ソラフェニブ薬理試験の概要文効力を裏付ける試験 in vitro 試験ソラフェニブは当初, 生化学的検討により C-RAF 阻害物質の構造 - 活性相関を評価する過程で発見された新規化合物であるソラフェニブの活性について in vitro で行っ

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まともうばら
5 years ago
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1 効力を裏付ける試験 in vitro 試験は当初, 生化学的検討により C-RAF 阻害物質の構造 - 活性相関を評価する過程で発見された新規化合物であるの活性について in vitro で行った試験の結果を, 表にまとめた以下に, 表に示した各試験の方法の概略について記載するキナーゼ阻害活性 RAF (C-RAF, B-RAF 及び V0E B-RAF*), MEK-1, ERK-1 に対する阻害活性は,γ-[ 33 P] ATP を用い, 放射活性を測定することでリン酸化阻害活性を測定した受容体型チロシンキナーゼ (RTK) に対する阻害活性は, ユーロピウムで標識したリン酸化チロシン抗体を用いて, チロシンリン酸化阻害活性を検討した細胞を用いた系でのキナーゼ阻害活性腫瘍細胞における MEK1/2,ERK1/2, 及び PKB に対する阻害活性は, 各細胞を種々の濃度の存在下でインキュベートした後, 細胞溶解液を調製し,MEK1/2,ERK1/2, 及び PKB, 並びにそれぞれのリン酸化されたものに対する抗体を用いて検討した RTK の自己リン酸化に対する阻害活性は, 各細胞を種々の濃度の存在下でインキュベートした後, 細胞溶解液を調製し, 各 RTK 及びそれぞれのチロシンリン酸化されたものに対する抗体を用いて検討した細胞増殖阻害活性腫瘍細胞は 10% FCS 存在下で, 血管平滑筋細胞は PDGF 存在下でそれぞれ培養し, 種々の濃度のを添加しインキュベートした後, 前者は細胞内 ATP 量を, 後者は BrdU 取り込み量を計測することで生存細胞数を評価したは, 低濃度で野生型 C-RAF,B-RAF 及び変異型 V0E B-RAF* を強力に阻害したまた, 本薬は, 腫瘍進行との関連が知られる RTK(FLT-3,c-KIT,VEGFR-2,VEGFR-3,PDGFRβなど ) についても同様に強力に阻害した ( 表 ) 一方,MEK-1,ERK-1,EGFR,HER2/NEU, c-met,pka,pkb,igfr-1,cdk-1/ サイクリン B,PIM-1,PKC-α 及び PKC-γに対しては,10 µm の高濃度でも阻害作用を示さなかった ( ,MRC [21]) 細胞を用いた系においても, は,RAF/MEK/ERK シグナル伝達系において RAF の下流に位置する MEK 及び ERK のリン酸化, 並びに RTK の自己リン酸化を阻害した ( 表 ) また, 腫瘍細胞あるいは血管平滑筋細胞の増殖に対しても, 阻害活性を示した ( 表 ) *: かつて V599E B-RAF として発見されたもの [22] 5

