Chaperone Plasmid Set （シャペロンプラスミドセット）

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1 Chaperone Plasmid Set (シャペロンプラスミドセット) 説 明 書 v201003_2

2 ポストゲノムの 課 題 として タンパク 質 がクローズアップされてきており タンパク 質 の 構 造 解 析 機 能 解 析 が 重 要 視 されています タンパク 質 の 構 造 機 能 解 析 のためには 目 的 のタンパク 質 を 組 換 え 体 と して 大 量 に 発 現 させることが 不 可 欠 であり 現 在 様 々なタンパク 質 発 現 系 が 開 発 されています なかでも 大 腸 菌 による 発 現 は 最 も 簡 単 で 発 現 系 も 豊 富 なため よく 用 いられています しかしながら 大 腸 菌 で 異 種 タンパク 質 を 発 現 させた 場 合 発 現 タンパク 質 がインクルージョンボディーを 形 成 したり プロテアーゼによる 分 解 を 受 けたりするケースがしばしば 見 られます これは 発 現 タンパク 質 が 正 しく 折 りたたまれないことが 原 因 である 場 合 が 多 く タンパク 質 機 能 研 究 の 大 きな 障 害 でした タンパク 質 の 折 りたたみには それを 介 助 する 分 子 シャペロンの 存 在 が 知 られており in vivo でのタン パク 質 の 折 りたたみの 規 序 を 解 明 するため 多 くの 研 究 がなされています なかでも 株 式 会 社 HSP 研 究 所 は シャペロン 研 究 分 野 で 多 くの 業 績 を 残 しています 本 セットに 含 まれる 5 種 類 のプラスミドは 株 式 会 社 HSP 研 究 所 で 開 発 されたものであり タンパク 質 の 折 りたたみに 共 同 して 働 いていることが 知 られている 複 数 の 分 子 シャペロンが それぞれ 一 つのプラス ミド 上 にコードされ シャペロンチームとして 効 率 良 く 発 現 するように 設 計 されています これらのシャペロンチームのいずれかと 目 的 タンパク 質 を 共 発 現 することにより 従 来 インクルージョ ンボディを 形 成 していたタンパクの 可 溶 性 画 分 への 回 収 効 率 を 高 めることが 報 告 されています( 図 1 参 照 ) I.セットの 内 容 1.Plasmid pg-kje8: 10 ng/μl 100 μl 2.Plasmid pgro7: 10 ng/μl 100 μl 3.Plasmid pkje7: 10 ng/μl 100 μl 4.Plasmid pg-tf2: 10 ng/μl 100 μl 5.Plasmid ptf16: 10 ng/μl 100 μl 各 プラスミドにコードされるシャペロンチーム(マップは 5 ページ 参 照 ) No. Plasmid Chaperone Promoter Inducer Resistant Marker References 1 pg-kje8 dnak-dnaj-grpe arab L-Arabinose Cm 4, 5 groes-groel Pzt-1 Tetracyclin 2 pgro7 groes-groel arab L-Arabinose Cm 4 3 pkje7 dnak-dnaj-grpe arab L-Arabinose Cm 4 4 pg-tf2 groes-groel-tig Pzt-1 Tetracyclin Cm 5 5 ptf16 tig arab L-Arabinose Cm 5 < 利 用 できる 大 腸 菌 発 現 系 > 本 シャペロンプラスミドは pacyc の 複 製 起 点 およびクロラムフェニコール 耐 性 遺 伝 子 (Cm r 遺 伝 子 )を 利 用 しているため 最 もよく 利 用 されている ColE1 タイプ のアンピシリン 耐 性 遺 伝 子 をマーカーとした 大 腸 菌 発 現 系 に 共 存 させて 使 用 でき ます 各 シャペロン 遺 伝 子 は ara B あるいは Pzt -1(tet)プロモーター 下 流 に 配 置 されており 目 的 遺 伝 子 を lac など 他 のプロモーターのコントロール 下 におけば 目 的 タンパク 質 とシャペロンを 別 々に 誘 導 することが 可 能 です 各 プロモーター に 必 要 なコンポーネント(ara C あるいは tet R)はプラスミド 上 に 配 置 されていま す ただし クロラムフェニコール 耐 性 を 示 す 大 腸 菌 を 宿 主 とすることやクロラ ムフェニコール 耐 性 遺 伝 子 を 含 む 発 現 プラスミドとの 組 み 合 わせでは 利 用 できま せん 例 えば pet システムなどで 用 いられる E. coli BL21(DE3)は 宿 主 として 選 択 可 能 ですが Cm r 遺 伝 子 が 挿 入 されており pacyc の 複 製 起 点 を 持 つ plyss や plyse を 保 持 する E. coli BL21(DE3)pLysS, E. coli BL21(DE3)pLysE などは 利 用 できません その 他 使 用 可 能 な 宿 主 としては E. coli JM109 などがあります タカラバイオ( 株 ) 2

