タイトル；DPP-IV阻害薬の開発研究

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1 DPP-IV 阻 害 剤 の 創 薬 研 究 2010 年 福 島 浩

2 DPP-IV 阻 害 剤 の 創 薬 研 究 福 島 浩

3 目 次 総 論 第 1 節 はじめに 第 2 節 DPP-IV 阻 害 剤 について 第 3 節 研 究 の 概 要 本 論 第 1 章 2-シアノピロリジン 誘 導 体 の 置 換 基 変 換 及 び DPP-IV 阻 害 作 用 第 1 節 置 換 ピロリジン 誘 導 体 のデザイン 第 2 節 置 換 ピロリジン 誘 導 体 の 合 成 第 3 節 置 換 ピロリジン 誘 導 体 の DPP-IV 阻 害 作 用 第 4 節 (2S,4S)-4-Fluoro-1-L-isoleucylpyrrolidine-2-carbonitrile の 体 内 動 態 及 び in vivo 薬 効 試 験 第 2 章 α-アミノ 酸 側 鎖 を 有 する2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 の 合 成 及 び DPP-IV 阻 害 作 用 第 1 節 α-アミノ 酸 側 鎖 を 有 する2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 の 合 成 第 2 節 α-アミノ 酸 側 鎖 を 有 する2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 の DPP-IV 阻 害 作 用 及 び 化 学 的 安 定 性 第 3 節 α-アミノ 酸 側 鎖 を 有 する2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 の in vivo 薬 効 試 験 第 4 節 (2S,4S)-4-Fluoro-1-(3-methyl-L-valyl)pyrrolidine-2-carbonitrile の 立 体 異 性 体 の 合 成 DPP-IV 阻 害 作 用 及 び 立 体 構 造 確 認 第 3 章 N- 置 換 グリシン 側 鎖 を 有 する2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 の 合 成 及 び DPP-IV 阻 害 作 用 第 1 節 N- 置 換 グリシン 側 鎖 を 有 する2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 の 合 成 第 2 節 N- 置 換 グリシン 側 鎖 を 有 する2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 の DPP-IV 阻 害 作 用 第 3 節 (2S,4S)-4-Fluoro-1-[N-(2-hydroxy-1,1-dimethylethyl)glycyl]pyrrolidine-2- carbonitrile の 体 内 動 態 及 び in vivo 薬 効 試 験

4 第 4 節 TS-021の 合 成 結 論 謝 辞 実 験 の 部 第 1 章 に 関 する 実 験 第 2 章 に 関 する 実 験 第 3 章 に 関 する 実 験 薬 理 実 験 引 用 文 献

5 総 論 第 1 節 はじめに 近 年 研 究 開 発 技 術 の 進 展 により 医 薬 の 標 的 となりうる 生 体 分 子 が 多 数 発 見 されて いる しかしながら これらは 安 全 性 や 人 での 有 効 性 といった 点 から 医 薬 品 の 標 的 と しては 適 さない 生 体 分 子 を 数 多 く 含 んでおり 現 実 的 に 研 究 対 象 となる 標 的 分 子 は 多 くはない たとえその 標 的 分 子 に 作 用 する 化 合 物 が 医 薬 品 に 成 り 得 る 場 合 でも 市 販 に 至 るには 数 多 くのハードルを 乗 り 越 えなくてはならず 幸 運 にも 多 くの 人 々に 供 さ れる 薬 になるのは 数 多 く 合 成 された 化 合 物 の 中 のほんの 一 握 りの 化 合 物 だけである 最 近 は 更 にこのハードルが 高 くなり 医 薬 品 開 発 の 成 功 確 率 は 益 々 低 下 している 一 方 この 成 功 確 率 を 高 めるべく 数 々の 新 技 術 が 発 展 してきた 合 成 効 率 を 高 めたコ ンビナトリアルケミストリー X 線 や NMR などの 測 定 装 置 や 計 算 化 学 を 活 用 しデザ インの 精 度 を 高 める 手 法 などの 成 功 例 も 相 次 いで 報 告 されている これら 新 技 術 の 発 展 はあるもののメディシナルケミストリー( 創 薬 化 学 )の 本 質 は 変 わらず 多 くの トライアルアンドエラーの 繰 り 返 し 即 ち 地 道 な 研 究 の 積 み 重 ねによって 新 薬 が 見 出 される 場 合 が 多 い 一 方 患 者 や 医 療 現 場 の 立 場 から 医 薬 品 を 見 てみると まだまだ 満 足 のいく 医 薬 品 が 十 分 に 揃 っていない 疾 患 が 多 いと 言 われている 癌 やアルツハイマー 病 など 治 療 効 果 が 十 分 でない 疾 病 は 勿 論 耐 性 菌 や 新 型 ウイルスの 出 現 が 問 題 となっている 感 染 症 も 高 い 治 療 効 果 を 持 つ 薬 剤 が 望 まれている そのような 領 域 に 比 べ 糖 尿 病 領 域 は 一 部 に 新 規 薬 剤 不 要 論 がある 既 に 血 糖 低 下 薬 があり 且 つ 食 事 と 運 動 による 治 療 が 大 切 であることが 不 要 論 の 理 由 であるが 現 実 は 治 療 効 果 が 十 分 に 得 られているとは 言 い 難 い 長 年 糖 尿 病 治 療 の 中 心 的 な 薬 剤 であったスルホニル 尿 素 (SU) 薬 では 長 期 使 用 により 膵 臓 ランゲルハンス 島 β 細 胞 ( 膵 β 細 胞 )を 疲 弊 させ 膵 β 細 胞 のアポトー シスを 促 進 するため 薬 が 効 かなくなる 所 謂 二 次 無 効 となる SU 薬 以 降 に 開 発 されたα-グルコシダーゼ 阻 害 薬 やチアゾリジン 誘 導 体 ビグアナイド 薬 は 膵 β 細 胞 をアポトーシスから 保 護 するとの 意 見 もあるが 明 確 な 証 明 特 にヒトにおける 証 明 は 乏 しい 最 近 の 検 討 では ビグアナイド 薬 でも 6~7 年 の 経 過 をみると 薬 剤 の 効 果 が 不 十 分 になり SU 薬 の 二 次 無 効 と 同 様 な 事 象 が 認 められるとの 報 告 もある 加 えて 血 糖 低 下 作 用 を 有 する 薬 剤 は 副 作 用 として 低 血 糖 を 招 くなど 決 して 完 成 度 が 高 いとは 言 えない 更 に 糖 尿 病 性 腎 症 糖 尿 病 性 網 膜 症 糖 尿 病 性 神 経 症 といった 合 併 症 についてもその 進 展 を 十 分 に 阻 止 できていないといった 指 摘 もある 1

6 このように 糖 尿 病 領 域 では Table 1 に 示 すように 多 くの 経 口 糖 尿 病 薬 が 提 供 され るものの 治 療 効 果 や 患 者 のクオリティーオブライフ(QOL)の 面 で 十 分 とは 言 い 難 い 1) これらの 問 題 を 解 決 するには 新 規 作 用 メカニズムを 有 する 医 薬 品 の 登 場 が 望 ま れている Table 1 経 口 糖 尿 病 薬 の 分 類 1) 分 類 スルホニル 尿 素 (SU) 薬 特 徴 膵 β 細 胞 のK ATP チャンネルに 結 合 し インスリン 分 泌 を 促 進 させる 長 期 間 臨 床 の 場 で 使 用 されていて 年 齢 体 重 を 問 わず 第 一 選 択 薬 として 有 用 である 長 期 間 使 用 していると 多 くの 患 者 で 血 糖 は 次 第 に 上 昇 してくる( 二 次 無 効 )ことがあるが 他 の 系 統 の 薬 剤 でも 二 次 無 効 は 同 様 に 起 こると 推 測 される 低 血 糖 と 体 重 増 加 に 注 意 が 必 要 である ビグアナイド 薬 α-グルコシダーゼ 阻 害 薬 チアゾリジン 薬 速 効 型 インスリン 分 泌 促 進 薬 肝 臓 からのグルコース 放 出 を 抑 制 する 作 用 が 強 く 筋 肉 を 中 心 とした 抹 消 組 織 でのインスリン 感 受 性 を 高 める 作 用 も 有 している 副 作 用 で まれに 重 篤 な 乳 酸 アシドーシスが 起 こる 危 険 があるため 注 意 が 必 要 である 腸 管 での 糖 の 分 解 を 抑 制 して 吸 収 を 遅 らせ 食 後 の 高 血 糖 高 インスリン 血 症 を 抑 える 効 果 がある 副 作 用 として 放 屁 や 下 痢 がしばしばみられ ま れに 重 篤 な 肝 障 害 が 起 こるので 十 分 注 意 が 必 要 である 主 として 抹 消 組 織 でのインスリンの 感 受 性 を 高 め 肝 臓 からのグルコース 放 出 を 抑 制 する 作 用 もある 血 糖 改 善 効 果 SUに 次 いで 大 きい 副 作 用 とし て 体 液 貯 留 作 用 と 脂 肪 細 胞 の 分 化 を 促 進 する 作 用 があるため 体 重 がしば しば 増 加 する 時 に 浮 腫 貧 血 心 不 全 をきたすことがある SU 薬 と 同 様 の 機 序 でインスリン 分 泌 を 促 進 するが 効 果 がより 速 やかに 起 こり また 短 時 間 で 消 失 する 血 糖 改 善 効 果 はSU 薬 ほど 大 きくない 副 作 用 として 低 血 糖 に 注 意 が 必 要 である 第 2 節 DPP-IV 阻 害 剤 について 2007 年 FDA がジペプチジルペプチダーゼ-IV(DPP-IV) 阻 害 剤 2) として 始 めて の 薬 剤 である Sitagliptin(メルク 社 )を 糖 尿 病 治 療 薬 として 承 認 した この Sitagliptin はブロックバスターになりうる 薬 剤 として その 治 療 効 果 に 注 目 が 集 まっている DPP-IV とは N 末 端 から 2 番 目 にプロリン 又 はアラニンを 有 するペプチドの N 末 端 からジペプチドを 切 り 出 す 酵 素 で GLP-1 の 不 活 性 化 や IFN-γや TNF-αの 生 成 などに 関 与 することが 知 られている 3) (Figure 1) 更 に DPP-IV は CD26 抗 原 と 同 一 物 質 であり 免 疫 応 答 に 関 与 する T 細 胞 のレセプターとしての 機 能 も 知 られている そこで DPP-IV 阻 害 剤 は 当 初 炎 症 免 疫 領 域 の 薬 剤 を 目 指 した 研 究 が 行 われていたが 炎 症 免 疫 領 域 での 開 発 には 成 功 せず 1990 年 代 前 半 で 他 の 領 域 での 研 究 も 下 火 とな った 2

7 DPP-IV 阻 害 剤 の 炎 症 免 疫 領 域 での 研 究 に 代 わり 糖 尿 病 領 域 での 研 究 が 盛 んになっ たのは 1990 年 代 後 半 である 4) これは 血 糖 コントロールに 重 要 と 考 えられたグ ルカゴン 様 ペプチド-1 (GLP-1)の 分 解 即 ち 不 活 性 化 の 主 役 が DPP-IV であることが 分 かったからである(Figure 2) 30アミノ 酸 からなる 活 性 型 GLP-1 は DPP-IV に より 速 やかに2アミノ 酸 が 切 断 され 28アミノ 酸 の 不 活 性 型 GLP-1 に 分 解 される この GLP-1 というペプチドは 炭 水 化 物 や 脂 質 の 摂 取 後 に 消 化 管 細 胞 より 分 泌 され GLP-1 受 容 体 に 作 用 し 膵 臓 からのインスリン 分 泌 を 増 強 させる 消 化 管 ホルモンであ る しかし DPP-IV による 分 解 が 速 いため GLP-1 自 体 を 薬 として 開 発 するのは 困 難 であった 最 近 この GLP-1 を 改 良 し 安 定 化 したペプチド 薬 (GLP-1 アナローグ) が 承 認 されている この GLP-1 のインスリン 分 泌 作 用 はグルコース 依 存 的 であり 低 血 糖 時 にはインスリン 分 泌 を 増 強 しない 即 ち 低 血 糖 を 起 こしにくいメカニズムを 有 している この GLP-1 はこれ 以 外 にも 糖 尿 病 治 療 に 有 益 な 膵 β 細 胞 増 殖 作 用 グルカゴン 分 泌 抑 制 胃 排 泄 能 抑 制 中 枢 性 食 欲 抑 制 作 用 などが 知 られており これ ら 作 用 は 当 然 GLP-1 の 分 解 を 阻 害 してその 作 用 を 増 強 する DPP-IV 阻 害 剤 でも 期 待 される 効 果 である 特 に 膵 β 細 胞 増 殖 作 用 は 膵 β 細 胞 の 疲 弊 を 防 ぎ 二 次 無 効 を 引 き 起 こさない 薬 剤 となりうる 期 待 が 持 たれた 3