2 表の in vitro 薬理活性 Biochemical Assay a ( 各キナーゼに対する阻害活性 ) IC 50 (nm) C-RAF b 6 B-RAF wild-type 22 B-RAF V0E mutant 38 VEGFR-2 90 VEGFR-2 (mouse) 6 VEGFR-3 (mouse) 12 PDGFR-β (mouse) 57 FLT-3 58 c-kit 68 FGFR Cellular Mechanism c ( 細胞を用いた系での各キナーゼに対するリン酸化阻害活性 ) IC 50 (nm) MDA MB 231 MEK phosphorylation (Breast) 40 MDA MB 231 ERK phosphorylation (Breast) 90 BxPC-3 ERK phosphorylation (Pancreatic) 1200 LOX ERK phosphorylation (Melanoma) 880 VEGFR-2 receptor phosphorylation (3T3 cells) d VEGF-stimulated ERK phosphorylation (HUVECs) e bfgf-stimulated ERK phosphorylation (HUVECs) 620 VEGFR-3 (mouse) receptor phosphorylation (293 cells) 100 f PDGFR-β phosphorylation (HAoSMC) 80 FLT-3 receptor phosphorylation (ITD i, 293 cells) 20 Cellular Proliferation ( 細胞増殖阻害活性 ) IC 50 (nm) MDA MB 231 (10% FCS) g 20 PDGFR-β-stimulated HAoSMC f (0.1% BSA) h 220 a b c d e f g h i Recombinant enzyme assay Raf kinase activated with Lck (full length CRAF) Mechanistic cellular assays all performed in 0.1% BSA Western blot assay format with Phospho-VEGFR-2 antibody Human umbilical vein endothelial cells Human aortic smooth muscle cells Fetal calf serum Bovine serum albumin internal tandem duplication In vivo 抗腫瘍活性の抗腫瘍効果について,in vivo で様々なヒト腫瘍細胞株を用いた異種移植マウス ( 担癌 ) モデルを用いて検討した結腸癌細胞株である HCT-116( ,MRC-01019),DLD-1 ( ,MRC-01264),Colo-205 及び HT-29 [21]( ,MRC-01264), 非小細胞肺癌細 6

3 胞株である NCI-H4( ,MRC-01019),NCI-H23( ,RMI-00091) 及び A549 ( ,MRC-01195), 乳癌細胞株である MDA-MB-231( ,MRC-01195) 及び MX-1 ( ,RMI-00085), 膵癌細胞株である MiaPaCa-2( ,MRC-01019),AML 細胞株である MV4;11( ,MRC-01276), 黒色腫細胞株である LOX IMVI( ,RMI 及び ,RMI-00121), 卵巣癌細胞株である SK-OV-3( ,MRC-01019) などを用いた担癌モデルに対し, 皮下移植した腫瘍の生着が確認された時点から 9 日間 (DLD-1, Colo-205, HT-29, NCI-H23, LOX IMVI 及び MV4;11),10 日間 (A549 及び MDA-MB-231) 又は 14 日間 (HCT-116, NCI-H4,MX-1,Mia-PaCa-2 及び SK-OV-3), 本薬を 1 日 1 回経口投与したは遊離型あるいはトシル酸塩の形で投与されたが, 用量は全て遊離塩基当量として表示した被験物質の有効性は腫瘍増殖抑制率 (TGI) で表示しており,(1-T/C) 100 [ ただし T と C は, 各試験における最終投与翌日の投与群 (T) と対照群 (C) の腫瘍の平均重量 ] で算出した各種ヒト腫瘍由来細胞株の異種移植モデルに対するの腫瘍増殖抑制効果を表及び図に示すこの表には,2 回の試験の平均値を示したは, 変異型 k-ras(dld-1,mia-paca-2) 又は変異型 b-raf (Colo-205,HT-29) を発現している腫瘍細胞株を用いた担癌モデルに対して腫瘍増殖抑制効果を示したまた, これら両方の遺伝子が突然変異により活性化しているヒト乳癌細胞株 MDA-MB-231 担癌モデルにおいても有効であったさらに,ras と b-raf は野生型であるが増殖因子受容体である EGFR,Her2 を過剰発現しているヒト卵巣癌細胞株 SK-OV-3 担癌モデルにおいても効果を示した EGFR,Her2 からのシグナルも RAS/RAF/MEK/ERK 経路で伝達されるので, このモデルにおいてが有効であることは,RAF 阻害薬が ras や b-raf の変異を持つヒト腫瘍に有効であるだけでなく, そのシグナル伝達経路の上流に位置する増殖因子受容体を過剰発現している腫瘍にも有効であることを示唆しているまた本薬は, 活性型 FLT-3 変異を発現している AML 細胞株 MV4;11 担癌モデルにおいても高い有効性を示した ( ,MRC-01276) 7