3 Tf Synthesized Protein mrna DnaK DnaJ GrpE ATP Proteolysis ADP GrpE ATP Native Form ADP Aggregation ADP Proteolysis GroEL GroES ATP 図 1.in vivo タンパク 質 合 成 系 におけるシャペロンのはたらき( 文 献 1 より) タカラバイオ( 株 ) 3

4 II. 保 存 20 * 適 切 に 保 存 し 受 取 り 後 2 年 を 目 途 にご 使 用 ください III. 使 用 方 法 <シャペロン 共 発 現 > 有 効 なシャペロンの 種 類 や 培 養 条 件 ( 培 地 培 養 温 度 エアレーション 条 件 誘 導 のタイミング 誘 導 剤 の 濃 度 誘 導 時 間 など)は 目 的 タンパク 質 により 異 なっ ています 以 下 に 一 般 的 な 使 用 例 を 示 しますが 目 的 タンパク 質 に 応 じて 至 適 条 件 を 検 討 されることをお 勧 めします 1. 共 発 現 系 の 構 築 目 的 タンパク 質 とシャペロンの 共 発 現 系 の 構 築 は まずシャペロンプラスミドで 形 質 転 換 した 大 腸 菌 を 作 製 し その 後 目 的 タンパク 質 の 発 現 プラスミドで 形 質 転 換 する 2 段 階 の 方 法 が 効 果 的 です なお シャペロンプラスミドと 目 的 タンパク 質 の 発 現 プラスミドを 同 時 に 形 質 転 換 する 1 段 階 法 や 発 現 プラスミドで 形 質 転 換 した 後 にシャペロンプラスミドで 形 質 転 換 する 2 段 階 法 は 経 験 的 に 形 質 転 換 効 率 が 非 常 に 低 くなるため お 薦 め できません (1) 大 腸 菌 発 現 用 の 目 的 タンパク 質 の 発 現 プラスミドを 構 築 する (2) 発 現 用 の 宿 主 大 腸 菌 を 培 養 し 常 法 に 従 ってコンピテントセルを 調 製 する(あ るいは 市 販 のコンピテントセルを 用 いても 良 い) (3)(2)で 調 製 したコンピテントセルを 本 キットのプラスミドのいずれかで 形 質 転 換 し クロラムフェニコール(20 μg/ml)を 含 む 選 択 培 地 プレート 上 で 形 質 転 換 体 を 選 択 する (プラスミド 使 用 量 は 1 回 の 形 質 転 換 あたり 1 μl が 目 安 ) (4) シャペロンプラスミドの 形 質 転 換 体 をクロラムフェニコール(20 μg/ml)を 含 む 液 体 培 地 で 培 養 し 常 法 に 従 いコンピテントセルを 調 製 する (5)(4)で 調 製 したコンピテントセルを 目 的 タンパク 質 の 発 現 プラスミドにより 再 度 形 質 転 換 し クロラムフェニコール(20 μg/ml)と 発 現 プラスミド 選 択 用 の 薬 剤 を 含 む 選 択 プレート 上 で 生 育 する 形 質 転 換 体 を 選 択 する 2. 共 発 現 実 験 以 下 に lac プロモーターの 下 流 に 目 的 遺 伝 子 を 挿 入 した puc 系 プラスミド(ア ンピシリン 耐 性 マーカー)と 本 キットのシャペロン 共 発 現 の 実 験 例 を 示 します さらに 詳 細 な 培 養 条 件 については 文 献 を 参 考 に 条 件 検 討 を 行 ってください (1) 共 発 現 大 腸 菌 を プラスミド 選 択 用 に 20 μg/ml クロラムフェニコールと 50 μg/ml アンピシリン およびシャペロン 発 現 誘 導 用 に 0.5 ~ 4 mg/ml L- アラビノースおよび(あるいは)1 ~ 10 ng/ml テトラサイクリン * を 含 む L 培 地 に 接 種 し 30 ~ 37 で 培 養 する pg-kje8 の 場 合 は L- アラビノース とテトラサイクリンの 両 方 pgro7, pkje7, ptfl6 の 場 合 は L- アラビノースの み pg-tf2 の 場 合 はテトラサイクリンのみを 用 いる *: まずは 0.5 mg/ml L- アラビノース 5 ng/ml テトラサイクリンでお 試 しください 低 濃 度 のテトラサイクリンは 大 腸 菌 の 生 育 に 大 きな 影 響 は 与 えません (2) 培 養 液 の OD600 が 0.4 ~ 0.6 となった 時 点 で 終 濃 度 0.1 ~ 1 mm となるよ うに IPTG を 添 加 し さらに 1 ~ 4 時 間 30 ~ 37 にて 培 養 する (3) 培 養 終 了 後 SDS-PAGE や 活 性 測 定 などにより 目 的 産 物 の 発 現 量 や 可 溶 化 量 を 測 定 し 培 養 条 件 ( 培 地 培 養 温 度 エアレーション 条 件 誘 導 のタイミ ング 誘 導 剤 の 濃 度 誘 導 時 間 など)の 至 適 化 を 検 討 する タカラバイオ( 株 ) 4