8 1997 年 に DPP-IV 阻 害 剤 を 糖 尿 病 治 療 に 用 いるというコンセプト (WO )が Demuth らにより 提 唱 され 著 者 もこれまでの 糖 尿 病 治 療 薬 には 無 い 優 れた 特 徴 を 有 する DPP-IV 阻 害 剤 を 創 薬 ターゲットに 選 び 2000 年 に 創 薬 研 究 に 着 手 した 研 究 開 始 当 時 は 基 質 を 模 倣 したシアノピロリジン 部 位 を 有 する 化 合 物 1(フェーリング 社 WO )や NVP-DPP728(ノバルティス 社 WO )といった 化 合 物 が 研 究 されていた それから10 年 以 上 経 ち 現 在 ではシアノピロリジン 骨 格 の Vildagliptin(ノバルティス 社 WO )と シアノピロリジン 部 位 をトリフルオロベンゼンに 変 換 した Sitagliptin(メルク 社 WO )が 海 外 で 市 販 されている 更 にピロリジン 環 部 分 を 変 換 した Saxagliptin(ブリストル マイヤーズ スクイブ 社 WO )や 全 く 異 な る 骨 格 の Alogliptin( 武 田 薬 品 工 業 WO )が 臨 床 第 3 相 試 験 を 実 施 する など 開 発 競 争 が 激 化 している(Figure 3) 4

9 第 3 節 研 究 の 概 要 著 者 が DPP-IV 阻 害 剤 の 創 薬 研 究 に 着 手 した 時 には 血 糖 低 下 薬 としての 研 究 が 開 始 され 化 合 物 としてはフェーリング 社 の2-シアノピロリジン 誘 導 体 が 知 られてい た 5) そこで 更 に 強 い 薬 効 を 目 指 して2-シアノピロリジン 1 からの 誘 導 体 展 開 を 計 画 し た(Figure 3) この 化 合 物 1は DPP-IV で 分 解 される 基 質 ペプチドの 模 倣 であり 活 性 中 心 にあるセリン 残 基 の 水 酸 基 がシアノ 基 と 親 和 性 を 有 することで 強 い 阻 害 活 性 が 得 られている 著 者 は これら 誘 導 体 で 全 く 検 討 がなされていなかったピロリジ ン 環 上 の 置 換 基 に 着 目 して 展 開 した そして 4 位 にフッ 素 を 導 入 した 化 合 物 9g に DPP-IV 阻 害 活 性 の 向 上 と 経 口 投 与 時 の 薬 物 血 中 濃 度 改 善 を 見 出 した 6) (Figure 4) このフッ 素 原 子 の 導 入 は 構 造 を 大 きく 変 えずに 静 電 ポテンシャルを 変 化 させること ができるため この 合 成 を 計 画 した 時 点 から 本 化 合 物 の 活 性 に 注 目 していた 更 にイソロイシン 側 鎖 部 分 の 変 換 を 行 い より 立 体 的 に 嵩 高 い 側 鎖 の 導 入 により 溶 液 中 での 安 定 性 が 改 善 されることを 確 認 し その 中 で tert-ブチルグリシン 誘 導 体 23c が 良 好 な 活 性 と 安 定 性 を 有 することを 見 出 した 7) そして 更 に 側 鎖 の 変 換 としてN- 置 換 グリシン 誘 導 体 を 検 討 し 2-ヒドロキシ -1,1-ジメチルエチル 基 を 有 する 36k が 持 続 性 を 有 する 体 内 動 態 を 示 し 病 態 動 物 にて 良 好 な 血 糖 低 下 作 用 を 有 することを 見 出 した 8) (WO ) 著 者 は 良 好 な 阻 害 活 性 と 体 内 動 態 を 有 する 23c と 36k を 見 出 したが より 化 学 的 に 安 定 な 36k を 選 択 し 更 にこの 塩 検 討 により 見 出 されたベンゼンスルホン 酸 塩 TS-021 を 得 て 2003 年 に TS-021 の 臨 床 試 験 実 施 に 至 った 5

10 本 論 第 1 章 2-シアノピロリジン 誘 導 体 の 置 換 基 変 換 及 び DPP-IV 阻 害 作 用 第 1 節 置 換 ピロリジン 誘 導 体 のデザイン DPP-IV は 基 質 となるペプチドの N 末 端 から 2 番 目 のアミノ 酸 がプロリン 又 はア ラニンのペプチドを 認 識 し 2 番 目 と 3 番 目 のアミノ 酸 のアミド 結 合 を 切 断 してジペ プチドを 切 り 出 すセリンプロテアーゼである 9) DPP-IV の 構 造 及 び 基 質 を 模 倣 した 阻 害 剤 の 研 究 によって DPP-IV と DPP-IV 基 質 との 反 応 様 式 が Figure5 のように 推 定 されている 10) 即 ち 基 質 のペプチドを DPP-IV が 切 断 する 場 合 はセリン 630 が アミドのカルボニル 基 を 攻 撃 して 加 水 分 解 が 促 進 されるのに 対 し シアノピロリジン を 有 する DPP-IV 阻 害 剤 1 の 場 合 はセリン 630 とシアノ 基 の 双 極 子 相 互 作 用 により 強 い 阻 害 作 用 が 得 られると 考 えられている 一 般 にプロテアーゼとその 基 質 の 構 造 を 論 じる 際 基 質 の 部 位 を 表 現 するのにアル ファベットの P と 番 号 を 用 いる 基 質 の 切 断 されるペプチド 結 合 を 境 に N 端 方 向 に 1,2,3.. C 端 方 向 に の 番 号 がアミノ 酸 に 振 られる 11) 即 ち Figure 5 ではプロリン 部 分 が P1 site となる ペプチドを 模 倣 した 阻 害 剤 についても 同 様 な 番 号 が 付 けられる 6

11 この DPP-IV の 阻 害 剤 研 究 は 基 質 模 倣 のジペプチド 誘 導 体 が 中 心 であった 実 際 著 者 が 研 究 に 着 手 した 時 に DPP-IV 阻 害 薬 として 知 られていたのは プロリン 及 びそ の 類 縁 体 を 有 するジペプチド 化 合 物 が 大 部 分 であった このペプチド 類 似 の 阻 害 剤 と の 結 合 様 式 から 考 えると 末 端 アミノ 基 P1 site 及 び P2 site の 構 造 Ser630 及 び His740 に 親 和 性 のある 官 能 基 といった 部 位 の 構 造 が 阻 害 活 性 に 大 きな 影 響 を 及 ぼ すと 考 えられる これは 後 に 明 らかにされた DPP-IV と DPP-IV 阻 害 剤 との 共 結 晶 構 造 からも 示 唆 されている(Figure 6) 10) 当 時 の DPP-IV 阻 害 剤 研 究 では プロリン 含 有 ジペプチド 骨 格 を 有 しプロリンのカ ルボン 酸 をシアノ 基 に 変 換 した 化 合 物 が 強 い 阻 害 活 性 を 示 すことが 知 られていた (Figure 7) 2), 5) そこで 著 者 はまず 当 時 ほとんど 検 討 されておらず 活 性 に 関 する 情 報 が 少 ないピロリジン 環 部 分 に 着 目 した 先 に 述 べたように DPP-IV がプロリン 含 有 ペプチドを 強 く 認 識 することから DPP-IV の 基 質 特 異 性 は 主 にプロリン 骨 格 に 依 存 すると 考 えられた 環 構 造 のプロリンはカルボン 酸 の 位 置 と N 端 側 のアミノ 酸 の 位 置 を 限 定 しており そのコンフォメーションが DPP-IV に 良 くフィットしている と 考 えられるからである そして そのコンフォメーションを 変 えずにより 強 い 親 和 性 を 得 るために ピロリ 7

12 ジン 環 への 置 換 基 導 入 を 検 討 することにした その 際 基 本 骨 格 はシアノ 基 を 有 する 化 合 物 1を 選 定 した 置 換 基 については 主 に 4-ヒドロキシプロリンを 原 料 として 4 位 へ 水 酸 基 ハロ ゲン 原 子 アルコキシ 基 オキシ 基 の 導 入 を 検 討 した また 3 位 についても 水 酸 基 フッ 素 原 子 の 導 入 を 検 討 した 第 2 節 置 換 ピロリジン 誘 導 体 の 合 成 Scheme 1 に 示 すように 4 位 水 酸 基 3 位 水 酸 基 4 位 メトキシ 基 4 位 フルオロ 基 12) 4,4-ジフルオロ 基 を 有 する 既 知 の 原 料 2a-h を 用 いた このカルボン 酸 2a-h を EDC-HOBt を 用 いアンモニアと 縮 合 してカルバモイル 体 3a-h へ 変 換 した (a) EDC, HOBt, 25%NH3aq., DMF or CH3CN, (b) 4M HCl / AcOEt; or 4M HCl / 1,4-dioxane, (c) Fmoc-L-isoleucine, EDC, HOBt, N,N-diisopropylethylamine, DMF or CH3CN, (d) (CF3CO)2O, THF, (e) Et2NH, 1,2-dichloroethane; then HCl, (f) Boc-L-isoleucine, EDC, HOBt, N,N-diisopropylethylamine, THF-DMF, (g) Cyanuric chloride, DMF, (h) 2M HCl. モノフルオロ 体 の 原 料 2f 2g は 文 献 に 従 い 4-ヒドロキシプロリン 誘 導 体 にジメ チルアミノサルファトリフルオリド(DAST)を 反 応 させて 得 た 12) この 反 応 は SN2 にて 進 行 し 1,3-trans のヒドロキシプロリンからは 1,3-cis のフッ 素 体 が 1,3- cis のヒドロキシプロリンからは 1,3-trans のフッ 素 体 が 単 一 物 として 得 られた 又 4,4-ジフルオロ 体 は 4-オキソ 体 に DAST を 反 応 させて 得 た 8

13 カルバモイル 体 3a-h は 塩 酸 で 脱 Boc しアミン 体 4a-h へ 導 いた 次 いでイソロイ シンと 縮 合 するが イソロイシンのアミン 保 護 基 は Fmoc と Boc のどちらを 用 いて も 最 終 物 9 を 合 成 することができる Fmoc で 保 護 したイソロイシンを EDC-HOBt を 用 いてアミン 体 4a-g と 縮 合 し 5a-g へ 導 き 次 いで 無 水 トリフルオロ 酢 酸 を 用 いて 脱 水 反 応 を 行 いシアノ 体 6a-g へ 導 き 更 にジエチルアミンによる 脱 Fmoc 反 応 を 経 て 9a-g を 合 成 した Boc で 保 護 したイソロイシンは 同 様 に 4h と 縮 合 して 7h へ 導 き 次 いで 無 水 トリフルオロ 酢 酸 よりも 酸 性 度 が 低 く 脱 Boc の 懸 念 が 少 ないと 思 われる 塩 化 シアヌル-DMF を 用 いて 脱 水 反 応 を 行 いシアノ 体 8h へ 導 き 最 後 に 塩 酸 によ る 脱 Boc 反 応 により 9h を 得 た (a) DAST, CH2Cl2; (b) TFA; (c) Ph3P, CCl4; (d) Et2NH, 1,2-dichloroethane; then HCl; (e) PCC, MS4A, AcOH, CH2Cl2; (f)(cf3co)2o, N,N-diisopropylethylamine, THF. 3 位 フルオロ 体 については 3-ヒドロキシプロリンから 導 かれた 8c を 用 い DAST によるフッ 素 導 入 ( 収 率 38%) トリフルオロ 酢 酸 による 脱 Boc 反 応 により 収 率 51% で 9i を 得 た(Scheme 2) 4 位 クロル 体 については 4-ヒドロキシプロリンから 導 かれた 6a を 用 い トリフェニルホスフィン- 四 塩 化 炭 素 を 用 いた 塩 素 化 により 収 率 60%で 6j を 得 て 次 いでジエチルアミンによる 脱 Fmoc 反 応 により 収 率 53%で 9j を 得 た 4-ケト 体 については 4-ヒドロキシプロリンから 導 かれた 7a を PCC 酸 化 9

14 でケトン 体 7k に 収 率 72%で 変 換 し 無 水 トリフルオロ 酢 酸 を 用 いた 脱 水 反 応 トリ フルオロ 酢 酸 による 脱 Boc 反 応 を 経 て 9k を 収 率 80%で 得 た 第 3 節 置 換 ピロリジン 誘 導 体 の DPP-IV 阻 害 作 用 DPP-IV 阻 害 活 性 は ヒ ト 血 漿 を DPP-IV 酵 素 源 と し Gly-Pro-4-methylcoumaryl-7-amide を 基 質 に 用 い て 測 定 し た Gly-Pro-4-methylcoumaryl-7-amide は DPP-IV で 分 解 して 蛍 光 を 発 する 7-amino-4-methylcoumarin に 変 換 されるため 反 応 液 の 蛍 光 強 度 を 測 定 することによ り DPP-IV 阻 害 活 性 を 算 出 することができる 置 換 基 として 水 酸 基 を 導 入 した 化 合 物 9a-c 及 びメトキシ 基 を 導 入 した 9d と 9e は すべて 置 換 基 のない 1 5), 6) よりも 弱 い 阻 害 活 性 であった(Table 2) 立 体 化 学 に ついて 見 ると 4R 体 の 9a や 9d よりも 4S 体 の 9b や 9e の 方 が 強 い 阻 害 活 性 を 示 した 4-ケト 体 の 9k は IC50=21 nm を 示 し 無 置 換 体 よりも 活 性 が 低 下 していた (4S)-フルオロ 体 9g は IC50=0.6 nm と 非 常 に 強 い 活 性 を 示 し これは 公 知 の DPP-IV 阻 害 剤 の 中 で 最 も 強 い 化 合 物 の1つであった 4,4-ジフルオロ 体 9h も IC50=0.8 nm と(4S)-フルオロ 体 9g と 同 様 に 強 い 活 性 を 示 した しかしながら (4R) -フルオロ 体 9f は IC50=290 nm を 示 し (4S)-フルオロ 体 9g の 1/480 の 活 性 であ 10

