上原記念生命科学財団研究報告集, 28 (2014)

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みちしげてらわ
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上原記念生命科学財団研究報告集, 28 (2014) 185. 半月板自己修復の可能性と新規治療法の確立大槻周平 Key words: 半月板, 再生,scaffold 大阪医科大学生体管理再建医学講座整形外科学教室緒言半月板損傷は日常診療でよく遭遇する疾患であり, 高頻度に変形性膝関節症を引き起こすことからも治療が不可欠な疾患である.

1 上原記念生命科学財団研究報告集, 28 (2014) 185. 半月板自己修復の可能性と新規治療法の確立大槻周平 Key words: 半月板, 再生,scaffold 大阪医科大学生体管理再建医学講座整形外科学教室緒言半月板損傷は日常診療でよく遭遇する疾患であり, 高頻度に変形性膝関節症を引き起こすことからも治療が不可欠な疾患である. 半月板は周囲 1/3 の血行豊富領域と中 2/3 の無血行領域からなるが, 無血行領域は自己修復能が低いため, その治療は損傷半月板の部分切除術がおもに行われている. しかしながら, 半月板切除は変形性膝関節症リスクを増大することが報告されており, 機能温存をはかるための修復術が推奨されている. 無血行領域の半月板損傷を修復する方法は, さまざまな研究が行われているが, なかでも間葉系幹細胞 (MSC) を用いた方法は良好な成績が報告されている 1-4). 我々は, 膝関節内にある膝蓋下脂肪体 (IPFP) に多くの MSC が含まれていることに着目し, その IPFP と半月板の主な成分である I 型コラーゲンを半月板欠損部に併用移植する新規治療法について検討した. 方法および結果 1. ウサギを用いた研究日本白色ウサギ 20 羽を用いて,2 mm 大の欠損を内側半月板に作製し ( 図 1), その欠損部位に IPFP, ペルナックを移植した. 図 1. 半月板損傷モデル. 日本白ウサギの右膝内側半月板前節に 2 mm の欠損を作製. グループは, I) 欠損群, II)IPFP 移植群, III) ペルナック移植群, IV)IPFP とペルナック併用移植群の 4 群とした. それぞれ 8 週間後に屠殺し観察した. 移植後の半月板修復を検討するため, 半月板のマクロフォトを用いて炎症の有無, 表面積の変化を観察した. 表面積は Image J soft ware を用いてコンピュータ上で計測した ( 図 2a). 1

2 図 2a. 肉眼所見と表面積. 半月板表面積を Image J を用いて測定した. また, 組織評価は Ishida スコアを参考に, 再生組織の結合,Safranin-O 染色, 線維軟骨細胞の存在を観察した. さらにその再生組織の変化を詳細に観察するため, I 型及び II 型コラーゲン抗体で免疫染色を追加した. 統計学的解析には Wilcoxon 検定を用い,p < 0.05 を有意差ありとした. 結果, ペルナック単独移植群では,IPFP 単独移植群に比べ炎症所見を強く認めたが, 併用群では炎症所見は減少した ( 図 2b). 2

3 図 2b 肉眼所見と表面積 IPFP (II) ペルナック単独移植 (III) 群ではそれぞれ炎症所見を認めるが併用群 (IV) では炎症所見はみられなかった欠損群では半月板前節が前後方向に萎縮しており半月板は正常に比べ有意に縮小していた p < 0.05 IPFP ペルナック併用移植群では, 欠損部は修復され正常半月板と同等の大きさであった図 2c 3

4 図 2c 肉眼所見と表面積欠損群 (I) の表面積は IPFP 移植 (II) IPFP とペルナック併用群 (IV) 正常と比べ有意に小さかった *p < 0.05 組織学的評価においても IPFP とペルナック併用移植群は欠損群と比べ有意に欠損部が修復されていた p < 0.05 IPFP もしくはペルナック単独移植群で面積は正常半月板と有意差はなかったが併用移植群に比べ組織学的には修復が不十分な傾向にあった図 3a, b また免疫染色でも IPFP ペルナック併用群が正常に近い構造となっていた図 3a 図 3a 代表的な組織染色像とその評価 IPFP ペルナック併用群 (IV) では, 正常に近い構造であった IPFP (II) ペルナック単独 (III) 群では再生組織は不十分で線維軟骨細胞は認められなかった 4