5 dnak arac groel arab pg-kje8 (11.1 kb) dnaj grpe groes Pzt-1 tetr arac arab groes pgro7 (5.4 kb) groel rrnbt1t2 Pzt-1 arac arab pkje7 (7.2 kb) grpe groes pg-tf2 (8.3 kb) groel dnak dnaj tetr tig arab arac ptf16 (5 kb) tig プラスミドベクター 図 タカラバイオ( 株 ) 5

6 IV.Q & A Q1. 発 現 するシャペロンタンパク 質 のサイズは? A1. GroEL( 約 60 kda) GroES( 約 10 kda) DnaK( 約 70 kda) DnaJ( 約 40 kda) Tf( 約 56 kda) GrpE( 約 22 kda)です ただし これらの 数 字 は 文 献 上 の 数 値 で 実 際 の 泳 動 では 違 って 見 えることがあります GrpE は 電 気 泳 動 では 29 kda のマー カーより 上 にバンドが 確 認 されます Q2. 発 現 タンパク 質 を 精 製 したいが? A2. 発 現 タンパク 質 の 精 製 には His タグなどを 利 用 したアフィニティー 精 製 が 便 利 です GST タグを 利 用 して 精 製 した 場 合 に 稀 に 精 製 後 の SDS-PAGE でシャペロンタンパ ク 質 のバンドが 見 られることがあります これは シャペロンタンパク 質 が 目 的 タ ンパク 質 を 介 して あるいは 非 特 異 な 吸 着 でグルタチオン 樹 脂 に 残 ってきたもので あると 考 えられています このような 場 合 下 記 のような 方 法 で 改 善 できたという 報 告 があります イオン 交 換 樹 脂 で 分 離 する Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995), 92, 1048 ATP-Agarose 担 体 で 分 離 する J.Biol. Chem. (1984), 259, 8820 融 合 タンパク 質 を 吸 着 させた 樹 脂 を 3 mm Mg-ATP を 含 むバッファーで 洗 浄 する 融 合 タンパク 質 を 吸 着 させた 樹 脂 を 10 mm Mg-ATP 5 mg/ml casein を 含 む バッファー 中 室 温 で 数 十 分 間 保 温 する His タグを 用 いた 場 合 には 上 記 のような 現 象 は 起 こっておりません 発 現 タンパク 質 の 精 製 には His タグを 用 いた 精 製 をお 勧 めします V. 参 考 文 献 総 説 1.Thomas, J. G., et al. (1997) Molecular Chaperones, Folding Catalysts, and the Recovery of Active Recombinant Proteins from E. coli. Appl. Biochem. Biotech, 66: 柳 西 原 (1999) 組 換 えタンパク 質 の 発 現 に 困 ったら シャペロン 機 能 の 強 化 とタンパク 質 分 解 活 性 の 抑 制 バイオサイエンスとインダストリー 57: 西 原 (1999) 大 腸 菌 における 外 来 蛋 白 質 発 現 系 の 改 善 を 目 指 して: 分 子 シャペロ ン 発 現 ベクター プロテアーゼ 多 重 変 異 の 利 用. 化 学 と 生 物 37: シャペロンを 共 発 現 させた 組 換 えタンパク 質 の 可 溶 性 発 現 4.Nishihara, K., et al. (1998) Chaperone Coexpression Plasmids: Differential and Synergistic Roles of DnaK-DnaJ-GroE and GroEL-GroES in Assisting Folding of an Allergen of Japanese Cedar Pollen, Cryj2, in Eschericia coli. Appl. Environ. Microbiol. 64: Nishihara, K., et al. (2000) Overexpression of Trigger Factor Prevents Aggregation of Recombinant Proteins in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 66: コンピテントセルの 調 製 法 と 形 質 転 換 6.D. M. GLOVER, B. D. HAMES 共 編 加 藤 郁 之 進 監 訳 (1997) DNA クローニング 1 基 本 技 術 第 一 章 大 腸 菌 形 質 転 換 技 術, 藤 本 明 子 (1993) 実 験 医 学 別 冊 バイオマニュアルアップシリーズ 遺 伝 子 工 学 の 基 礎 技 術, タカラバイオ( 株 ) 6