4 表ヒト腫瘍細胞株を用いた異種移植マウスモデルにおけるの腫瘍増殖抑制効果 Tumor Type Model CTD Module/ Report Dose (mg/kg/dose free base equiv.) a Colon HCT-116 b / MRC DLD-1 b / MRC Colo-205 c / MRC HT-29 c / MRC NSCLC NCI-H4 b / MRC NCI-H / RMI A549 b / MRC Mammary MDA-MB-231 b,c / MRC Percent TGI ((1-T/C)*100) MX / RMI Melanoma LOX IMVI , / RMI-00120, RMI AML MV4;11 d / MRC Pancreatic Mia-PaCa-2 b / MRC Ovarian SK-OV-3 e / MRC a Compound dosed as BAY or equivalent dose levels of the tosylate salt, BAY b Contains an activating k-ras mutation c Contains an activating b-raf mutation d Contains an activating Flt3 mutation e Contains both wild-type k-ras and b-raf

5 図ヒト腫瘍細胞株を用いた異種移植マウスモデルに対するの腫瘍増殖抑制効果 9

6 ヒト腎細胞癌細胞株 786-O をヌードマウスに皮下移植したモデルに対し, 本薬 15~90 mg/kg/ 日を 21 日間経口投与して腫瘍増殖に対する抑制効果を検討した TGI は投与最終日の腫瘍体積より算出した結果を図に示す TGI は,28~74% であり, mg/kg/day 以上でほぼ完全に増殖を抑制した ( , MRC-01328) 図ヒト腎細胞癌細胞株 786-O 移植マウスモデルにおけるの腫瘍増殖抑制効果マウス腎細胞癌細胞株 RENCA をヌードマウスに皮下移植したモデルに対し, 本薬 7.5~90 mg/kg/ 日を 8-9 日間経口投与して腫瘍増殖に対する抑制効果を検討した TGI は投与最終日の腫瘍体積より算出した結果を図に示す TGI は ~84 % であった ( ,MRC-01271) 10

7 1000 Mean Tumor Weight (mg) Days Post-Implant Untreated Vehicle sorafenib (7.5mg/kg) sorafenib (15mg/kg) sorafenib (mg/kg) sorafenib (mg/kg) sorafenib (90mg/kg) 図マウス腎細胞癌細胞株 RENCA 移植マウスモデルにおけるの腫瘍増殖抑制効果 DLD-1 結腸癌マウスモデルにおいて, 様々な反復投与サイクルで mg/kg/ 日を投与した際の有効性を検討したすなわち, 標準 1 サイクル群 ( 青線 ) では, 試験 6 日目に腫瘍が平均 100 mg となった後,10 日間の投与 (1 回 ) を行った 2 サイクル群 ( 緑線 ) には,10 日間の投与を 2 回施行した 2 回目の投与サイクルは, 平均腫瘍重量が約 350~400 mg となった時点で開始した遅延 1 サイクル群 ( 赤線 ) は,2 サイクル群の 2 回目の投与サイクルで大きな腫瘍に対して投与した時のの有効性を評価するための対照とし, 約 350~400 mg の腫瘍に対して 1 サイクル投与したまた, 連続投与群 ( 茶線 ) では, 他の群の初回投与時から最終投与時まで, を連続投与したは, 標準 1 サイクル群でも遅延 1 サイクル群でも腫瘍増殖を抑制し,TGD ( 腫瘍増殖遅延 :TGD=T-C ただし,T 又は C はそれぞれ投与群又は対照群の腫瘍が, 規定の重量に達するまでの日数の中央値 ) は投与期間に比例した 10 日間のサイクルを 2 回施行した場合には 10 日間 1 サイクルの約 2 倍の TGD が得られ, 日間の連続投与では 10 日間 1 サイクル投 11

