上原記念生命科学財団研究報告集, 28 (2014)

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あゆみわしあし
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1 上原記念生命科学財団研究報告集, 28 (2014) 142. 脳型トランスフェリンの構造機能解析長江雅倫 Key words: 髄液, トランスフェリン, 糖鎖構造, 特発性正常圧水頭症理化学研究所基幹研究所ケミカルバイオロジー領域糖鎖構造生物学研究チーム緒言現在国内には 230 万人にも及ぶ認知症患者がおり, 高齢化社会の急速な進展に伴って今後も増加が見込まれている. 特発性正常圧水頭症 (inph) は治療により症状の改善が可能な治る認知症として知られ, 推定では日本全国に 30 万人の患者が存在すると見積もられている. 最近, 福島県立医科大学の橋本康弘教授らのグループによって, 髄液中の糖蛋白質であるトランスフェリンの糖鎖構造の変化が,iNPH の診断マーカーとして利用できることが示された. しかし糖鎖構造の変化がトランスフェリンの性状にどのような影響を及ぼすかについては明らかでない. そこで本研究では髄液から調製した糖鎖構造の異なる二種類のトランスフェリンのアイソフォーム (Tf-1 および Tf-2) について, それぞれ網羅的な糖鎖構造解析および生化学的解析を試みた. その結果,Tf-1 で N-GlcNAc 構造という新奇な糖鎖構造を持つことが明らかになった. さらに生化学的解析の結果,Tf-1 と Tf-2 では糖鎖構造に由来した性状の違いがあることがわかった. 本稿ではその詳細を報告する. 方法および結果本研究で使用したヒト髄液は福島県立医科大学より提供を受け, その中に含まれている糖蛋白質を研究試料として扱った. 我々は研究を開始するにあたり理化学研究所研究倫理第三委員会に研究計画を申請し承認を得た. 髄液からのトランスフェリンの精製は, 多段階のカラムクロマトグラフィーによって行った. 具体的には限外濾過濃縮,Blue Sepharose カラム, 陰イオン交換カラム (SuperQ-650M),Protein G カラム, ゲル濾過カラムを経て, 最終的な陰イオン交換カラム (MonoQ) によって, トランスフェリンの二つのアイソフォーム (Tf-1 および Tf-2) を分離した. 最終精製標品を SDS 電気泳動したところ,Tf-1,Tf-2 ともに高純度の精製に成功した ( 図 1). 1

図 1. 血清トランスフェリンおよび髄液トランスフェリン (Tf-1, Tf-2) の SDS 電気泳動. 三種類のトランスフェリンに対して Peptide: N-glycosidase F (PNGaseF) を添加の有無を検討した. また PNGaseF 添加の際にトランスフェリンの変性の有無も併せて検討した.

2 図 1. 血清トランスフェリンおよび髄液トランスフェリン (Tf-1, Tf-2) の SDS 電気泳動. 三種類のトランスフェリンに対して Peptide: N-glycosidase F (PNGaseF) を添加の有無を検討した. また PNGaseF 添加の際にトランスフェリンの変性の有無も併せて検討した. その結果,Tf-1 が Tf-2 よりやや移動度が低いこと, いずれのトランスフェリンも未変性状態では PNGaseF に対して抵抗性を示す糖鎖があることが明らかになった. 三種類のトランスフェリンに対してエンドグリコシダーゼである Peptide: N-glycosidase F (PNGaseF) を添加して糖鎖切断の有無を検討した. また併せて,PNGaseF 添加の前段階にトランスフェリンの変性の有無も検討した. その結果,Tf-1 が Tf-2 よりやや移動度が大きいこと, またいずれのトランスフェリンも未変性状態では PNGaseF に対して抵抗性を示す糖鎖があることが明らかになった. 続いて質量分析を用いてトランスフェリンの詳細な糖鎖構造解析を行った. 精製トランスフェリンを還元アルキル化後にトリプシン消化し, 断片の MS/MS 解析を行い, 部位特異的な糖鎖構造を解析した. トランスフェリンには N432 と N630 の二か所の N 結合型糖鎖修飾部位がある. 我々は Tf-1 の N432 に N-acetylglucosamine (GlcNAc) が一残基のみ結合した N-GlcNAc 糖鎖の検出に成功した ( 図 2). 2

3 図 2. MS/MS 解析による糖鎖構造解析. N432 を含む糖ペプチドの解析例を示す.N-acetylhexosamine (HexNAc), この場合はおそらく N- acetylglucosamine (GlcNAc) が一残基結合した質量に相当するピークが検出されたこうした網羅的な糖鎖構造解析の結果, 二か所の糖鎖修飾部位には図 3 のような糖鎖を持つことが明らかになった. 3