15 った (3R)-フルオロ 体 9i 及 び(4S)-クロロ 体 9j は それぞれ IC50=65 nm 23 nm と 無 置 換 体 1 より 活 性 が 減 弱 した ピロリジン 環 の 置 換 基 として (4S)-フルオロ 体 以 外 の 置 換 基 では 活 性 の 向 上 は 見 られなかった このことより DPP-IV のピロリジンが 結 合 する 部 分 は 狭 く フッ 素 以 上 の 大 きさの 置 換 基 を 許 容 できないと 考 えられた (4S)-フルオロ 基 が 阻 害 活 性 を 増 強 する 理 由 は 明 確 ではないが DPP-IV の X 線 構 造 解 析 の 情 報 9) を 利 用 して 次 のように 考 察 した 即 ち (4R)- 置 換 基 が 結 合 する 部 位 は 若 干 陰 性 のチャージを 有 するチロシンのπ 電 子 雲 が 占 有 しているのに 対 し (4S)- 置 換 基 が 結 合 する 部 位 はチロシンの OH やトリプトファンの NH といった 若 干 陽 性 のチ ャージを 有 する 水 素 原 子 が 位 置 するため この 水 素 原 子 と 電 気 陰 性 度 の 高 いフッ 素 原 子 との 親 和 性 が 活 性 増 強 をもたらした 可 能 性 がある Figure 8 に 示 すように フッ 素 原 子 の 導 入 によりフッ 素 周 辺 が 陰 性 の 電 荷 ( 緑 色 )を 帯 びているのが 分 かる 11

16 第 4 節 (2S,4S)-4-Fluoro-1-L-isoleucylpyrrolidine-2-carbonitrile の 体 内 動 態 及 び in vivo 薬 効 試 験 一 般 に 薬 物 の 薬 効 発 現 には 標 的 分 子 に 対 する 活 性 と 標 的 部 位 での 薬 物 濃 度 が 重 要 となる DPP-IV は 血 漿 中 に 存 在 し 活 性 型 GLP-1 を 分 解 するため DPP-IV 阻 害 剤 は 血 中 に 存 在 する 必 要 がある 又 長 期 間 使 用 する 糖 尿 病 薬 であることより 本 薬 剤 は 経 口 剤 が 好 ましい 剤 形 となる 従 って DPP-IV 阻 害 剤 は 経 口 吸 収 性 に 優 れ 薬 効 発 現 に 十 分 な 血 中 濃 度 を 有 する 必 要 がある 著 者 は2-シアノピロリジン 誘 導 体 の 置 換 基 導 入 を 検 討 し その 結 果 (4S)-フルオ ロ 体 9g に 活 性 向 上 が 認 められたため その 経 口 吸 収 性 を 調 べた(Figure 7) ジフルオロ 体 9h も 活 性 が 向 上 したが 第 2 章 で 述 べるように 化 学 的 安 定 性 に 問 題 があったため 詳 細 な 検 討 は 行 わなかった Plasma drug concentrations (ng/ml) (4S)-フルオロ 体 9g と 無 置 換 体 1 5), 6) をそれぞれ 1mg/kg の 用 量 でラットに 経 口 投 与 し 5 分 10 分 15 分 30 分 60 分 120 分 後 の 血 漿 中 薬 物 濃 度 を 測 定 した 最 高 血 中 濃 度 (Cmax)を 比 較 すると 1 が 投 与 10 分 後 に 147 ng/ml であったのに 対 し 9g は 投 与 後 10 分 後 に 372 ng/ml と フッ 素 原 子 の 導 入 により 約 2.5 倍 の 向 上 を 示 し た 詳 細 な 検 討 をしていないため Cmax の 向 上 理 由 は 明 確 ではないが 消 化 管 からの 吸 収 性 向 上 又 は 分 布 容 積 の 低 下 が 考 えられる 分 布 容 積 とはとは 薬 物 が 瞬 時 に 血 漿 中 と 等 しい 濃 度 で 各 組 織 に 分 布 すると 仮 定 したときに 求 められる 容 積 で 体 内 薬 物 量 を 血 漿 中 濃 度 で 割 った 薬 物 固 有 の 値 である 体 内 薬 物 量 が 同 じであれば 分 布 容 積 が 小 さいほど 血 漿 中 濃 度 が 高 くなる 12

17 このように 活 性 や 体 内 動 態 で 優 れた 特 徴 を 有 する 9g について in vivo 薬 効 試 験 を 行 った 肥 満 で 耐 糖 能 異 常 を 示 すモデル 動 物 である Zucker fatty rats を 用 いて 実 施 した 13) この 試 験 は 経 口 糖 負 荷 試 験 (Oral Glucose Tolerance Test ; OGTT)と 呼 ば れ 糖 を 経 口 投 与 することで 血 糖 上 昇 を 引 き 起 こし 薬 剤 を 用 いて 血 糖 上 昇 抑 制 効 果 をみる 試 験 であり 食 後 高 血 糖 改 善 作 用 をみる 代 表 的 な 試 験 方 法 である 今 回 の 試 験 では 薬 剤 投 与 30 分 後 にラット 体 重 1kg あたり 2g のグルコースを 経 口 投 与 し 経 時 的 に 採 血 した 正 常 な Zucker rats を 用 い 薬 剤 の 入 っていない 水 を 投 与 した 群 (Lean)では 糖 負 荷 後 の 血 糖 上 昇 は 少 ないが 耐 糖 能 異 常 を 示 す Zucker fatty rats を 用 いて 薬 剤 の 入 っていない 水 を 投 与 した 群 (Vehicle)では 糖 負 荷 後 に 血 糖 が 大 きく 上 昇 した(Figure 8A) Zucker fatty rats に 化 合 物 9gを1mg/kg 及 び4mg/kgの 用 量 で 経 口 投 与 すると 糖 負 荷 30 分 後 に Vehicle に 比 べ 血 糖 低 下 が 見 られた そして 60 分 までの 血 糖 値 曲 線 下 面 積 (Area under the Curve ; AUC)では 4 mg/kg で 有 意 に 高 血 糖 を 改 善 した (Figure 8B) 血 漿 中 の DPP-IV 活 性 は どちらの 投 与 量 においても 糖 負 荷 後 15 分 でほぼ 完 全 に 阻 害 された(Figure 8D) そして 1 mg/kg では 糖 負 荷 後 90 分 後 から 徐 々に DPP-IV 活 性 が 上 昇 を 始 めた 又 糖 負 荷 15 分 後 の 血 漿 中 インスリン 濃 度 は 1 mg/kg 及 び 4 mg/kg の 両 用 量 で Vehicle 群 の2 倍 以 上 を 示 した(Figure 8C) このことは 化 合 物 9g が DPP-IV を 阻 害 することで 活 性 型 GLP-1 の 分 解 を 抑 制 し これにより 活 性 型 GLP-1 が 増 え 膵 臓 β 細 胞 でインスリン 分 泌 を 刺 激 するというメ カニズムを 支 持 する 結 果 である このように 著 者 は 糖 負 荷 試 験 にて 血 糖 上 昇 を 抑 制 する 新 規 な DPP-IV 阻 害 剤 9g を 見 出 すことができた 13

18 * ## *** *** Effects of oral administration of 9g (1 or 4 mg/kg) on plasma glucose (A), plasma glucose AUC 60min (B), plasma insulin at 15 min afetr glucose loading (C) and plasma DPP-IV activity (D) during OGTT in Zucker fatty rats. Each point represents the mean + S.E. (n=6). * p<0.05, *** p<0.001 vs. Vehicle, Dunnett s test. ## p<0.01 vs. Vehicle, Student s t-test. 14

19 第 2 章 α-アミノ 酸 側 鎖 を 有 する2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 の 合 成 及 び DPP-IV 阻 害 作 用 第 1 節 α-アミノ 酸 側 鎖 を 有 する2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 の 合 成 著 者 の 見 出 した2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 9g は ph1.2 の 酸 性 水 溶 液 中 では 安 定 であったが ph 6.8 の 中 性 水 溶 液 中 で 若 干 安 定 性 に 欠 けており 37 で 6 時 間 加 温 すると 残 存 率 70%であった(Table 3) ジフルオロ 体 9h は 更 に 安 定 性 に 欠 け ph 6.8 の 中 性 水 溶 液 中 で 残 存 率 8%であったが 分 解 物 を 精 査 していな いため 不 安 定 性 の 原 因 は 明 らかではない a) HPLC determination after 24 h (ph 1.2) or 6 h (ph 6.8) incubation at 37 C in aqueous solution. 4-フルオロ 体 9g の 分 解 の 最 初 のステップは 塩 基 性 窒 素 原 子 のシアノ 基 への 分 子 内 求 核 攻 撃 と 考 えられ この 結 果 環 状 アミジン 10 が 生 成 し 引 き 続 きジケトピペラ ジン 体 11 に 分 解 すると 推 定 できる(Table 4) 化 合 物 9g を ph 6.8 のバッファー 中 60 で 2 時 間 加 熱 すると 逆 相 HPLC にて 保 持 時 間 4.7 分 のピークが 67% 生 成 し これは 環 状 アミジン 体 10 と 推 定 された そして 更 に 加 熱 すると 10 時 間 後 には 保 持 時 間 7.4 分 のピーク(86%)に 変 化 し これはジケトピペラジン 体 11 と 推 定 された 15

20 a) The solution was then analyzed using reverse phase HPLC using a CAPCELL PAK UG120 (5 mm particle size, φ mm; SHISEIDO) and eluted at 1.0 ml/min with acetonitrile H 2 O (15 : 85 v/v, 10 mm ammonium acetate solution); its UV absorbance was monitored at 210 nm. b) Compound 9g was dissolved in ph 6.8 Britton Robinson buffer solution and incubated at 60 C. 次 いで 10 及 び 11 の 構 造 確 認 を 行 った 環 状 アミジン 体 10 は 中 性 溶 液 中 で 9g から 生 成 するが 水 溶 性 が 高 く 且 つ 化 学 的 安 定 性 に 欠 けるため 水 溶 液 中 から 単 離 する のは 困 難 であった そこで 9g のフリー 体 である 12 の 環 化 反 応 をカルボン 酸 存 在 下 有 機 溶 媒 中 で 行 った 即 ち 12 をエタノール-n-ヘキサン 中 で 1.1 当 量 の 酢 酸 を 加 え ると 容 易 に 環 化 し 環 状 アミジンの 酢 酸 塩 13 の 結 晶 が 得 られた 構 造 は NMR Mass 元 素 分 析 により 確 認 した このカルボン 酸 による 環 化 促 進 効 果 は 9g のカルボン 酸 塩 形 成 を 検 討 している 際 偶 然 観 察 されたものである 得 られた 13 を ph 6.8 のバッファー 中 80 で 加 熱 すると ジケトピペラジン 体 11 が 得 られた(Scheme 3) 化 合 物 13 と 11 は 各 種 スペクトルデータからその 構 造 が 支 持 され HPLC の 保 持 時 間 は 9g のバッファー 中 での 分 解 物 と 一 致 した しかし NMR の J 値 からではその 立 体 化 学 については 明 らかではなかった 立 体 構 造 を 明 らかにす るために 11 の X 線 結 晶 解 析 を 実 施 したところ 環 連 結 部 位 の 立 体 化 学 が 反 転 してい ることが 判 明 した しかし 環 状 アミジン 体 13 の 立 体 化 学 が 分 からないためどの 段 階 で 反 転 したかは 明 らかではない 環 化 体 11 のエネルギーをその 8a-epi 体 のエネル ギーと 比 較 すると 11 の 方 が 0.93kcal/mol 安 定 であり 従 って 安 定 な 方 に 異 性 化 した と 考 察 した 9g 又 は 12 の 立 体 化 学 に 関 しては 直 接 的 な 確 認 はできていないが 原 料 15 の 立 体 化 学 が X 線 結 晶 解 析 によりにより 明 らかなことと 後 述 する 化 合 物 23c ではその 立 体 異 性 体 の 阻 害 活 性 が 大 幅 に 低 下 することより 9g 又 は 12 の 立 体 化 学 は(2S,4S)で 16