7 VI. 関 連 製 品 <コールドショック 発 現 ベクターシリーズ> pcold Vector Set( 製 品 コード 3360) pcold I DNA( 製 品 コード 3361) pcold II DNA( 製 品 コード 3362) pcold III DNA( 製 品 コード 3363) pcold IV DNA( 製 品 コード 3364) pcold TF DNA( 製 品 コード 3365) pcold ProS2 DNA( 製 品 コード 3371) <シャペロンコンピテントセルシリーズ> * Chaperone Competent Cells BL21 Set( 製 品 コード 9120) Chaperone Competent Cell pg-kje8/bl21( 製 品 コード 9121) Chaperone Competent Cell pgro7/bl21( 製 品 コード 9122) Chaperone Competent Cell pkje7/bl21( 製 品 コード 9123) Chaperone Competent Cell pg-tf2/bl21( 製 品 コード 9124) Chaperone Competent Cell ptf16/bl21( 製 品 コード 9125) TaKaRa Competent Cell BL21( 製 品 コード 9126) *: シャペロンプラスミドを 含 む BL21 株 から 調 製 したコンピテントセルです 特 にコールドショック 発 現 ベクター pcold DNA シリーズ( 製 品 コード 3360 ~ 3364)との 組 み 合 わせで 高 い 効 果 が 期 待 できます なお 宿 主 に 用 いている BL21 株 は T7 RNA Polymerase を 発 現 していないため pet システムなどの T7 プロモーターを 利 用 した 発 現 系 には 使 用 できません VII. 注 意 本 製 品 は 研 究 用 として 販 売 しております ヒト 動 物 への 医 療 臨 床 診 断 用 には 使 用 し ないようご 注 意 ください また 食 品 化 粧 品 家 庭 用 品 等 として 使 用 しないでください タカラバイオの 承 認 を 得 ずに 製 品 の 再 販 譲 渡 再 販 譲 渡 のための 改 変 商 用 製 品 の 製 造 に 使 用 することは 禁 止 されています 本 製 品 の う ち Chaperone Plasmid pg-kje8, Pgro7, pkje7, ptf16 に は Salmonella typhimurium 由 来 の ara B プロモーターおよび ara C 遺 伝 子 が 含 まれます これらのプラ スミドで 大 腸 菌 を 形 質 転 換 すると 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 使 用 等 の 規 制 による 生 物 の 多 様 性 の 確 保 に 関 する 法 律 の 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 に 該 当 します ご 使 用 の 際 は 研 究 開 発 等 に 係 る 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 第 二 種 使 用 等 に 当 たって 執 るべき 拡 散 防 止 措 置 を 定 める 省 令 ( 平 成 16 年 文 科 省 環 境 省 令 第 1 号 )および 組 織 内 の 安 全 委 員 会 の 指 示 に 従 って 行 っ てください 本 製 品 は 研 究 目 的 にのみ 使 用 が 許 可 されています スクリーニングや 生 産 など 商 用 目 的 で の 使 用 にあたっては 別 途 弊 社 との 間 で 商 業 利 用 契 約 の 締 結 が 必 要 となります また 本 製 品 を 許 可 無 く 改 変 したり プラスミド 調 製 のために 使 用 することは 禁 じられています タカラバイオ( 株 ) 7

8 NOTICE TO PURCHASER: LIMITED LICENSE [M7] Chaperone plasmid This product is covered by the claims of U.S. Patent No. 6,159,708 and its foreign counterpart patent claims. [M8] Chaperone plasmid This product is covered by the claims of U.S. Patent No. 6,197,547 and its foreign counterpart patent claims. v201003_2