Key words : arbitrarily primed PCR, Salmonella enterica serovar Enteritidis, plasmid DNA profile, antimicrobial susceptibility, phage type
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- よりお うみのなか
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1 Key words : arbitrarily primed PCR, Salmonella enterica serovar Enteritidis, plasmid profile, antimicrobial susceptibility, phage type
2 Table 1 Strains of S. Enteritidis Table 2 Primers used in the AP-PCR profile of S. Enteritidis HP : Feces of healthy person FP : Feces of food poisoning patient SC : Feces of sporadic case patient
3 AP-PCR法 ase濃 度 の 最 適 な も の を 選 ん だ.AP-PCR反 は10 reaction buffer(gene taq 応 液 (16.5μg/ml)を (Genetaq,Wako)0.4μl,テ 水 を 加 system USA)を 用 い,は 94 5min,elongation し,そ 72 の 後denaturation plasmid 3. M : plasmid size marker で10min 94 denatura36 イ ク ル 増 幅 1min,annealing 1minで30サ elongationさ イ ク ル せ た.PCR産 リ ア ク リル ア ミ ドゲ ル で 定 電 流 30mA,120min電 気 泳 動 後,エ ド で 染 色 し,254nmの チ ジ ウム ブ ロ マ イ トラ ン ス イ ル ミネー タ ー上 で 写 真 撮 影 後 観 察 し た. 成 供 試 し た 菌 株 は,す Table 3 obtained RDNC: Phage from Reaction SM : Streptomycin, 平成9年8月20日 績 べ て60kbpの type, Plasmid 21 cases dose TC: not プ ラ ス ミ ド保 profile in Wakayama type, Drug resistance City, conform Tetracycline, -: (S. Enteritidis ) Elmer, 5min,annealing 72 10min 物10μ1を15%ポ gel electrophoretic し た.PCRは, 5minで4サ 1min,elongation 増 幅 後,72 polymerase 9600(Perkin じ め に94 tionし,denaturation 36 Agarose ン プ レ ー ト20 え て 全 量 を50μ1に GeneAmp(R)PCR profile types of Salmonella Enteritidis. FL 1, 2 and 3 : plasmid profile type 1, 2 and プ ライ マ ー 各5μlとTaq 疫学 的 検 討 Fig. buffer,wako), 15mMMgCl2,dNTPmix(各lmM)と μlに に よ るS.Enteritidisの Susceptible and AP-PCR type of S. Enteritidis strains
4 吐崎 748 有 株 でPL1,PL2,PL3の3種 1).薬 に 分 類 で き た(Fig. 剤 感 受 性 は,3種 事 例1がSM耐 が12),反 応 液 や 温 度 条 件 を 最 適 な も の に 定 め,分 類 用 の 対 照 に コ ン トロ ー ル 株 を 置 い てAP-PCRを 例3以 あ っ た.フ ァ ー ジ 型 は34型,1型 あ っ た.1996年 で,そ な ど影 響 を 受 け る 要 因 が 多 い 例2がTC SM耐 あ っ た.事 降 は す べ て9薬 剤 に感 受性 で フ ァ ー ジ1型 ら従 来 か ら 使 用 さ れ て き た3種 実 施 す れ ば,安 る.ま で れ で は,A- プ ラ イ マ ー に よ りb1,b2の2種 類 に,B-32 類 に,C-42プ 類 に,C-45プ 年 の 事 例1以 示 し て い る6).1992年 例 中17事 あ っ た.タ イ プCはAP-PCR法 プIII,IV,Vの3種 らVIに 分 類 で き り主 流 で 考 Fig. 2 A-11 性,60kbpの め,フ ら80%を 占 め て い た フ ァ ー ジ4 プ ラ ス ミ ド を 持 つ 株(和 歌 ァ ー ジ4型,薬 ミ ド を 持 つ 株(タ polymerase濃 AP-PCR primers で 全 体 の70か 山 市 で は 分 離 さ れ て い な い)が 察 ロ フ ァ イ ル はMg2+濃 ニ ー リ ン グ 温 度,Taq と4型 型,SM耐 に よ り更 に タ イ 主 流 で27,7%を 剤 感 受 性,60kbpの イ プC)は8.1%で さ れ て い る6).和 歌 山 市 のS.Enteritidisは 度,テ C株 profile が81%を of Salmonella 占 め,15事 Enteritidis 例(71%)が タイプ タ イ プC IV using A-11, B-32, C-42 and C-45. B-32 C-42 C-45 感 染症 学 雑誌 占 プラス あ っ た と報 告 度,ア fingerprinting か ら 以 降 の 日本 の 主 流 フ ァー ジ る1)13)14).山梨 県 で も 同 様 で あ り,ま 類 に 細 分 す る こ とが で き た. AP-PCRプ れ は 日本 の フ ァー ジ の 動 向 の 山 梨 県 の金 子 らの 報 告 と一 致 した 動 向 を は1型 類 のマー カーの分類 で 例(81%)あ へ と 降 分 離 さ れ て お ら ず,1985年 の4本 タ イ プCは21事 と1型 と ほ ぼ 一 致 し て い る1)13)14).タ イ プA Iは,1991 る こ と が で き た(Fig.2).こ 来 の3種 フ ァ ー ジ 型 は1991 以 降4型 変 化 し て き て い る.こ 1995年 の 分 類 の 組 み 合 わ せ で タ イ プ1か 板 上 の コロ 一 の ロ ッ トの 酵 に安 定 した プ ロ フ ァイ ル 和 歌 山 市 のS.Enteritidisの 類 にそれぞれ分類す た(Table3).従 の 影 響 も,平 定 め,同 年34型,1992年1型,1994年 に よ りc4,c5,c6,c7の4種 のプライマ ー を 得 る こ と が で き た. ライ ライマー とTaq 力 価 の 違 い に よ りプ ロ フ ァイ ル に 素 を 使 う こ と に よ り,更 ら タ イ プEの5 11プ ラ イ マ ー に よ りa1,a2,a3の3種 ン プ レ ー ト量 ニ ー の 直 径 を1.5mmに で あ っ た.こ 種 に 分 類 で き た(Table3).AP-PCR法 定 した 分 類 結 果 を得 る こ とが で き 濃 淡 の 差 が 生 じ た が,こ 類 の疫学 マーカー の 組 み 合 わ せ に よ り,タ イ プAか た,テ polymeraseの フ ァ ー ジ 型 はRDNC の 他 の 事 例 は フ ァ ー ジ4型 マ ー に よ りc1,c2,c3の3種 の3種 フ ァ ー ジ34型,1992 の 事 例11は の 事 例19の 性 で 及 び4型 の 事 例1が 年 の 事 例2と1995年 ン プ レ ー ト量 類 の タ イ プ に 分 類 で き, 性 で,事 類 で あ っ た.1991年 修 他 第71巻 第8号
5 7) Suzuki Y,. Ishihara M, Matsumoto M et al. : Molecular epidemiology of Salmonella Eanteritidis. An outbreak and sporadic cases studied by means of pulsed-field gel electrophoresis. J Infect 1995 ; 31 : ) Lin AW, Usera MA,Barret TJ, Goldsby RA : Application of random amplified polymorphic analysis to differentiate strains of Sal - monella Enteritidis. J Clin Microbiol 1996 ; 34 : ) Kado C, Liu ST : Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J Bacreriol 1981 ; 145 : ) Jutras EM, Miller RM, Pepper IL: Optimization of arbitrarily primed PCR for the identification of bacterial isolates. J Microbiol Methods 1995 ; 24 :
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