21 あることは 疑 いないと 考 える Reagents: (a) AcOH, EtOH, n-hexane, rt, overnight; (b) ph 6.8 buffer, 80, 5h. このように 9g の 分 解 が 分 子 内 環 化 によることが 分 かったので より 安 定 な 化 合 物 を 得 るために1 級 アミンの 周 辺 環 境 を 変 えることとした 即 ち P2 site を 変 換 する ことで 環 化 を 起 こしにくくする 検 討 を 行 った まず 9g の 合 成 方 法 と 同 様 に Boc 体 15 から 16 を 合 成 し 中 間 体 とした 6), 12) (Scheme 4) 又 誘 導 体 合 成 をより 効 率 的 に 行 うために シアノ 体 中 間 体 としてを 18 用 いるこ とを 考 えた 化 合 物 15 を DMF 中 で 塩 化 シアヌル 14) を 用 いて 脱 水 することで 化 合 物 17 を 得 て 次 いで 塩 酸 により 中 間 体 18 を 得 た アミン 塩 酸 塩 は 共 に 中 間 体 として 用 いた Reagents: (a) 4M-HCl / AcOEt ; (b) cyanuric chloride / DMF ; (c) 2M-HC l / H 2 O-MeOH P2 site 変 換 体 合 成 ルートを Scheme 5 に 示 す P2 site アミノ 酸 の 保 護 基 としては Boc 又 は Fmoc の 何 れも 用 いることができる 又 フッ 素 体 中 間 体 として 16 或 いは 18 の 何 れも 利 用 可 能 であるが 18 を 用 いる 方 が1 工 程 少 なく 効 率 的 に 合 成 すること 17

22 ができる 化 合 物 16 は EDC-HOBtを 用 いて N-Boc 又 は N-Fmoc アミノ 酸 と 縮 合 し 19a-e 19j 19k 21i を 合 成 した 同 様 の 方 法 で シアノ 体 18 は 20h と 22g に 変 換 した アミノ酸 保 護 基 に 関 しては Boc 基 及 び Fmoc 基 の 何 れでも 合 成 可 能 であるが Fmoc 基 の 場 合 は 脱 保 護 の 際 に 残 骸 であるフルオレン 部 分 の 除 去 に 手 間 取 ることもあり Boc 基 を 中 心 に 合 成 した O-tert-ブチルトレオニン 体 23g の 場 合 は 酸 性 条 件 で の 脱 Boc で O-tert-ブチル 基 が 分 解 する 可 能 性 があったため Fmoc 基 を 用 いた 23h 23i の 場 合 は どちらの 保 護 基 を 用 いても 問 題 ないと 考 えられる Reagents: (a) BocNR 2 CH(R 1 )CO 2 H, EDC, HOBt, DMF ; (b) cyanuric chloride, DMF ; or (CF 3 CO) 2, THF ; (c) 2M-HCl / H 2 O-MeOH ; (d) FmocNR 2 CH(R 1 )CO 2 H, EDC, HOBt, DMF ; (e) Et2NH, 1,2-dichloroethane ; then HCl 先 に 述 べたように 分 子 内 環 化 を 防 ぎ 化 学 的 安 定 性 を 増 すために P2 site の 変 換 を 試 みた 天 然 のアミノ 酸 だけでなく 非 天 然 のアミノ 酸 や 側 鎖 が 修 飾 してあるアミノ 酸 誘 導 体 を 用 い 多 様 な 側 鎖 を 検 討 した 側 鎖 部 分 で 立 体 的 に 混 み 合 う 方 がより 環 化 が 起 こりにくいと 考 えられたため 嵩 高 い 側 鎖 を 導 入 した 又 それ 以 外 にも 長 鎖 の 側 鎖 や 環 状 α-アミノ 酸 であるプロリンなど 多 様 な 側 鎖 を 導 入 した P2 site には 天 然 のアミノ 酸 (バリン プロリン) 非 天 然 アミノ 酸 (アロイソロ イシン tert-ブチルグリシン シクロヘキシルグリシン) アミノ 酸 誘 導 体 (N-Cbz -セリン O-メチルトレオニン O-ベンジルトレオニン O-tert-ブチルトレオ ニン)を 用 いた 18

23 シアノ 体 20a-e 22h 22i は カルバモイル 体 19a-e 21h 21i を 塩 化 シアヌル と DMF 又 は 無 水 トリフルオロ 酢 酸 と N,N-ジイソプロピルエチルアミンで 処 理 す ることにより 得 られた Boc で 保 護 した 化 合 物 20a-f 20j-n を 塩 酸 を 用 いて 脱 保 護 して 23a-f 23j-n に 導 いた 一 方 Fmoc で 保 護 した 化 合 物 22g-i を ジエチルアミンを 用 いて 23g-i に 導 いた 環 状 側 鎖 として7-ヒドロキシテトラヒドロイソキノリン 誘 導 体 20m に 比 較 的 良 好 な 活 性 が 見 られたので 更 に 水 酸 基 を 修 飾 した 誘 導 体 を 合 成 した 7-メトキシテ トラヒドロイソキノリン 誘 導 体 20o と7-カルバモイルメトキシテトラヒドロイソ キノリン 誘 導 体 20p は 7-ヒドロキシテトラヒドロイソキノリン 誘 導 体 20m をア ルキル 化 することで 得 た(Scheme 6) そして 20o 20p を 塩 酸 で 処 理 して 脱 Boc 化 反 応 を 行 い 23o 23p を 得 た Reagents: (a) R 3 -X, K 2 CO 3, DMF ; (b) 2M-HCl / H 2 O-MeOH. 第 2 節 α-アミノ 酸 側 鎖 を 有 する2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 の DPP-IV 阻 害 作 用 及 び 化 学 的 安 定 性 種 々のアミノ 酸 を P2 site に 導 入 し その DPP-IV 阻 害 活 性 を 測 定 した(Table 5) バリン 誘 導 体 23a と tert-ブチルグリシン 誘 導 体 23c は イソロイシン 誘 導 体 9g (IC50=0.6 nm)と 同 様 に それぞれ IC50 値 nm と 共 に 強 力 な DPP-IV 阻 害 活 性 を 示 した シクロヘキシルグリシン 誘 導 体 23i も IC50=1.1 nm と 活 性 を 保 持 していた 一 方 トレオニン 誘 導 体 23e, 23f, 23g の 阻 害 活 性 は それぞれ IC50 値 4.7,2.1,4.9 nm と 阻 害 活 性 は 低 下 した DPP-IV の X 線 結 晶 構 造 解 析 10) より 側 鎖 R 1 が 結 合 する DPP-IV の 部 位 は 脂 溶 性 が高 いと 推 定 された トレオニン 誘 導 体 側 鎖 の 酸 素 原 子 は タンパクとの 反 発 により 活 性 が 低 下 したと 説 明 できる 又 O-ベンジル 体 23f は O-メチル 体 23e O-tert -ブチル 体 23g よりも 強 い 活 性 を 示 し これはフェニル 基 の 脂 溶 性 部 位 に 対 する 親 和 19

24 Table 5. DPP-IV inhibitory activity and chemical stability of 9g, 23a-j R 1 R 2 N N H O CN HCl 23 remaining Comp R 1 R 2 IC 50 (nm) a) amount (%) b) F 9g H H a H H 23b H c H O 23d N H O Ph H e H O H f H O Ph H g H O H h H N CO 2 Bn H O 23i H j H Me >100 - a) DPP-IV inhibitory activity. b) Residual amount was measured after incubation at 37 oc for 6 h in ph 6.8 aqueous buffer solution. 性 により 活 性 が 回 復 したためと 考 えられる 長 鎖 を 有 するリジン 誘 導 体 23d グルタミン酸 誘 導 体 23h は それぞれ IC50=1.4 nm 0.7 nm と 強 い 活 性 を 示 した 高 活 性 の 9g のアミノ 基 にメチルを導 入 した N-メチルイソロイシン 誘 導 体 23j は IC50>100 nm と 活 性 が 消 失 した これは イソブチル 側 鎖 がポケットに 入 ってい る 状 態 でアミノ 基 にメチル 基 を 導 入 すると メチル 基 が DPP-IV と 反 発 するためと 考 えられる R 1 と R 2 が環 化 した 誘 導 体 の 中 では プロリン 誘 導 体 23k が IC50=0.8 nm テト ラヒドロイソキノリン 誘 導 体 23l-p が IC50= nm と 強 い 活 性 を 示 した(Table 6) 20

25 a) DPP-IV inhibitory activity. b) Residual amount was measured after incubation at 37 oc for 6 h in ph 6.8 aqueous buffer solution. 先 述 したようにこれら 2-シアノピロリジン 誘 導 体 を 開 発 する 場 合 化 学 的 安 定 性 は 重 要 な 要 素 となる リード 化 合 物 9g は 酸 性 溶 液 の 中 では 安 定 であるが 中 性 水 溶 液 中 では 残 存 率 が 低 下 した 中 性 水 溶 液 中 での 化 合 物 9g の 分 解 は 塩 基 性 窒 素 原 子 がシアノ 基 の 炭 素 原 子 を 求 核 攻 撃 し 環 状 アミジンを 形 成 することによる 窒 素 原 子 周 辺 に 立 体 的 に 混 み 合 った 環 境 を 構 築 することで このような 分 解 は 回 避 できると 考 えた tert-ブチルグリシン 誘 導 体 23c と O-tert-ブチルトレオニン 23g は ph 6.8 の 緩 衝 液 中 で6 時 間 37 に 加 温 した 後 の 残 存 率 がそれぞれ 93% 92%であり 70% 残 存 率 の 9g より 安 定 性 が 向 上 した これは α- 炭 素 周 辺 がより 混 み 合 っているた めと 考 えられる これとは 対 照 的 に α 位 の 隣 の 炭 素 が 枝 分 かれしておらずメチレンを 持 つ 23d や 23h は それぞれ 残 存 率 52% 41%と 低 い 値 であった プロリン 誘 導 体 23k とテト ラヒドロイソキノリン 誘 導 体 23l, 23m, 23o は 20% 以 下 の 低 い 残 存 率 であった こ れら 安 定 性 低 下 の 理 由 は これら 誘 導 体 がイソロイシンよりも 閉 環 反 応 しやすいコン フォメーションを 取 りやすいためと 考 えられる 21

26 第 3 節 α-アミノ 酸 側 鎖 を 有 する2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 の in vivo 薬 効 試 験 最 も 阻 害 活 性 が 強 く 且 つ 化 学 的 に 最 も 安 定 であった 23c を 用 いて in vivo 薬 効 試 験 を 検 討 した in vivo 薬 効 試 験 には 前 述 した Zucker fatty rat を 用 いた 23c は 1 mg/kg の 用 量 で 糖 負 荷 30 分 前 に 経 口 投 与 され 経 時 的 に 血 糖 値 インスリン 量 DPP-IV 活 性 を 測 定 した(Figure 9) 糖 負 荷 後 の 血 糖 値 は 溶 媒 処 理 群 (Vehicle)に 比 べて 23c 処 理 群 の 方 が 明 確 に 低 い 値 を 示 した (Figure 9A,B)DPP-IV 活 性 は 糖 負 荷 15 分 後 にはほぼ 完 全 に 阻 害 さ れ 更 に 2 時 間 経 っても 継 続 した(Figure 9D) これらの 結 果 は 血 漿 中 の DPP-IV 活 性 を 阻 害 することにより 化 合 物 23c が 高 血 糖 改 善 に 有 用 であることを 示 している 糖 負 荷 後 15 分 後 のインスリン 分 泌 は 23c 投 与 群 の 方 が 溶 媒 投 与 群 よりも 有 意 に 増 加 していた(Figure 9C) Plasma glucose (mg/dl) Plasma glucose AUC60min (mg min/dl) * ## Plasma insulin at 15 min after glucose loading (ng/ml) * DPP-IV activity (nmol) Effects of oral administration of 23c (1 mg/kg) on plasma glucose (A), plasma glucose AUC 60min (B), plasma insulin at 15 min afetr glucose loading (C) and plasma DPP-IV activity (D) during OGTT in Zucker fatty rats. Each point represents the mean + S.E. (n=6). * p<0.05 vs. Vehicle, Dunnett s test. ## p<0.01 vs. Vehicle, Student s t-test. 22

27 第 4 節 (2S,4S)-4-Fluoro-1-(3-methyl-L-valyl)pyrrolidine-2-carbonitrile の 立 体 異 性 体 の 合 成 DPP-IV 阻 害 作 用 及 び 立 体 構 造 確 認 合 成 した2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 は3 個 の 不 斉 中 心 を 持 ち 8 種 の 立 体 異 性 体 が 存 在 する それらの 活 性 の 差 異 に 興 味 が 持 たれたので 強 い 活 性 を 有 する 23c についてその 立 体 異 性 体 を 合 成 し 阻 害 活 性 を 測 定 することにした 4 種 類 のヒドロキシプロリン(L-トランス L-シス D-トランス D-シス)と L- 及 び D-N-Boc-tert-ブチルグリシンを 用 いて 7つの 立 体 異 性 体 24~30 を 合 成 し た(Table 7) 4-フルオロ 基 の 立 体 化 学 の 相 異 による SAR については Table 1 での 説 明 と 同 様 に (4R)-フルオロ 体 24 は IC50=246 nm と 大 幅 に 活 性 が 低 下 した 又 2-シア ノ 基 の 立 体 化 学 が 異 なる(2R)-シアノ 体 25 は IC50>300 nm 側 鎖 の 立 体 化 学 が 異 な る D-tert-ブチルグリシン 誘 導 体 27 は IC50=42 nm とやはり 大 幅 な 活 性 低 下 が 見 られた 更 にその 他 の 立 体 化 学 の 組 み 合 わせ 化 合 物 についても 同 様 に IC50>300 nm と 阻 害 活 性 が 見 られなかった 以 上 のことより (2S, 4S) 及 び L -tert-ブチルグリシンの 立 体 化 学 が 阻 害 の 高 活 性 に 必 要 であることが 確 認 された Table 7. DPP-IV inhibitory activities of stereoisomers of 23c F H 2 N N O CN Compd stereochemistry of t-bu Gly stereochemistry of the pyrrolidine IC50(nM) a) 23c (HCl) L ( 2S, 4S ) L ( 2S, 4R ) L ( 2R, 4S ) > L ( 2R, 4R ) > D (2S, 4S ) D (2S, 4R ) > D (2R, 4S ) > D (2R, 4R ) >300 a) DPP-IV inhibitory activity. 23