8 与時の約 3 倍の TGD が得られた初回投与サイクルで増殖が抑制され投与中止後再増殖した腫瘍は,2 回目の投与サイクルにおいても反応した ( ,MRC-01203)( 図 ) Mean Tumor Weight (mg) Days Post-implant QD x 10 (start day 6) QD x 10 (start day 6 and day 26) QD x 10 (start day 13) QD x 29 (start day 6) CONTROL QD x 10 (6, 26) QD x 10 (6) QD x 10 (13) QD x 29 (6) Vehicle QD x 18 (6) QD:1 日 1 回投与図 DLD-1 ヒト結腸癌マウスモデルにおける反復投与サイクルの腫瘍増殖抑制効果作用機序の作用機序を,HT-29 及び Colo-205 結腸癌細胞株, 並びに MDA-MB-231 乳癌細胞株を皮下移植したマウスモデルを用いて ex vivo で検討した [21]( ,MRC-01264) それぞれの試験で, 腫瘍重量約 100~250 mg の担癌マウスに (1 日 1 回又は mg/kg) を 5 日間経口投与した最終投与から 3 時間後に腫瘍を摘出し,ERK リン酸化の変化をウエスタンブロット解析及び免疫組織化学染色 (IHC) により評価し, が RAF/MEK/ERK 経路に及ぼす影響について検討した一部のモデルの腫瘍検体については, 血管新生阻害作用を評価するため,CD31 に対するヤギポリクローナル抗体で染色し, 微小血管面積及び微小血管密度を画像分析により評価した HT-29 及び MDA-MB-231 細胞株を用いた担癌マウスより得た腫瘍組織では,ERK リン酸化と新生血管の減少が認められたが,Colo-205 モデルより得た標本においては, 新生血管の減少のみが観察された代表的な結果として, リン酸化 ERK(pERK) 応答株 (HT-29) と perk 無応答株 (Colo-205) 12

9 を用いた ERK リン酸化に対するの作用を検討したウエスタンブロット分析の結果を図に示す HT-29 Human Colon Tumor Xenograft Predose Vehicle mg/kg sorafenib mg/kg sorafenib perk 1/2 T. ERK 1/ Colo 205 Human Colon Tumor Xenograft mg/kg mg/kg perk 1/2 Predose Vehicle sorafenib sorafenib T. ERK 1/ perk 1/2: リン酸化 ERK-1 及びリン酸化 ERK-2 T.ERK 1/2: リン酸化状態に関わらない ERK-1 及び ERK-2 図ヒト腫瘍細胞株を用いた異種移植モデルにおける腫瘍組織中の ERK リン酸化に対する 5 日間投与の効果抗 perk 抗体と抗 ERK 抗体を用いたウエスタンブロット分析で,HT-29 ヒト結腸癌組織片では RAF/MEK/ERK 経路の活性化が阻害されたのに対し,Colo-205 ヒト結腸癌組織片では阻害されなかった前述したように, は HT-29 及び Colo-205 結腸癌モデルのいずれに対しても増殖抑制作用を示したが, この結果から,Colo-205 結腸癌モデルではの腫瘍増殖抑制作用は RAF/MEK/ERK 活性化阻害によるものではないと考えられた Colo-205 細胞も HT-29 細胞も同じ V0E BRAF 変異を持ち, この変異がこれらの細胞の異常増殖をもたらしていると考えられている Colo-205 腫瘍では,RAF/MEK/ERK カスケードとは異なる経路が ERK 1/2 を活性化している可能性が示唆された HT-29 モデルと Colo-205 結腸癌モデルの腫瘍血管新生に対するの効果を, 図に示すは,HT-29 腫瘍と Colo-205 腫瘍のいずれにおいても, 溶媒投与群と比較して微小血管面積 (MVA) と微小血管密度 (MVD) を 50~80 % 低下させた 13

A. B. Microvessel Area-MVA ***: p<0.001 v.s. vehicle treated group, @: p<0.05 v.s. untreated group Microvessel Area (%) Microvessel Area (%) C. CD-31 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 @ *** *** 0.

