward 配列と Reverse 配列のアライメントをとる 2.2 で Alignment Explorer に読み込ませた Forward 配列と Reverse 配列を比較 修正し 1 本の Consensus 配列を作る 1 Alingment タブから Align By ClustalW を選択する または W のタブをクリックして Align DNA を選択する ( 図 9) ダイアログボックスの数値は変えずに OK を選択する 図 9 緑の枠で囲った W のアイコンをクリックする 2 Forward 配列と Reverse 配列の相同部分が重なるので 不一致な部分を確認する 3 Edit タブから Insert Blank Sequence を選択する 4 新しく挿入された配列の名前部分をダブルクリックし 名前を変更する ( 検体名など ) 5 Forward と Reverse の配列で一致した部分をコピーし 新しく挿入された配列にペーストする 6 この検体の Consensus 配列が完成 2.4 Consensus 配列から PRRS ウイルスの ORF5 を切り出す 1 動衛研 HP から 日本の PRRSV ファイルを自分のコンピュータにダウンロードする 2 Alignment Explorer から Consensus 配列以外の配列を削除する ( 配列の上で右クリックして Delete を選択 )

7 3 Edit から Insert Sequence From File を選択し 日本の PRRSV ファイルを選択する 4 W のタブをクリックして Align DNA を選択する ダイアログボックスの数値は変えずに OK を選択する 5 PRRS ウイルスの ORF5 は 600 塩基あるいは 603 塩基であるため Consensus 配列を他の配列と比較し 配列の後ろ側は TAG 配列の前側は ATG となるように不要な配列を削除する ( 他の株の ORF5 と全然配列が一致しない場合は マニュアル最後の< 得られた塩基配列の核酸相同性解析 >を試してみましょう ) あるいは 603 塩基となったことを確認して 配列をコピーする 7 日本の PRRSV ファイルを開き 最後尾にペーストする 前の配列に倣って 検体名を入力する ( 図 10) 図 10 ここではサンプルの名前を Sample A とした 8 日本の PRRSV ファイルを別名で保存してから閉じる 9 Alignment Explorer 上で 再度 W のタブをクリックして Align DNA を選択する ダイアログボックスの数値は変えずに OK を選択する 10 Data タブから Save Session を選択し 任意の場所に保存する 3. 分子系統樹を作成する 1 MEGA のメインウィンドウの Phylogeny タブから Construct/Test Neighbor Joining Tree を選択する 2 Choose a Data File to Analyze のウィンドウが開くので ファイルの種類を All files にする で保存したファイルを選択する

8 4 M5: Analysis Preferences のウィンドウが開くので Test of Phylogeny の項目を左クリックして Bootstrap method を選択する 5 Compute をクリックすると計算が開始する 6 作成された系統樹は見やすいようにカスタマイズする ( 下記 < 主なアイコンの機能 >を参照 ) 7 Image タブから Copy to Clipboard を選択し パワーポイントに貼りつける 8 パワーポイントスライドの系統樹の上で右クリックし グループの解除をすれば フォントが変更できるようになる < 主なアイコンの機能 > 枝の指定 枝の上下入れ替え 選択した分枝を中心に系統樹を作成 枝の反転 選択した枝をまとめて表示または非表示 系統樹の形を選択 < 得られた塩基配列の核酸相同性解析 > 1 Alignment Explorer 上の調べたい配列の名前の上で右クリックし BLAST sequence を選択 2 選択した配列が入力された BLAST の新しいウィンドウが開くので 下記の項目を修正する ( 図 11) Choose Search Set Database: Others (nr etc), Nucleotide collection (nr/nt) Program Selection Optimize for: Somewhat similar sequences (blastn) General Parameters Max target sequence: 探し出す候補の数を入力 3 BLAST のアイコンをクリックする 4 相同性の高いものから順番に候補が表示される 図 11