4 図 3. 髄液トランスフェリンの糖鎖構造解析. MS/MS 解析を網羅的に行うことによって, 上記のような複数の糖鎖構造が存在することが明らかになった. 図 1 で PNGaseF 処理に対して抵抗性を示す糖鎖が示唆されたが, 質量分析によって N432 であることが判明した. ごく最近になり米国のグループから髄液中のトランスフェリンの糖鎖構造解析が報告され, 我々のデータと一致していた 1). ただし彼らは Tf-1 と Tf-2 の区別をすることなく取り扱っていたためアイソフォームに依存した解析は, 我々独自のものであった. では, こうした糖鎖構造の違いがどのように蛋白質の物性に影響を与えるのであろうか? 我々はこの疑問に応えるべく様々な生化学的解析を試みた. 特に顕著な差が表れたのは疎水性色素である 8-Anilinonaphthalene-1-sulfonic acid (ANS) の結合活性であった.ANS は蛋白質表面の疎水性残基に結合して蛍光を発する. 実験の結果,Tf-1 で顕著に蛍光が増加することがわかった ( 図 4). 4

5 図 4. Tf-1 に対する疎水性色素 ANS の反応性. 疎水性色素である ANS は蛋白質表面の疎水性残基に結合して蛍光を発する. 血清型トランスフェリン (stf) と比較して,Tf-1 が顕著に蛍光を発していることがわかった. 考察共同研究先である福島県立医科大学医学研究科の橋本康弘教授らのこれまでの研究によって,Tf-1 と Tf-2 の比が inph の診断マーカーとなりうることを示した 2). 我々はさらなる糖鎖構造解析と生化学的解析を重ねることで糖鎖構造に依存した性状の変化を明らかにした 3). 糖鎖構造は多岐にわたり,N 結合型糖鎖だけでも高マンノース型, ハイブリット型, 複合型糖鎖の少なくとも三種類に大別される. 本研究で明らかにした N-GlcNAc 型糖鎖は, どのどれにも分類されない新奇なものである. こうした多種類の糖鎖が, 糖蛋白質にどのような影響を与えるかについては十分に明らかになっていない. 本研究結果は, 糖蛋白質上の糖鎖が蛋白質に与える影響を示す一例となった.Tf-1 の糖鎖構造が inph とどのように関わっているかは未だ明らかとなっておらず, 今後の更なる研究が必要である. 共同研究者本研究の共同研究者は福島県立医科大学医学部医学科の橋本康弘教授である. 本稿を終えるにあたり, 本研究をご支援いただいた上原記念生命科学財団に深く感謝申し上げます. 文献 1) Brown, K. J., Vanderver, A., Hoffman, E. P., Schiffmann, R. & Hathout, Y. : Characterization of trasferrin glycopeptide structures in human cerebrospinal fluid. Int. J. Mass Spectrum, 312 : , ) Futakawa, S., Nara, K., Miyajima, M., Kuno, A., Ito, H., Kaji, H., Shirotani, K., Honda, T., Tohyama, Y., Hoshi, K., Hanzawa, Y., Kitazume, S., Imamaki, R., Furukawa, K., Tasaki, K., Arai, H., Yuasa, T., Abe, M., Arai, H., Narimatsu, H. & Hashimoto, H. : A unique N-glycan on human transferrin in CSF: a possible biomarker for inph. Neurobiol. Aging, 33 : ,

6 6 3) Nagae, M., Morita-Matsumoto, K., Arai, S., Wada, I., Matsumoto, Y., Saito, K., Hashimoto, Y. & Yamaguchi, Y. : Structural change of N-glycan exposes hydrophobic surface of human transferrin. Glycobiology, 24 : , 2014.

1. 背景血小板上の受容体 CLEC-2 とある種のがん細胞の表面に発現するタンパク質ポドプラニンやマムシ毒ロドサイチンが結合すると血小板が活性化され血液が凝固します ( 図 1) ポドプラニンは O- 結合型糖鎖が結合した糖タンパク質であり CLEC-2 受容体との結合にはその糖鎖が

1. 背景血小板上の受容体 CLEC-2 とある種のがん細胞の表面に発現するタンパク質ポドプラニンやマムシ毒ロドサイチンが結合すると血小板が活性化され血液が凝固します ( 図 1) ポドプラニンは O- 結合型糖鎖が結合した糖タンパク質であり CLEC-2 受容体との結合にはその糖鎖が参考資料配布 2014 年 11 月 10 日独立行政法人理化学研究所国立大学法人東北大学血小板上の受容体 CLEC-2 は糖鎖とペプチド鎖の両方を認識 - マムシ毒は糖鎖に依存せず受容体と結合 - 本研究成果のポイントレクチンは糖鎖とのみ結合するというこれまでの考え方を覆す CLEC-2 受容体は同じ領域でマムシ毒とがんに関わる糖タンパク質に結合糖鎖を模倣したペプチド性薬剤の設計への応用に期待