バイオ構造における SAXS 分析

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1 バイオ構造における SAXS 分析

2 構造生物学における SAXSのメリット SAXS( 小角 X 線散乱 ) は 分子生物学分野の構造研究手法です 他の確立された手法では得られない貴重な情報が得られることから 広く使用されるようになってきています 生体高分子及びその複合体の構造解析を行う際 一般的に使用される手法は 結晶学とNMR( 核磁気共鳴 ) です SAXSでは これらの高分解能のテクニックのいずれを使っても得ることのできない貴重な追加情報を得られます また 結晶学と比較して明確なメリットがあります 結晶学では 生体分子の単結晶が必要になりますが 多くの場合 入手が困難です また フローズン ( 結晶化した ) 状態のサンプルが必要であるということは サンプルに対して 自然環境がどのような影響を与えるか や サンプルは どの動的プロセスに関わっているか などに対する答えが得られないことになります NMRとSAXSでは これらの問いに対する答えが得られます NMRでは 高分解能の構造情報が得られますが その信号は非常に複雑で 他の入力情報がなければ解釈できないことも多くあります SAXSでは 溶液中の生体高分子を生理学的条件下で分析できます 動的なプロセス ( リガンド結合時の構造変化や 環境変化後のタンパク質のフォールディング / アンフォールディングなど ) を調べる際には 非破壊でのサンプル分析が不可欠です SAXS 分析の誕生 豊富な構造情報出力に基づき サンプルの準備が簡単で 試験条件も柔軟に設定できるSAXSは 生物学的研究において重要なテクニックとされています オーストリアのグラーツにおいて オットー クラツキー教授がアントンパール社と共同で最初の商用 SAXS 分析装置を開発 クラツキーコンパクトカメラの開発 アントンパール社が 800 台以上を製造し世界中で販売 SAXS: 基本原理 SAXS 測定では 散乱角の関数として 分子の散乱強度を測定します 通常 分解能は1~200 nmです 別の材料のナノサイズのドメインを含む固体材料または液体材料をX 線が通り抜けるとき X 線はナノ構造によって小角で散乱します これは ナノ構造がX 線の波長と比較して大きいためです 得られた散乱パターンは 粒子のサイズ 形状 内部構造の特性を表します トランスグルタミナーゼの組織

3 散乱 X 線ビーム SAXS の結果を一目で把握 生体高分子のサイズと形状 タンパク質またはタンパク質複合体の 3D エンベロープ 集合度 質量分析 タンパク質フォールディング / アンフォールディング 外部パラメータのばらつきに対するタンパク質の安定性 リガンド結合による構造変化 形状 散乱強度 I(q) 全体フォールディング原子構造 X 線ビームの単色化と 2D 検出を特徴とする SAXSess の発売 様々な X 線源及び検出器を特徴とする SAXSess mc 2 の発売 初の自動調整 SAXS 分析装置である SAXSpace の発売 散乱ベクトル q [nm -1 ] 単色 X 線ビーム 少量のタンパク質サンプル

4 タンパク質の解析 SAXSpace SAXSpace ナノ構造分析システムは タンパク質 タンパク質複合体 DNA その他の生体高分子の研究を目的として設計されました 迅速な測定時間 : 高スループットスクリーニング 少量のサンプルで測定可能 高い強度と使いやすさを備えたコンパクトなデザイン SAXSpace は あらゆる Bio-SAXS アプリケーションに対応します パワフルな SAXSquant ソフトウェアは 測定した散乱データについて 複数の分析オプションを備えています タンパク質のサイズと質量の決定 ギニエプロット解析では 散乱ベクトルが0に向かう限界点によって タンパク質の幾何特性を調査できます 慣性半径 ( 粒子サイズに比例 ) は ギニエプロットの散乱曲線の最初のスロープによって決定されます これに基づいて 粒子の容積 ( 粒子の質量に比例 ) が縦軸切片から得られます In (I(q)) 大 小 q 2 [nm -2 ] I(q)*q 2 アンフォールディングされたタンパク質 フォールディングされたタンパク質 q タンパク質のアンフォールディングの監視大きい散乱角の限界により タンパク質のフォールディング及びアンフォールディングについての情報が得られます クラツキープロットは 小さい粒子の散乱曲線は広角でq-4で減衰しますが ランダムウォークポリマーはq-2でしか減衰しない という事実を用います I(q) q 2 対 qのプロットにおいて アンフォールディングされたタンパク質の信号は平坦化しますが フォールディングされたコンパクトなタンパク質には はっきりとした最大値があります このようにして 時間分解によるSAXS 測定を使用して タンパク質変性プロセスを確認できます