28 又 23c のフリー 塩 基 体 31 の 結 晶 が 得 られたのでこの X 線 結 晶 構 造 解 析 を 行 い シアノ 基 とフッ 素 原 子 がシス 配 置 であることとアミド 部 分 がトランス 配 置 でること を 確 認 した(Figure 10) 24

29 第 3 章 N- 置 換 グリシン 側 鎖 を 有 する2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 の 合 成 及 び DPP-IV 阻 害 作 用 第 1 節 N- 置 換 グリシン 側 鎖 を 有 する2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 の 合 成 第 1 章 で 2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 9g(Figure 11)が 4 位 に 置 換 基 の 無 い 誘 導 体 に 比 べて DPP-IV 阻 害 活 性 が 高 く ラットに 経 口 投 与 したとき の 血 漿 中 薬 物 濃 度 が 高 いことを 示 した しかしながら 9g は 化 学 的 安 定 性 の 改 善 が 望 まれたため 1 位 側 鎖 の 変 換 を 行 い 23c を 見 出 したことを 第 2 章 で 述 べた しかし 23c においても 化 学 的 安 定 性 の 更 なる 改 善 が 望 まれるため その 改 良 を 続 けた 2-シアノピロリジンを 有 する DPP-IV 阻 害 剤 としては 1 位 側 鎖 に 関 して2つの タイプが 知 られている 1つはα 位 に 側 鎖 を 有 するアミノ 酸 であり もう 1 つは N- 置 換 グリシンタイプであり NVP-DPP728 という 化 合 物 に 代 表 される NVP-DPP728 はノバルティス 社 により 開 発 され 2002 年 に 糖 尿 病 患 者 による 臨 床 試 験 において 初 め て 有 効 性 が 示 された DPP-IV 阻 害 剤 である 15) 著 者 は より 優 れた 薬 剤 を 見 出 すために NVP-DPP728 の 側 鎖 を2-シアノ-4 -フルオロピロリジンの 1 位 に 導 入 し 化 合 物 32a を 合 成 した 化 合 物 32a の 詳 細 については 後 述 するが 強 い DPP-IV 阻 害 活 性 を 示 すと 共 に ph 6.8 の 37 水 溶 液 中 の 安 定 性 試 験 で 6 時 間 での 残 存 率 が 9g の 70%を 上 回 る 86%を 示 した そこで 更 に N- 置 換 グリシンタイプの 誘 導 体 を 合 成 した 第 2 章 で 述 べたように α-アミノ 酸 の 変 換 でより 嵩 高 い tert-ブチルグリシンを 導 入 することで 化 学 的 安 定 性 が 改 善 したため 嵩 高 さを 考 慮 して 側 鎖 の 変 換 を 行 った 合 成 に 関 しては N- 置 換 グリシン 誘 導 体 を 合 成 するためにブロモアセチル 体 34 又 はクロロアセチル 体 35 を 中 間 体 として 選 んだ(Scheme 7) アミン 塩 酸 塩 16 6) は 2-エチルヘキサン 酸 カリウムを 塩 基 として 用 いブロモアセチルブロミドと 反 応 を 25

30 行 いブロモアセチル 体 33 へ 導 いた そして 33 を 無 水 トリフルオロ 酢 酸 で 脱 水 して シアノ 体 34 へ 導 いた この 34 は 種 々の 1 級 アミンと 反 応 を 行 い 32a~32d, 36f~ 36k, 36m~36v を 得 た(Method A) この 時 アミンの 当 量 が 少 ないとアミンがジア ルキル 化 されたと 思 われる 副 生 成 物 が 増 加 したため これを 防 ぐためにアミンを2~ 5 当 量 用 いた また 別 ルートとして アミン 塩 酸 塩 16 を DMF 中 でクロロアセチルクロリドと トリエチルアミンを 用 いて 反 応 を 行 い 引 き 続 き one pot で 塩 化 シアヌル-DMF を 用 いて 脱 水 反 応 を 行 い クロロアセチル 体 35 を 合 成 した クロロアセチル 体 35 と1 級 アミンとの 反 応 は 室 温 では 進 行 が 遅 いため 反 応 を 促 進 するために KI を 加 えて 反 応 を 行 い 36a~36e, 36l を 得 た(Method B) Reagents: (a) potassium 2-ethylhexanoate, toluene / BrCH 2 COBr, THF, (b) (CF 3 CO) 2 O, THF, (c) R-NH 2, THF (Method A), (d) (i) ClCH 2 COCl, Et 3 N, DMF, (ii) cyanuric chloride, (e) R-NH 2, KI, MeOH, THF (Method B), (f) BocNHCH 2 C(CH 3 ) 2 NH 2 37, KI, MeOH, (g) 4M HCl / AcOEt, (h) acylation (method C), sulfonilation (method D), or reductive amination (method E), (i) R a R b NCH 2 C(CH 3 ) 2 NH 2, KI, MeOH (method F), (j) methylation (method G) or acylation (method H), (k) dialkylation (method I). 26

31 次 いで 後 述 する2-メチル-2-アミノプロパノールを 導 入 した 36k が 活 性 及 び 化 学 的 安 定 性 が 良 好 であったため 1,1-ジメチルエチレンジアミン 側 鎖 を 導 入 した 36k 類 似 化 合 物 の 合 成 を 展 開 した 中 間 体 ジアミン 体 39 は Boc で 保 護 したジアミ ン 誘 導 体 37 とクロロアセチル 体 35 を 反 応 させ 38 を 得 て これを 塩 酸 で 脱 Boc して 合 成 した ジアミン 体 39 は それぞれアシル 化 (method C) スルホニル 化 (method D) 還 元 的 アミノ 化 (method E)により 40 へ 導 いた アシル 化 反 応 としては 酸 クロ リドを 用 いる 方 法 やカルボン 酸 と 縮 合 剤 を 用 いる 方 法 で 行 い 40a~40h を 合 成 した スルホニル 化 反 応 は スルホニルクロリドとトリエチルアミンを 用 いる 方 法 で 40j を 合 成 した 還 元 的 アミノ 化 は アルデヒドとトリアセトキシ 水 素 化 ホウ 素 ナトリウム を 用 いて 行 い 40k と 40l を 合 成 した ジアミン 39 にはアミノ 基 が 2 ヶ 所 あるが 2 級 のアミンは 立 体 的 に 混 んでいるため アシル 化 スルホニル 化 還 元 的 アミノ 化 は 1 級 のアミノ 基 が 選 択 的 に 反 応 した また N- 置 換 基 である Ra が 導 入 されているアミンとクロロアセチル 体 35 との 縮 合 を 用 いることもでき この 方 法 で 40i を 合 成 した(method F) フェニルスルホンアミド 体 40j は DEAD-Ph 3 P-MeOH により N-メチル 化 をして 41a に 導 いた(method G) N-イソブチル 体 40k や N-(4-シアノベンジル) 体 40l とベンゾイルクロリドを 反 応 させベンゾイル 基 を 導 入 し 41c, 41d を 合 成 した(method H) この 場 合 は 2 級 のアミノ 基 が 2 ヶ 所 あるが ジメチル 基 の 隣 のアミノ 基 は 立 体 的 に 混 んでいるため よりすいているR a が 付 いているアミノ 基 が 選 択 的 に 反 応 した また N,N-ジエチル 体 41b は アセトアルデヒドと 39 を 用 いた 還 元 的 アミノ 化 に より 合 成 した (method I) 第 2 節 N- 置 換 グリシン 側 鎖 を 有 する2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 の DPP-IV 阻 害 作 用 2-シアノピロリジンの4 位 にフッ 素 を 導 入 する 事 で 阻 害 活 性 が 増 強 され 1 位 の 側 鎖 にα-アミノ 酸 を 有 する 9g 及 び 23c が ラットを 用 いた OGTT 試 験 にて 血 糖 上 昇 抑 制 作 用 を 示 すことを 前 述 した 一 方 N- 置 換 グリシン 誘 導 体 に 関 しては 臨 床 で 高 血 糖 改 善 に 有 効 である 事 が 示 され ていた NVP-DPP728( 文 献 記 載 の 活 性 値 IC50=7.0 nm) 15),16) の 側 鎖 を2-シアノ 27

32 -4-フルオロピロリジンに 導 入 した 32a を 合 成 したところ 32a は 阻 害 活 性 が NVP-DPP728 よりも 数 倍 増 強 し IC50=1.1 nm を 示 した(Table 8) 又 化 学 的 安 定 性 に 関 しては ph 6.8 の 37 水 溶 液 中 の 安 定 性 試 験 で 6 時 間 での 残 存 率 が 32a は 86%であり 93%の 23c より 劣 るものの 70%の 9g よりは 安 定 であ った 次 いで 32a の 活 性 向 上 を 目 的 にピリジン 環 上 のシアノ 基 を 変 換 し 無 置 換 体 32b クロル 体 32c カルバモイル 体 32d を 合 成 したが それぞれ IC50= nm と 活 性 はシアノ 体 32a より 低 下 し 安 定 性 についても 改 善 は 見 られなかった(Table 8) a) DPP-IV inhibitory activity. b) Residual amount was measured after incubation at 37 oc for 6 h in ph 6.8 aqueous buffer solution. c) Dihydrochloride salt of 32a was used in the chemical stability test instead of 32a. この 様 に NVP-DPP728 の 側 鎖 をそのまま 導 入 しただけでは 化 学 的 安 定 性 を 改 善 できなかったが 9g よりは 安 定 であったため 安 定 性 を 更 に 改 善 できると 考 え N- 置 換 グリシン 誘 導 体 で 側 鎖 変 換 を 検 討 した まずは 32a 同 様 芳 香 環 を 有 する 側 鎖 を 検 討 した 又 より 嵩 高 さを 増 すために アミノ 基 の 隣 のメチレンにジメチル 基 を 導 入 し ピリジン 誘 導 体 36a(IC50=22 nm) フラン 誘 導 体 36b(IC50=8.6 nm) チオフェン 誘 導 体 36c(IC50=12 nm) ベンゾ フラン 誘 導 体 36d(IC50=88 nm) スチレン 誘 導 体 36e(IC50=16 nm)を 合 成 した が 32a より 活 性 の 高 い 化 合 物 は 得 られなかった(Table 9) 28

33 a) DPP-IV inhibitory activity. b) Residual amount was measured after incubation at 37 oc for 6 h in ph 6.8 aqueous buffer solution. 次 いで 低 級 アルキル 基 である tert-ブチル 体 36g(IC50=2.9 nm) イソプロピ ル 体 36h(IC50=7.8 nm)は 32a には 劣 るものの 比 較 的 強 い 活 性 を 示 すことが 分 かった アルコキシ 基 を 有 する 36i と 36j は それぞれ IC50=8.7 nm, 13 nm の 活 性 であった が 水 酸 基 を 有 する 36k は IC50=4.6 nm と 良 好 な 活 性 であった しかし 嵩 高 さが 増 したアセチレン 誘 導 体 36l では IC50>316 nm と 活 性 が 大 幅 に 低 下 した 29