5 図 3b. 代表的な組織染色像とその評価. Ishida スコアは, 併用群 (IV) が欠損群 (I) に比べ有意に高いスコアであった.*p < ヒト半月板細胞を用いた研究ペルナックのヒト半月板治療への可能性を検討するため, 変形性膝関節症 5 症例から採取したヒト半月板細胞 (MC),IPFP 細胞 (IPFPC) をペルナックとともに3 週間培養を行った. それらを,MC,MC+IPFPC, MC+ ペルナック, MC+IPFPC+ ペルナックの4グループに分けて,Real time PCR により同化異化に関連した遺伝子発現の変化を検討した. 検討項目は, 細胞外基質を形成する I 型,II 型,III 型,X 型コラーゲンとアグリカンおよび軟骨分化因子である Sox9, アグリカン分解酵素である ADAMTS-5, 炎症性サイトカインである IL1-β, タンパク質分解酵素である MMP-13 をそれぞれ発現量の変化とした. 結果, アグリカンは, MC+IPFPC と MC+IPFPC+ ペルナック共培養で発現が有意に低下していた. また,MMP-13 は MC+IPFPC+ ペルナック共培養では発現が有意に低下していた ( 図 4). その他遺伝子発現については4 群間で有意差は見られなかった. これらのことから,MC+IPFPC+ ペルナック共培養では, 細胞外基質の発現は低いものの, 分解酵素である MMP-13 の発現が有意に抑えられていた事から異化作用の抑制が期待できると考えられた. 5

6 図 4 半月板再生に関連した遺伝子発現の変化アグリカンの発現は MC のみと比較し MC+IPFPC MC+IPFPC+ペルナック群で有意に低下した MMP-13 の発現は MC+IPFPC+ペルナック群では有意に抑制されていた *p < 0.05, **p < 0.01 考察今回の動物を用いた in vivo とヒト半月板細胞を用いた in vitro の研究から半月板損傷に対して IPFP とペルナックを併用することで半月板の大きさのみならず組織学的にも修復が期待され遺伝子発現変化からもペルナックは IPFP と併用することによりヒト半月板への臨床応用が可能と考えられた今回の研究結果は半月板損傷に対する IPFP とペルナック併用移植は新たな治療法となりうると考えられる共同研究者本研究の共同研究者は, 同教室の小田周平である本稿を終えるにあたり, 本研究のご支援をいただきました上原記念生命科学財団に深く感謝申しあげます文献 1 Yamasaki, T., Deie, M., Shinomiya, R., Izuta, Y., Yasunaga, Y., Yanada, S., Sharman, P. & Ochi, M. : Meniscal regeneration using tissue engineering with a scaffold derived from a rat meniscus and mesenchymal stromal cells derived from rat bone marrow. J. Biomed. Mater. Res. A., 75 : 23-30,

7 2) Mochizuki, T., Muneta, T., Sakaguchi, Y., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H. & Sekiya, I. : Higher chondrogenic potential of fibrous synovium- and adipose synovium-derived cells compared with subcutaneous fat-derived cells: distinguishing properties of mesenchymal stem cells in humans. Arthritis Rheum., 54 : , ) Kanda, N., Morimoto, N., Takemoto, S., Ayvazyan, A. A., Kawai, K., Sakamoto, Y., Taira, T. & Suzuki, S. : Efficacy of novel collagen/gelatin scaffold with sustained release of basic fibroblast growth factor for dermis-like tissue regeneration. Ann. Plast. Surg., 69 : , ) Horie, M., Driscoll, M. D., Sampson, H. W., Sekiya, I., Caroom, C. T., Prockop, D. J. & Thomas, D. B. Implantation of allogenic synovial stem cells promotes meniscal regeneration in a rabbit meniscal defect model. J. Bone Joint Surg. Am., 94 : ,

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<4D F736F F D20819C817990AC89CA95F18D908F91817A A196D890BD F8A A2E B CA48BA6816A> 様式 C-19 科学研究費助成事業 ( 科学研究費補助金 ) 研究成果報告書平成 24 年 5 月 31 日現在機関番号 :17701 研究種目 : 挑戦的萌芽研究研究期間 :2010 ~ 2011 課題番号 :22658100 研究課題名 ( 和文 ): 半月板損傷モデルの作成と BRP システムによる半月板の再生に関する研究研究課題名 ( 英文 ):Cruciate injury model