5 あらゆる可能性 パワフルなソフトウェア パワフルな SAXSdrive 及び SAXSquant ソフトウェアパッケージでは あらゆる SAXSpace システムコンポーネントを完全にコントロールでき データの取得 処理 分析を簡単に行えます 高スループットスクリーニングに最適化 完全にカスタマイズ可能なテンプレートを用いたシンプルなデータ処理 あらゆるルーチン評価に対応 アブイニシオモデリングプログラム (ATSAS SasView など ) に簡単にデータを転送 球状タンパク質の 3D エンベロープの作成 SAXS 曲線のフーリエ変換を行うことで 実際の情報が明らかになり 二体間距離分布関数 (PDDF) が利用できるようになります 粒子内の散乱中心 ( 電子 ) 間の距離の分布によって 干渉現象が強まり 実際の散乱パターンが生まれます 二体間距離分布関数だけでも 粒子のサイズや形状 内部構造に関する貴重な情報を抽出できます タンパク質データに特化した高度なab-initio 手法を使用すると 低分解能エンベロープ及びビーズモデルを生成したり タンパク質骨格のフォールディングを示すことができます タンパク質 - タンパク質 / タンパク質 -DNA 複合体の構造モデリング 他のテクニック ( タンパク質結晶学など ) を使用して事前に得られたデータを SAXSデータと合わせることで 複合体内の各ドメインの相対的な向きと配置を特定できます このプロセスは 剛体モデリングとして知られています この手法では 測定データに最も適合する複合体の構造を特定できます 例えば 複合体を構成しているタンパク質の結晶構造を手がかりに タンパク質複合体の構造を知ることができます

6 SAXSpace: メリット 高品質と高効率 SAXSpace は バックグラウンドが極めて低い高輝度単色 X 線ビームを使用しており コントラストが非常に小さいサンプルでも信頼性のあるデータを得ることができます このビーム品質は 散乱を極限まで抑えた先進的なコリメーションシステムによって実現されました このシステムの元となっているのは SAXS の生みの親であるオットー クラツキーとアントンパール社によって 1950 年代に共同開発された クラツキベースのブロックコリメーターです ASX-c オートサンプラー ハイスループット ASX-cオートサンプラーは 最大 192 個のサンプルを自動測定して ハイスループットスクリーニングを実現するとともに 内蔵の冷却オプションによって環境に敏感なタンパク質を保護します 測定待機中のサンプルは 低温で保管されます 極少量での測定 貴重なタンパク質サンプルの分析には マイクロセルが最適です 10 µl 未満のサンプルで完全な分析を行い サンプル回収も万全に行います 迅速な測定時間 µ- セル SAXSpaceは ラインコリメートX 線ビームを使用するオプションに対応する唯一のSAXSシステムです サンプル全体の大容量標本の照射が可能なこのオプションによって測定時間が劇的に短縮されるため 局所的な放射線損傷の発生を防ぐことができます コリメーションタイプの詳細については 右ページをご覧ください 操作が簡単 SAXSpaceの主要な特長は 操作が簡単であることです システムは自動調整されるため ユーザーはすばやく簡単に タンパク質サンプルに対するSAXSの結果を得ることができます コンパクトでありながら信頼性の高い結果をハイスループットで提供し メンテナンスの必要性は最小限に抑えられています

7 アプリケーションに応じた最適なコリメーション ポイントにもラインにも対応 -1 つのシステムで 2 つの選択肢 いずれのコリメーションタイプにも アプリケーションに対して異なる利点があります SAXSpace は両方を提供することで ユーザーによる選択を可能にしています SAXS 分析では X 線は コリメーションのプロセスにおいて明確に定義されたビーム ( ポイントまたはライン ) に変換されます 一般的な SAXS システムでは ポイントコリメーションのみが搭載されています 先進的なクラツキベースのコリメーションシステムをベースに開発された SAXSpace は ポイントコリメーションとラインコリメーションのすばやい切り替えが可能な唯一の SAXS システムです ポイントコリメーションは 配向性サンプルや不均質な構造を持つ 固体の解析に適しています ラインコリメーションは 液体の測 定 特に散乱信号が少ないタンパク質溶液などの測定に適していま す ラインコリメーションされた入射 X 線ビームは 大容量サンプ ルの大量のタンパク質を照射します これにより 各タンパク質分 子への放射は抑えながら 高い散乱信号を得ることができます 従 って ラインコリメーションは ポイントコリメーションと比べて 測定時間を劇的に短縮することが可能です 非配向性の異方性サ ンプルをラインコリメーションで測定した場合 デスメア補正を行って 欠落した情報がないことを確認します 多くの論文などに見られるように この数十年間で 様々なデスメアルーチンが開発され 多数の異なる種類のサンプルを適切に測定できるようになってきました 以下の例は この手順の正確性を示すものです SAXSpace とシンクロトロンの比較 I(q) normalized この図は 専用のBio-SAXSシンクロトロンビームライン ( ポイントコリメーション ) によって測定されたデータと SAXSpace( ラインコリメーション ) によって測定されたデータを比較したものです デスミア処理後のラインコリメーション結果は 測定したq 範囲全域において ポイントコリメーション結果と一致しました わずか30 分の測定時間で SAXSpaceは シンクロトロン機器と同じ品質のデータを生成できました もちろん シンクロトロンデータに適用される全ての評価手法を SAXSpaceで測定したデータにも適用できます 10-3 希釈したタンパク質溶液 SAXSpace 30 分 ラインコリメーション SAXSpace 30 分 校正後 Bio-SAXSビームライン ヨーロッパ分子生物学研究所 (EMBL) ハンブルグ 2 分 q[nm -1 ]

8 株式会社アントンパール ジャパン , A-8054 Graz Daiwa 品川 North ビル 4 階 Tel.: Fax: jp@anton-paar.com Web: 仕様は予告なく変更されることがあります 06/16 D21IP007JA-A

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