34 更 に3 員 環 から8 員 環 の 環 状 アルキル 基 の 導 入 を 行 い 活 性 の 強 いシクロブチル 体 36n(IC50=3.1 nm) シクロペンタン 体 36o(IC50=2.6 nm) シクロヘプタン 体 36q (IC50=3.3 nm)を 得 た 又 シクロペンタン 体 にヒドロキシメチル 基 を 導 入 した 36p(IC50=3.3 nm)は 36o とほぼ 同 様 の 活 性 を 示 した しかし 3 員 環 のシクロ プロピル 体 36m(IC50=33 nm)は 側 鎖 が 小 さすぎたためか 活 性 が 低 下 した アダ マンチル 誘 導 体 は 無 置 換 36r(IC50=4.1 nm) 及 び 36s(IC50=3.1 nm) 水 酸 化 体 36t(IC50=3.1 nm) 及 び 36v(IC50=5.3 nm) メトキシ 体 36u(IC50=8.3 nm)と 何 れも 良 好 な 活 性 を 示 し 置 換 基 の 有 無 種 類 による 活 性 への 影 響 は 小 さいものだっ た また アダマンチル 基 の 結 合 位 置 については 架 橋 頭 部 位 で 結 合 した 36r (IC50=4.1 nm)でも メチレン 部 位 で 結 合 した 36s(IC50=3.1 nm)でも 活 性 に 大 きな 差 はなかった これらの 活 性 が 良 好 な 化 合 物 について 化 学 的 安 定 性 を 調 べた(Table 9) 全 般 に α-アミノ 酸 側 鎖 タイプよりも N- 置 換 グリシン 側 鎖 タイプの 方 が 押 し 並 べて 安 定 性 は 良 好 で 特 にアミノ 基 周 辺 が 嵩 高 くなっている 化 合 物 は ph 6.8 水 溶 液 中 での 37 における 24 時 間 後 の 残 存 率 は 95% 以 上 であった このように DPP-IV 阻 害 活 性 及 び 化 学 的 安 定 性 が 良 好 な 化 合 物 が 複 数 得 られ その 1 つに 36k がある 化 合 物 36k については DPP-IV への 結 合 様 式 をそのX 線 結 晶 構 10) 造 情 報 を 用 いて 予 測 した(Figure 12) 2-ヒドロキシ-1,1-ジメチルエチル 基 の 側 鎖 は His126 Ser209 Phe357 Arg358 からなるポケットの 形 状 に 良 く 収 まっており これが 高 親 和 性 に 貢 献 していると 考 えられる 又 シアノピロリジン 骨 格 を 有 する 阻 害 剤 のシアノ 基 が Ser630 と 共 有 結 合 している 結 晶 のX 線 構 造 が 得 られ ていることより 36k においても 同 様 に 共 有 結 合 の 形 を 推 定 結 合 様 式 とした 30

35 Figure 12. Predicted binding model of compound 36k in DPP-IV active site. Phe357 Tyr666 Glu206 Arg358 Ser630 Ser209 His126 Glu205 Arg125 His740 化 合 物 36k は 比 較 的 活 性 も 良 好 で 化 学 的 安 定 性 も 良 好 であったため 更 に 誘 導 体 展 開 を 考 え デザインを 行 った 化 合 物 36k の 水 酸 基 をメチルエーテルとした 化 合 物 36j は 活 性 が 1/3 に 減 弱 しており 水 酸 基 のプロトンドナーとしての 作 用 が 示 唆 され た そこで 水 酸 基 をアミド NH に 置 き 換 えたエチレンジン 側 鎖 を 導 入 した 40a,b を デザインし 合 成 したところ ベンゾイル 体 40b(IC50=4.5 nm)では 活 性 を 保 持 する ことができた 加 えて ph 6.8 の 緩 衝 液 中 で 24 時 間 37 に 加 温 した 後 の 残 存 率 が 98% 以 上 と 極 めて 安 定 であった(Table 10) 次 いで アシル 部 分 を 変 換 し 40b と 同 等 の 活 性 を 有 するチオフェン 誘 導 体 40c (IC50=5.4 nm)を 得 た 更 に 縮 環 を 導 入 したところ ベンゾジヒドロフラン 体 40d (IC50=2.9 nm) ベンゾトリアゾール 体 40f(IC50=1.5 nm)で 活 性 が 向 上 した しかし アリファティックなアシル 基 を 導 入 した tert-ブチル 体 40g と1-メチルシ クロヘキシル 体 40h は それぞれ IC50= nm と 活 性 向 上 は 認 められなかった 又 ビス(4-クロロフェニル)メチル 体 40i(IC50=109 nm)は 大 幅 な 活 性 低 下 が 見 られたが,これは 立 体 的 に 大 き 過 ぎることが 原 因 と 考 察 した フェニルスルホンアミド 体 40j は ベンズアミド 体 40b に 比 べ 約 17 分 の1の 活 性 (IC50=75 nm)であった 活 性 低 下 の 原 因 は 特 定 できなかったが スルホンアミド の 酸 性 プロトンを 無 くした N-メチル 体 41a でも IC50=31 nm であったことから 40j の 活 性 が 低 い 理 由 は 酸 性 プロトンではないと 考 えられる 次 いで 窒 素 原 子 へアルキル 基 を 導 入 した N-イソアミル 体 40k は IC50>316 nm N,N-ジエチル 体 41b は IC50=252 nm と 活 性 は 低 かった これはアミノ 基 の 塩 基 性 が 活 性 を 減 弱 させているものと 考 えられる 31

36 a) DPP-IV inhibitory activity. b) Residual amount was measured after incubation at 37 oc for 24 h in ph 6.8 aqueous buffer solution. 中 程 度 の 活 性 を 示 した N-(4-シアノベンジル) 体 40l(IC50=39 nm)は シアノ フェニル 基 が DPP-IV と 親 和 性 を 持 つことより N-イソアミル 体 40k より 活 性 が 向 上 したと 考 えられる N-イソアミル 体 40k 及 び N-(4-シアノベンジル) 体 40l をベンゾイル 化 して 合 成 した N,N-ジアルキルベンズアミド 体 41c 41d は それぞれ IC50= nm と 活 性 が 改 善 された これは ベンズアミド 体 40b の 窒 素 原 子 にイソアミル 基 や 4-32

37 シアノベンジル 基 を 導 入 しても 活 性 はほとんど 変 わらなかったと 言 い 換 えることも できる このように 種 々 誘 導 体 を 合 成 し in vitro 活 性 を 測 定 したが 32a を 上 回 る 活 性 を 有 する 化 合 物 は 得 られなかった しかし 40f(IC50=1.5 nm)をはじめ 阻 害 活 性 が 良 好 で 且 つ 化 学 的 に 安 定 な 化 合 物 を 複 数 得 ることができた 第 3 節 (2S,4S)-4-Fluoro-1-[N-(2-hydroxy-1,1-dimethylethyl)glycyl]pyrrolidine-2- carbonitrile 36k の 体 内 動 態 及 び in vivo 薬 効 試 験 複 数 得 られた 活 性 及 び 安 定 性 が 良 好 な 化 合 物 については ラット 体 内 動 態 を 調 べて 開 発 候 補 化 合 物 を 絞 込 んだ 代 表 的 化 合 物 のラット 体 内 動 態 を Table 11 に 示 す 化 合 物 40a は Table 10 に 示 したエチレンジアミン 側 鎖 誘 導 体 の 代 表 として 体 内 動 態 を 記 載 したが これを 含 めエチレンジアミン 側 鎖 誘 導 体 の 中 では 薬 物 血 中 濃 度 の 持 続 性 が 36k を 超 えるものは 得 られなかった N- 置 換 グリシン 誘 導 体 の 中 では 36k に 最 も 薬 物 血 中 濃 度 の 持 続 性 が 認 められた 36k の 2 時 間 後 或 いは 6 時 間 後 の 血 中 濃 度 は 9g 32a の 血 中 濃 度 よりも 明 らかに 高 い 値 であった このように 36k は 良 好 な 血 中 濃 度 の 持 続 性 を 有 する 薬 剤 であること が 分 かった 36k の 化 学 的 安 定 性 は 40a には 劣 るものの 9g 32a よりは 大 幅 に 改 善 しており 開 発 するに 十 分 な 安 定 性 を 示 した a) HPLC determination after 6 h of incubation at 37 o C in ph 6.8 aqueous buffer solution. b) LC-MS determination after oral administration at a dose of 1 mg/kg to Wistar rats. c) Dihydrochloride salt of 32a was used in the chemical stability test instead of 32a. d) HPLC determination after 24 h of incubation at 37 o C in ph 6.8 aqueous buffer solution. e) 化 合 物 40a は4 時 間 後 に 1 ng/ml 以 下 の 薬 物 濃 度 であった 33

38 化 合 物 36kの 血 糖 低 下 作 用 を 肥 満 で 耐 糖 能 異 常 を 示 すモデル 動 物 である Zucker fatty rat を 用 いて 調 べた 0.1 mg/kg 及 び 0.3 mg/kg の 用 量 で 化 合 物 36k を 経 口 投 与 すると 糖 負 荷 後 30 分 後 には 血 糖 上 昇 の 抑 制 が 見 られた(Figure 13A) そして 0.3 mg/kg では 有 意 に 高 血 糖 を 改 善 した(Figure 13B) 何 れの 投 与 量 においても 糖 負 荷 後 15 分 後 には 血 漿 中 の DPP-IV 活 性 はほぼ 完 全 に 阻 害 された そして これは 120 分 後 まで 阻 害 されていた(Figure 13D) 又 イン スリン 分 泌 は 0.1 mg/kg 及 び 0.3 mg/kg の 両 用 量 で 促 進 された(Figure 13C) このように 36k は 0.1 mg/kg という 低 容 量 でもラットで 薬 効 を 示 しており ヒト においても 強 い 効 果 が 期 待 された Plasma glucose (mg/dl) Plasma glucose AUC60min (mg min/dl) Vehicle 0.1 mg/kg 0.3 mg/kg Lean Delta plasma insulin (ng/ml) DPP-IV activity (nmol) Effects of oral administration of 36k (0.1 or 0.3 mg/kg) on plasma glucose (A), plasma glucose AUC 60min (B), plasma insulin (C) and plasma DPP-IV activity (D) during OGTT in Zucker fatty rats. Each point represents the mean + S.E. (n=6). * p<0.05 vs. Vehicle, Dunnett s test. ## p<0.01 vs. Vehicle, Student s t-test. 著 者 は 2-シアノ-4-フルオロピロリジン 誘 導 体 の 1 位 側 鎖 に 種 々の N- 置 換 グ リシンを 導 入 した 化 合 物 をデザイン 合 成 し 化 学 的 安 定 性 や 経 口 投 与 時 の 持 続 性 が 34

39 改 善 され 強 力 な 血 糖 低 下 作 用 を 示 す 36k を 見 出 した 36k は 塩 検 討 によりベンゼン スルホン 酸 塩 を 選 定 し これを 開 発 化 合 物 TS-021 とした(Figure 14) Figure 14 F HO N H O SO 3 H N CN TS

40 第 4 節 TS-021の 合 成 TS-021 が 開 発 候 補 化 合 物 に 選 ばれたが 初 期 合 成 方 法 のままでは 評 価 用 検 体 の 供 給 が 困 難 であった そこで スケールアップ 合 成 のために 中 間 体 16 以 降 について 中 間 体 試 薬 条 件 等 の 改 良 を 検 討 し その 結 果 検 体 供 給 が 可 能 になった スクリーニ ングの 検 体 合 成 の 際 は ブロモアセチル 中 間 体 34 を 用 いていたがスケールアップに はより 化 学 的 に 安 定 なクロロアセチル 中 間 体 35 を 用 いることにした Scheme 8 F F a HN N HCl Cl CONH 2 O CN c b HO N H O 42 F N F CN HO N H SO 3 H O N CN TS-021 Reagents: (a) chloroacetyl chloride, triethylamine / DMF; then cyanuric chloride; (b) 2-amino-2-methyl-1-propanol / iproh; (c) benzenesulfonic acid / MeOH-IPE. ブロモアセチル 中 間 体 を 用 いた 合 成 ルートでは アシル 化 反 応 とカルバモイル 基 の 脱 水 反 応 を 別 々の 工 程 として 行 っていたが アシル 体 33 の 抽 出 が 容 易 ではなかった ためこの2 工 程 を1ポットで 行 う 検 討 をした 溶 媒 としては どちらの 反 応 でも 使 用 可 能 な DMF を 用 いた 最 初 の 工 程 のアシル 化 反 応 はクロロアセチルクロリドとトリ エチルアミンを 用 いることで tlc 上 定 量 的 に 進 行 した 2 工 程 目 の 脱 水 反 応 は 簡 便 な 脱 水 試 薬 である 塩 化 シアヌルを 用 いた 後 処 理 を 水 で 行 い 析 出 した 結 晶 を 濾 取 することで 簡 便 に 且 つ 86%の 高 収 率 で 35 を 得 ることができた 又 アミノ 化 についても 試 薬 当 量 溶 媒 濃 度 を 検 討 した 結 果 IPA を 溶 媒 として 用 いることで 反 応 系 中 から 目 的 物 が 結 晶 として 析 出 し カラム 精 製 を 行 うことなく 42 を 単 離 することができた フリー 体 42 は メタノール 中 でベンゼンスルホン 酸 と 塩 形 成 と 結 晶 化 を 行 い IPE を 添 加 することで 収 量 を 向 上 させた このような 検 討 によ り 16 より 総 収 率 61%で カラム 精 製 を 用 いることなく TS-021 を 合 成 することがで きた このような 合 成 方 法 改 良 により 高 純 度 の TS-021 をkgオーダーで 製 造 できるよ うになった 36