0 untreated vehicle * HT-29 Colo -205 ** sorafenib, mg/kg sorafenib, mg/kg Microvessel Density-MVD Microvessel CT (#/mm 2 ) Microvessel CT (#/mm 2 ) 375 0 225 150 75 0 untreated vehicle 250 200 150

HT-29 or Colo-205 tumors were treated for 5 days with either vehicle or oral sorafenib at or mg/kg. Tumors were collected, sectioned, and stained with anti-cd31 antibodies.

group. Data are presented as mean ± SE (4 samples per group).

10 A. B. Microvessel Area-MVA ***: p<0.001 v.s. vehicle treated p<0.05 v.s. untreated group Microvessel Area (%) Microvessel Area (%) C. CD *** *** 0.0 untreated sorafenib, mg/kg vehicle sorafenib, mg/kg *: p< 0.05, **: p< 0.01, ***: p<0.001 v.s. vehicle treated group untreated vehicle * HT-29 Colo -205 ** sorafenib, mg/kg sorafenib, mg/kg Microvessel Density-MVD Microvessel CT (#/mm 2 ) Microvessel CT (#/mm 2 ) untreated vehicle untreated mg/kg mg/kg *** *** sorafenib, mg/kg sorafenib, mg/kg *** HT-29 Colo -205 *** sorafenib, mg/kg sorafenib, mg/kg Untreated Vehicle Sorafenib Sorafenib Mice with mg HT-29 or Colo-205 tumors were treated for 5 days with either vehicle or oral sorafenib at or mg/kg. Tumors were collected, sectioned, and stained with anti-cd31 antibodies. A-B : The number and area of microvessels, indicated by CD31-positive objects in either HT-29 or Colo-205 tumors, were quantified and percent area and density of microvessel were calculated in each group. Data are presented as mean ± SE (4 samples per group). C: Detection of CD31-positive objects in Colo-205 tumor tissue was apparent in tumors obtained from untreated and vehicle treated animals (left 2 pictures), but was substantially reduced in sorafenib treated tumors (right 2 pictures). *: p<0.01, **: p<0.01, ***: p<0.001 vs vehicle treated group (One-way ANOVA followed by Fisher s PLSD) 図 HT-29 及び Colo-205 結腸癌マウスモデルの腫瘍組織における血管新生に対する (5 日間投与 ) の効果腎細胞癌におけるの作用機序を検討するために, マウス由来腎細胞癌細胞株 RENCA 及びヒト由来腎細胞癌細胞株 786-O をヌードマウスの皮下あるいは腎被膜下に移植したモデルを用いて, 血管新生, 細胞の増殖及び perk の局在について,ex vivo で検討した ( , MRC-01328) ヌードマウスに RENCA 5x10 6 cells を皮下移植し, 腫瘍重量が約 75 mg になった時点より, ソラ 14

11 フェニブ 15,,, 90 mg/kg/ 日を 3 日間経口投与し, 最終投与後に腫瘍を取り出し, それぞれ抗 CD-31 抗体又は抗 αsma 抗体を用いて免疫組織化学染色し, 血管面積を測定した投与群では, 未処置群又は溶媒投与群に比較して, 血管面積の減少が認められた ( 図 ) また, ヌードマウスの腎被膜下に,RENCA 組織片 1mm 3 を移植し, 15,,, 90 mg/kg/ 日を 10 日間経口投与した後, 腎臓を摘出し, 同様に抗 CD-31 抗体又は抗 αsma 抗体を用いて免疫組織化学染色し, 血管面積を測定した場合も, 投与群では, 未処置群又は溶媒投与群に比較して, 血管面積の減少が認められた 15

Microsoft Word - FHA_13FD0159_Y.doc

Microsoft Word - FHA_13FD0159_Y.doc 1 要約 Pin1 inhibitor PiB prevents tumor progression by inactivating NF-κB in a HCC xenograft mouse model (HCC 皮下移植マウスモデルにおいて Pin1 インヒビターである PiB は NF-κB 活性を低下させることにより腫瘍進展を抑制する ) 千葉大学大学院医学薬学府先端医学薬学専攻 ( 主任