41 総 論 糖 尿 病 の 予 防 や 治 療 において 運 動 食 事 薬 剤 治 療 が 重 要 な 役 割 を 果 たしている ことは 広 く 知 られているが 予 防 や 治 療 方 法 が 分 かっているにも 関 わらず 糖 尿 病 患 者 は 増 加 しているのが 現 状 である 糖 尿 病 の 増 加 を 是 正 する1つの 方 法 は これまでと は 異 なるメカニズムの 糖 尿 病 治 療 薬 を 開 発 し 患 者 に 提 供 することである そこで 著 者 は 新 規 メカニズムの 糖 尿 病 治 療 薬 として DPP-IV 阻 害 剤 に 興 味 を 持 ち この 創 薬 研 究 を 開 始 した 既 存 の2-シアノピロリジン 骨 格 のピロリジン 環 部 分 に 着 目 し 置 換 基 導 入 を 検 討 した 特 異 な 性 質 を 持 つフッ 素 原 子 の 導 入 を 行 うと 一 方 の 立 体 だけが 強 い 活 性 を 示 し 無 置 換 体 よりも 活 性 が 向 上 することが 分 かった 又 他 の 置 換 基 に 関 してはすべて 無 置 換 体 より 活 性 が 低 下 することも 分 かった フッ 素 体 9g については ラットに 経 口 投 与 した 際 に 無 置 換 体 よりも 大 幅 に 血 中 濃 度 が 上 昇 するこ とを 見 出 した しかし フッ 素 体 9g は 化 学 的 安 定 性 に 問 題 があり 中 性 水 溶 液 中 では 環 化 による 分 解 が 生 じることが 分 かった そこで 9g のイソロイシン 側 鎖 を 他 のα-アミノ 酸 に 変 換 して 安 定 性 の 改 善 を 図 った 予 想 されたように 嵩 高 い 側 鎖 を 導 入 した 化 合 物 に 安 定 性 の 向 上 が 見 られ tert-ブチルグリシン 側 鎖 を 有 する 23c では 中 性 水 溶 液 中 の 安 定 性 を 大 幅 に 改 善 することができた また 23c の 立 体 異 性 体 について 調 べ ピ ロリジン 環 部 分 が(2S,4S)の 立 体 側 鎖 部 分 が L-アミノ 酸 の 立 体 が 必 須 であること を 確 認 した そして 安 定 性 を 含 め 薬 剤 としてより 良 い 性 質 の 薬 剤 を 得 るべく 更 なる 誘 導 体 展 開 を 図 った 側 鎖 として N- 置 換 グリシンを 導 入 し DPP-IV 阻 害 活 性 化 学 的 安 定 性 更 には 体 内 動 態 に 優 れた 化 合 物 として 36k を 見 出 した 又 これら 誘 導 体 検 討 の 結 果 Figure 15 に 示 すようにシアノピロリジン 誘 導 体 の 構 造 活 性 相 関 を 把 握 することができた 37

42 この 36k は 塩 検 討 の 結 果 得 られたベンゼンスルホン 酸 塩 TS-021 として 臨 床 試 験 を 開 始 した TS-021 は 強 力 で 且 つ 1 日 1 回 の 投 与 で 有 効 な 持 続 性 を 有 する DPP-IV 阻 害 剤 として 期 待 される 38

43 謝 辞 本 論 文 をまとめるにあたり 御 指 導 御 高 配 を 賜 りました 千 葉 大 学 大 学 院 薬 学 研 究 院 西 田 篤 司 教 授 に 衷 心 より 感 謝 の 意 を 表 します 本 研 究 の 機 会 を 与 えて 頂 きました 大 正 製 薬 株 式 会 社 副 会 長 大 平 明 氏 同 情 報 シス テム 部 顧 問 北 村 一 泰 博 士 同 常 任 監 査 役 森 本 繁 夫 博 士 に 厚 く 御 礼 申 し 上 げます また 本 研 究 の 実 施 にあたり 終 始 ご 指 導 と 御 教 示 を 賜 りました 大 正 製 薬 株 式 会 社 執 行 役 員 亀 尾 一 弥 博 士 同 開 発 企 画 部 CPL 中 里 篤 朗 博 士 ならびに 同 創 薬 化 学 第 2 研 究 室 長 太 田 知 己 博 士 に 深 く 感 謝 いたします 実 験 に 協 力 していただいた 大 正 製 薬 株 式 会 社 創 薬 化 学 第 2 研 究 室 主 任 研 究 員 平 舘 彰 氏 同 主 任 研 究 員 補 高 橋 正 人 博 士 同 研 究 員 三 上 綾 子 氏 薬 理 実 験 を 実 施 し ていただいた 大 正 製 薬 株 式 会 社 創 薬 薬 理 第 2 研 究 室 次 席 研 究 員 山 本 浩 二 博 士 同 主 任 研 究 員 補 宗 友 栄 二 氏 同 主 任 研 究 員 補 長 南 寿 実 氏 同 主 任 研 究 員 補 斉 藤 雅 子 氏 大 正 製 薬 株 式 会 社 開 発 薬 理 研 究 室 主 任 研 究 員 北 野 清 和 氏 体 内 動 態 試 験 をして いただいた 大 正 製 薬 株 式 会 試 験 保 証 室 主 任 研 究 員 斉 藤 秀 隆 氏 同 品 質 試 験 センター 部 長 鈴 木 章 夫 博 士 分 子 シミュレーションをしていただいた 大 正 製 薬 株 式 会 社 研 究 システム 部 主 任 研 究 員 高 岡 雄 司 博 士 に 深 く 感 謝 いたします 物 性 試 験 をしていただいた 大 正 製 薬 株 式 会 社 製 剤 研 究 室 主 任 研 究 員 補 国 府 田 歩 氏 同 主 任 研 究 員 補 高 橋 哲 子 氏 X 線 結 晶 解 析 をしていただいた 大 正 製 薬 株 式 会 社 資 源 化 学 研 究 室 次 席 研 究 員 松 本 慶 太 博 士 同 主 任 研 究 員 補 岡 田 敦 司 博 士 に 心 から 感 謝 いたします また 数 々のご 助 言 をいただきました 大 正 製 薬 株 式 会 社 製 剤 研 究 室 長 伊 藤 修 正 博 士 同 知 的 財 産 部 長 佐 藤 正 和 博 士 同 薬 理 機 能 研 究 所 長 兼 研 究 企 画 部 長 宮 田 則 之 博 士 に 御 礼 を 申 し 上 げます 39

44 実 験 の 部 1 H 核 磁 気 共 鳴 スペクトルは Varian VXR-300 又 は JEOL GX500 で 測 定 し 化 学 シフト 値 は tetramethylsilane を 内 部 標 準 として ppm(δ)で 記 載 した (NMR 表 記 の 中 で s は singlet d は doublet t は triplet q は quartet m は multiplet br は broad peak を 示 す) 13 C 核 磁 気 共 鳴 ス ペクトルは JEOL GX500 で 19 F 核 磁 気 共 鳴 スペクトルは Varian VXR-300 で 測 定 した 質 量 ス ペクトル(MS)は Shimadzu/Kratos HV-300 で 測 定 した 融 点 は Buchi 535 融 点 測 定 器 で( 温 度 は 未 補 正 ) 赤 外 吸 収 スペクトル(IR)は Perkin Elmer 1760 spectrometer で 測 定 した 元 素 分 析 は Perkin Elmer 240C を 用 いて 炭 素 水 素 窒 素 の 含 有 率 を 測 定 し ハロゲンと 硫 黄 につ いては Yokokawa-Denki IC7000P を 用 いて 測 定 した 薄 層 クロマトグラフィーは silica gel 60 F254 (Merck)で シリカゲルカラムクロマトグラフィーは 100~200-mesh silica gel C-200 (Wako Pure Chemical)で 行 った N-アシルプロリン 誘 導 体 は 溶 液 中 でシス 及 びトランスのロータマー 混 合 物 として 存 在 することが 知 られている 16) 化 合 物 によっては NMR でコンホーマーが 見 られ ピロリジン 環 の 2 位 及 び 4 位 の 水 素 は NMR のピークが 分 かれて 観 測 される 実 験 項 の NMR データで は マイナーコンホーマーのピークは 明 確 に 観 測 されるものについて 記 載 した 第 1 章 に 関 する 実 験 tert-butyl (2S,4S)-2-(aminocarbonyl)-4-fluoropyrrolidine-1-carboxylate (3g) (4S)-1-(tert-butoxycarbonyl)-4-fluoro-L-proline 2g 12) (4.5 g, 19.3 mmol)をアセトニトリル(50 ml) に 溶 か し 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (3.6 g, 23.5 mmol) と 1-(3,3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (4.5 g, 23.5 mmol)を 加 えて 氷 冷 し た 徐 々に 昇 温 し 室 温 にて 一 晩 攪 拌 した 反 応 液 を 再 び 氷 冷 し 25% アンモニア 水 (5 ml) を 加 え 氷 冷 で 30 分 間 室 温 で 30 分 間 攪 拌 した アセトニトリル(50 ml)を 反 応 液 に 加 え 不 溶 物 を 濾 去 した 濾 液 を 減 圧 にて 濃 縮 し 残 渣 をシリカゲルカラムクロマトグラフィー( 溶 出 溶 媒 ;hexane : EtOAc = 4:1-1:5)で 精 製 し 濃 縮 後 ヘキサンを 加 えることで 無 色 粉 末 の 目 的 物 (4.2 g, 94%)を 得 た mp o C. 1 H NMR (300 MHz, DMSO - d 6 ) δ 7.21, 7.15 and 6.95 (2H, each br, CONH 2 ), 5.21 (1H, br d, J = 54.0 Hz, H-4), 4.13 (1H, d, J = 9.6 Hz, H-2), (2H, m, H-5), (1H, m, H-3), (1H, m, H-3), 1.41 and 1.36 (9H, each s, (CH 3 ) 3 CO). MS(ESI pos.) m/z 255 ([M+Na] + ). Anal. calcd for C 10 H 17 FN 2 O 3 : C, 51.71; H, 7.38; F, 8.18; N, Found: C, 51.72; H, 7.46; F, 8.14; N, IR(KBr) 3474, 3283, 3218, 3162, 2990, 1696, 1649, 1397, 1378, 1360, 1223, 1167, 1119, 1072, 848 cm -1. [α] 22 D (c=0.5, MeOH). 40

45 (4S)-4-Fluoro-L-prolinamide hydrochloride (4g) 4M HCl / ジオキサン (45 ml)に 3g (4.2 g, 18.1 mmol)を 懸 濁 し 室 温 で 2 時 間 攪 拌 した 後 溶 媒 を 減 圧 にて 留 去 した 残 渣 にトルエン(50 ml)を 加 え 再 度 溶 媒 を 減 圧 にて 留 去 した こ の 操 作 を 3 回 繰 り 返 し 目 的 物 (3.1 g, 100%)を 無 色 粉 末 として 得 た この 中 間 体 は これ 以 上 の 精 製 を 行 わずに 次 の 反 応 に 用 いた mp o C ( decomp. ). 1 H NMR (300 MHz, DMSO - d 6 ) δ 9.72 (2H, br s, H 2 N + ), 8.10 (1H, br s, CONH 2 ), 7.70 (1H, br s, CONH 2 ), 5.38 (1H, dt like, J = 52.5, 3.6 Hz, H-4), 4.31 (1H, dd, J = 10.4, 3.7 Hz, H-2), 3.56 (1H, ddd, J = 19.9, 13.4, 1.7 Hz, H-5), 3.39 (1H, ddd, J = 36.5, 13.4, 3.6 Hz, H-5), (1H, m, H-3), (1H, m, H-3). MS(ESI pos.) m/z 155 ([M+Na] + ). Anal. calcd for C 5 H 9 FN 2 O HCl: C, 35.62; H, 5.98; Cl, 21.03; F, 11.27; N, Found: C, 35.57; H, 5.95; Cl, 21.03; F, 11.26; N, IR(KBr) 3319, 3174, 3063, 2902, 2778, 2731, 1707, 1626, 1583, 1399, 1340, 1322, 1207, 1162, 1055, 1026, 965, 863, 635 cm -1. [α] 26 D (c=0.5, MeOH). N-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-isoleucyl-(4S)-4-fluoro-L-prolinamide (5g) N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-isoleucine (5.1 g, 14.4 mmol)を THF (40 ml) と DMF (10 ml)の 混 合 溶 媒 に 溶 解 し 氷 冷 下 で 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (2.6 g, 17.0 mmol) 1-(3,3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (3.3 g, 17.2 mmol) 及 び N,N-diisopropylethylamine (2.5 ml)を 加 え 徐 々に 昇 温 し 室 温 で 一 晩 攪 拌 した 溶 媒 を 減 圧 で 留 去 し 残 渣 に 水 を 加 えた 生 成 した 粉 末 を 濾 取 し シリカゲルカラムクロマトグラフィー( 溶 出 溶 媒 ;hexane : EtOAc = 4:1-1:4)で 精 製 して 目 的 物 (6.9 g, quant)を 淡 黄 色 アモルファス 物 質 として 得 た 1 H NMR (300MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.89 (2H, d, J = 7.5 Hz, aromatic H), 7.72 (2H, d, J = 7.5 Hz, aromatic H), 7.41 (2H, t like, J = 7.5 Hz, aromatic H), 7.32 (2H, t like, J = 7.5 Hz, aromatic H), 7.05 (1H, br s, NH), 6.91 (1H, br s, NH), 5.31 (1H, br d, J = 52.5 Hz, H-4), 4.45 (1H, dd, J = 8.8, 2.2 Hz, H-2), (5H, m), (1H, dd, J = 25.6, 12.6 Hz, H-5), (2H, m, H-3), (1H, m), (1H, m), (1H, m), 0.95 (3H, d, J = 6.7 Hz, Me), 0.84 (3H, dd, J = 7.5, 7.3 Hz, Me). 9H-Fluoren-9-ylmethyl ((1S,2S)-1-{[(2S,4S)-2-cyano-4-fluoropyrrolidin-1-yl]carbonyl}-2-methylbutyl)carbamate (6g) THF (70 ml)に 5g (6.9 g, 14.8 mmol)を 溶 解 し 氷 冷 にて trifluoroacetic anhydride (4.0 ml,

46 mmol)を 加 えた 氷 冷 にて 1.5 時 間 攪 拌 した 後 反 応 液 を 減 圧 で 濃 縮 し 残 渣 をシリカゲルカ ラムクロマトグラフィー( 溶 出 溶 媒 ;hexane : EtOAc = 8:1-3:2)で 精 製 して 目 的 物 (6.2 g, 97%) を 淡 黄 色 アモルファス 物 質 として 得 た 1 H NMR (300MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.91 (1H, d, J = 7.9 Hz, NH), 7.89 (2H, d, J = 7.3 Hz, aromatic H), 7.72 (2H, d, J = 7.5 Hz, aromatic H), 7.42 (2H, t like, J = 7.3 Hz, aromatic H), (2H, m, aromatic H), 5.49 (1H, br d, J = 50.5 Hz, H-4), (1H, m, H-2), (6H, m), (2H, m, H-3), (1H, m), (1H, m), (1H, m), 0.87 (3H, d, J = 6.8 Hz, Me), 0.86 (3H, t, J = 7.3 Hz, Me). MS(ESI pos.) m/z 472 ([M+Na] + ). (2S,4S)-4-Fluoro-1-L-isoleucylpyrrolidine-2-carbonitrile hydrochloride (9g) 1,2-ジクロロエタン(90 ml)に 6g (6. 2 g, 13.8 mmol)を 溶 解 し 氷 冷 にて diethylamine (10 ml) を 加 え そのまま 氷 冷 で 30 分 間 次 いで 室 温 で 5 時 間 攪 拌 した 反 応 液 を 減 圧 で 濃 縮 し 残 渣 をジエチルエーテル(100 ml) THF (50 ml) 及 びクロロホルム(50 ml)の 混 合 溶 媒 に 溶 解 し 氷 冷 にて 4M HCl / ジオキサン(4.0 ml)を 加 えた 生 成 した 粉 末 を 濾 取 し ジエチルエーテル で 洗 浄 した 得 られた 粉 末 をシリカゲルカラムクロマトグラフィー( 溶 出 溶 媒 ;CHCl 3 : MeOH : 25% aqueous ammonia = 40:1:0.1-25:1:0.1)で 精 製 した 得 られた 残 渣 をクロロホルムに 溶 解 し 氷 冷 で 4M HCl / ジオキサン(4.0 ml)を 加 え 生 成 した 粉 末 を 濾 取 し クロロホルムで 洗 浄 し 減 圧 で 乾 燥 して 目 的 物 (2.9 g, 80%)を 無 色 粉 末 として 得 た mp o C ( decomp. ). 1 H NMR (500 MHz, DMSO - d 6 ) δ 8.59 (3H, br s, H 3 N + ), 5.54 (0.9H, br d, J = 52.1 Hz, H-4 of the major conformer), 5.45 (0.1H, br d, J = 53.3 Hz, H-4 of the minor conformer), 5.39 (0.1H, d, J = 6.7 Hz, H-2 of the minor conformer), 5.06 (0.9H, d, J = 9.4 Hz, H-2 of the major conformer), (3H, m, H-5 and NCHCO), (2H, m, H-3), (1H, m), (1H, m), (1H, m), 0.94 (3H, d, J = 6.7 Hz, Me), 0.88 (3H, t, J = 7.3Hz, Me); 13 C NMR (125.4 MHz, DMSO - d 6 ) δ 168.2, 118.3, 92.9 (d, J C-F = Hz), 54.4, 53.6 (d, J C-F = 21.7 Hz), 44.7, 36.3, 35.4 (d, J C-F = 20.7 Hz), 23.7, 13.9, 10.9; 19 F NMR (282.2 MHz, DMSO - d 6 ) δ MS(ESI pos.) m/z 250 ([M+Na] + ); (ESI neg.) m/z 262 ([M+Cl] - ). HRMS calcd for C 11 H 19 FN 3 O[M+H] , found (m/z) Anal. calcd 25 for C 11 H 18 FN 3 O HCl 0.5H 2 O: C, 48.44; H, 7.39; N, Found: C, 48.20; H, 7.37; N, [α] D (c=0.3, MeOH). (2S,4R)-4-Hydroxy-1-L-isoleucylpyrrolidine-2-carbonitrile hydrochloride (9a) 化 合 物 9g と 同 様 の 方 法 で 表 題 化 合 物 を 無 色 粉 末 として 得 た mp o C ( decomp. ). 1 H NMR (300 MHz, DMSO d 6 ) δ 8.32 (3H, br s, H 3 N + ), 5.45 (1H, d, J = 3.7 Hz, OH), 4.75 (1H, t 42

47 like, J = 9 Hz, H-2), 4.38 (1H, br s, H-4), 4.08 (1H, d, J = 5.3 Hz, NCHCO), 3.74 (1H, d, J = 10.8 Hz, H-5), 3.64 (1H, dd, J = 10.8, 3.8 Hz, H-5), (2H, m, H-3), (1H, m ), (1H, m ), (1H, m ), 0.97 (3H, d, J = 7.0 Hz, Me), 0.88 (3H, t, J = 7.3 Hz, Me). MS(ESI pos.) m/z 248 ([M+Na] + ), 226 ([M+H] + ); (ESI neg.) m/z 260 ([M+Cl] - ). HRMS calcd for C 11 H 20 N 3 O 2 [M+H] , found (m/z) (2S,4S)-4-Hydroxy-1-L-isoleucylpyrrolidine-2-carbonitrile hydrochloride (9b) 化 合 物 9g と 同 様 の 方 法 で 表 題 化 合 物 を 無 色 アモルファス 物 質 として 得 た 1 H NMR (300 MHz, DMSO - d 6 ) δ 8.40 (3H, br s, H 3 N + ), 5.44 (1H, br s, OH), 4.88 (1H, dd, J = 9.0, 2.5 Hz, H-2), (1H, m, H-4), (1H, m, NCHCO), 3.75 (1H, dd, J = 10.8, 4.3 Hz, H-5), 3.53 (1H, d, J = 10.8 Hz, H-5), 2.25 (1H, ddd, J = 13.2, 9.2, 4.1 Hz, H-3), 2.10 (1H, br d, J = 13.2 Hz, H-3), (1H, m), (1H, m), (1H, m), 0.96 (3H, d, J = 7.0 Hz, Me), 0.88 (3H, t, J = 7.4 Hz, Me). MS(ESI pos.) m/z 248 ([M+Na] + ), 226 ([M+H] + ); (ESI neg.) m/z 260 ([M+Cl] - ). HRMS calcd for C 11 H 20 N 3 O 2 [M+H] , found (m/z) (2R,3S)-3-Hydroxy-1-L-isoleucylpyrrolidine-2-carbonitrile (9c) 塩 酸 塩 形 成 の 部 分 を 除 いて 化 合 物 9g と 同 様 の 方 法 で 表 題 化 合 物 を 無 色 油 状 物 質 として 得 た 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3 ) δ 4.76 (1H, br s, H-2), 4.60 (1H, br d, J = 3.7 Hz, H-3), (2H, m, H-5), 3.33 (1H, d, J = 6.4 Hz, NCHCO), (1H, m, H-3), (1H, m, H-3), (2H, m), (1H, m), 0.96 (3H, d, J = 6.8 Hz, Me), 0.92 (3H, t, J = 7.3 Hz, Me). MS(ESI pos.) m/z 248 ([M+Na] + ). HRMS calcd for C 11 H 20 N 3 O 2 [M+H] , found (m/z) (2S,4R)-1-L-Isoleucyl-4-methoxypyrrolidine-2-carbonitrile hydrochloride (9d) 化 合 物 9g と 同 様 の 方 法 で 表 題 化 合 物 を 無 色 アモルファス 物 質 として 得 た 1 H NMR (500 MHz, DMSO d 6 ) δ 8.37 (3H, br s, H 3 N + ), 4.70 (1H, dd, J = 9.1, 7.9 Hz, H-2), 4.20 (1H, br d, J = 4.3 Hz, NCHCO), 4.07 (1H, br s, H-4), 3.99 (1H, d, J = 11.5 Hz, H-5), 3.63 (1H, dd, J = 11.5, 3.6 Hz, H-5), 3.25 (3H, s, OMe), (1H, m, H-3), (1H, m, H-3), (1H, m), (1H, m), (1H, m), 0.98 (3H, d, J = 7.0 Hz, Me), 0.88 (3H, t, J = 7.3 Hz, Me). MS(ESI pos.) m/z 262 ([M+Na] + ), 240 ([M+H] + ); (ESI neg.) m/z 274 ([M+Cl] - ). HRMS calcd for C 12 H 22 N 3 O 2 [M+H] , found (m/z)

48 (2S,4S)-1-L-Isoleucyl-4-methoxypyrrolidine-2-carbonitrile hydrochloride (9e) 化 合 物 9g と 同 様 の 方 法 で 表 題 化 合 物 を 無 色 粉 末 として 得 た mp o C. 1 H NMR (500 MHz, DMSO - d 6 ) δ 8.46 (3H, br s, H 3 N + ), 5.23 (0.05H, d, J = 8.5 Hz, H-2 of the minor conformer), 4.91 (0.95H, dd, J = 9.2, 1.6 Hz, H-2 of the major conformer), 4.14 (0.95H, br s, H-4 of the major conformer), 4.09 (0.05H, m, H-4 of the minor conformer), 3.87 (1H, d, NCHCO), (2H, m, H-5), 3.29 (3H, s, OMe), 2.37 (1H, d, J = 14.0 Hz, H-3), 2.22 (1H, ddd, J = 13.7, 9.5, 4.0 Hz, H-3), (1H, m), (1H, m), (1H, m), 0.94 (3H, d, J = 6.7 Hz, Me), 0.88 (3H, t, J = 7.3 Hz, Me). MS(ESI pos.) m/z 262 ([M+Na] + ), 240 ([M+H] + ); (ESI neg.) m/z 274 ([M+Cl] - ). HRMS calcd for C 12 H 22 N 3 O 2 [M+H] , found (m/z) (2S,4R)-4-Fluoro-1-L-isoleucylpyrrolidine-2-carbonitrile hydrochloride (9f) 化 合 物 9g と 同 様 の 方 法 で 表 題 化 合 物 を 無 色 粉 末 として 得 た mp o C ( decomp. ). 1 H NMR (500 MHz, DMSO - d 6 ) δ 8.38 (3H, br s, H 3 N + ), 5.42 (1H, br d, J = 51.9 Hz, H-4), 4.87 (1H, dd, J = 10.1, 8.0 Hz, H-2), (2H, m, H-5 and NCHCO), 3.81 (1H, ddd, J = 39.0, 12.6, 2.5 Hz, H-5), (1H, m, H-3), (1H, m, H-3), (1H, m), (1H, m), (1H, m), 0.98 (3H, d, J = 6.7 Hz, Me), 0.88 (3H, t, J = 7.3Hz, Me). MS(ESI pos.) m/z 250 ([M+Na] + ), 228 ([M+H] + ); (ESI neg.) m/z 262 ([M+Cl] - ). HRMS calcd for C 11 H 19 FN 3 O[M+H] , found (m/z) tert-butyl ((1S,2S)-1-{[(2S)-2-cyano-4,4-difluoropyrrolidin-1-yl]carbonyl}-2-methylbutyl)carbamate (8h) DMF (2.5 ml) に tert-butyl ((1S,2S)-1-{[(2S)-2-(aminocarbonyl)-4,4-difluoropyrrolidin-1-yl] carbonyl}-2-methylbutyl)carbamate 7h (900 mg, 2.48 mmol)を 溶 解 し 塩 化 シアヌル(280 mg, 1.49 mmol)を 加 え 室 温 で 1 時 間 攪 拌 した 反 応 液 を 水 にあけて 酢 酸 エチルで 抽 出 した 有 機 層 を 飽 和 炭 酸 水 素 ナトリウム 水 溶 液 飽 和 書 食 塩 水 で 洗 浄 し 無 水 硫 酸 ナトリウムにて 乾 燥 した 乾 燥 剤 を 濾 去 後 濾 液 を 減 圧 で 濃 縮 し 得 られた 残 渣 をシリカゲルカラムクロマトグラフィー ( 溶 出 溶 媒 ;hexane : EtOAc = 20:1-4:1)で 精 製 して 目 的 物 (760 mg, 89%)を 無 色 アモルファス 物 質 として 得 た 1 H NMR (300 MHz, DMSO - d 6 ) δ 7.29 (1H, d, J = 7.9 Hz, NH), 5.08 (1H, dd, J = 9.1, 4.1 Hz, H-2), (2H, m, H-5), 3.90 (1H, t like, J = 8.7 Hz, NCHCO), ( 2H, m, H-3), (1H, m), (1H, m), 1.36 (9H, s, Boc), (1H, m), (6H, m, 44