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1 財 団 法 人 福 岡 県 産 業 科 学 技 術 振 興 財 団 産 学 官 共 同 研 究 開 発 事 業 研 究 成 果 報 告 書 伝 統 野 菜 の 循 環 系 改 善 機 能 の 解 明 による 新 規 健 康 補 助 食 品 の 開 発 ( 平 成 15 年 度 ~ 平 成 17 年 度 )

2 目 次 研 究 総 括 伝 統 野 菜 の 循 環 系 改 善 機 能 の 解 明 による 新 規 健 康 補 助 食 品 の 開 発 1 ( 株 )レオロジー 機 能 食 品 研 究 所 所 長 藤 野 武 彦 研 究 報 告 1 高 成 分 品 種 の 選 定 と 簡 易 栽 培 技 術 の 開 発 高 成 分 品 種 の 選 定 4 福 岡 県 農 業 総 合 試 験 場 1-2 簡 易 栽 培 技 術 の 開 発 6 福 岡 県 農 業 総 合 試 験 場 2. タデの 品 種 別 および 生 育 時 期 別 成 分 含 量 と 機 能 性 の 評 価 品 種 別 および 生 育 時 期 別 品 質 と 収 量 の 検 討 10 福 岡 県 農 業 総 合 試 験 場 2-2 品 種 および 生 育 時 期 別 機 能 性 の 評 価 13 福 岡 県 農 業 総 合 試 験 場 3. 機 能 性 成 分 の 特 定 と 生 体 調 整 機 能 の 解 明 芽 タデの 機 能 性 成 分 の 同 定 と 定 量 法 の 開 発 15 福 岡 県 工 業 技 術 センター 生 物 食 品 研 究 所 3-2 タデ 抗 酸 化 成 分 の 抽 出 分 画 と 分 析 並 びにヒト 赤 血 球 変 形 能 低 下 抑 制 物 質 の 同 定 24 ( 株 )レオロジー 機 能 食 品 研 究 所 3-3 機 能 性 成 分 の 生 体 機 能 の 解 明 34 ( 株 )レオロジー 機 能 食 品 研 究 所 3-4 タデ 抽 出 物 の 血 小 板 機 能 に 及 ぼす 影 響 43 久 留 米 大 学 医 学 部 3-5 タデ 由 来 機 能 性 成 分 の 免 疫 系 に 及 ぼす 作 用 の 解 析 47 九 州 大 学 大 学 院 医 学 研 究 院 4. 健 康 補 助 食 品 の 開 発 と 評 価 51 クロレラ 工 業 ( 株 ) 成 果 実 績 63

3 研 究 統 括 レオロジー 機 能 食 品 研 究 所 所 長 藤 野 武 彦 1 研 究 開 発 の 目 的 1-1 研 究 開 発 の 概 要 タ デ の 最 適 ( 機 能 的 経 済 的 ) 栽 培 条 件 を 確 立 し そ の タ デ よ り 医 学 的 機 能 性 成 分 を 抽 出 す る 得 ら れ た 抽 出 物 の 機 能 性 を 動 物 ( イ ン ビ ボ ) 及 び ヒ ト 細 胞 ( イ ン ビ ト ロ ) で 確 認 す る そ の 機 能 性 画 分 を 活 用 し た 新 た な 機 能 性 食 品 機 能 性 食 品 素 材 を 開 発 す る 研 究 開 発 体 制 福 岡 県 農 業 総 合 試 験 場 福 岡 園 芸 JA 筑 前 あ さ くら 1 高 成 分 品 種 の 選 定 と 簡 易 栽 培 の 開 発 2 タ デ の 品 種 お よ び 生 育 時 期 別 成 分 含 量 と 機 能 性 評 価 福 岡 県 工 業 技 術 セ ン タ ー 生 物 食 品 研 究 所 レ オ ロ ジ ー 機 能 食 品 研 究 所 機 能 性 成 分 の 特 定 と 生 体 調 整 機 能 の 解 明 1 抽 出 2 機 能 評 価 九 州 大 学 大 学 院 医 学 研 究 院 久 留 米 大 学 医 学 部 第 二 内 科 ( 株 )ふ くれ ん ク ロ レ ラ 工 業 健 康 補 助 食 品 の 開 発 と 評 価 1-2 達 成 目 標 1)タ デ の 品 種 選 定 と 栽 培 条 件 の 確 立 を す る (1) 高 成 分 品 種 の 選 定 を 行 う (2) 簡 易 栽 培 技 術 の 開 発 を す る 2)タ デ の 品 種 お よ び 生 育 時 期 別 成 分 含 量 を 測 定 し 機 能 性 を 明 ら か に す る (1) 品 種 お よ び 生 育 時 期 別 品 質 と 収 量 を 明 ら か に す る (2) 品 種 お よ び 生 育 時 期 別 機 能 性 を 評 価 する 3) 機 能 性 成 分 を 抽 出 し そ の 同 定 を 行 う 4) 機 能 性 成 分 の 医 学 的 機 能 を 評 価 す る (1) 動 物 に よ り 生 体 調 整 機 能 を 評 価 す る (2) 人 体 に お い て 生 体 調 整 機 能 を 評 価 す る 5) 健 康 補 助 食 品 を 開 発 し そ の 評 価 を 行 う (1) 健 康 補 助 食 品 の 開 発 を す る (2) 健 康 補 助 食 品 の 評 価 を す る 1

4 2 研 究 成 果 概 要 2-1 タ デ の 品 種 選 定 と 栽 培 条 件 の 確 立 1)16 系 統 か ら 新 た な 優 良 品 種 を 選 定 し た 2) 播 種 量 を 多 く す れ ば 多 収 量 と な り 生 育 日 数 を 延 長 さ せ る と 抗 酸 化 能 は 増 大 す る こ と が 明 ら か に な っ た 3) 水 耕 栽 培 法 を 確 立 し た 4) 生 長 タ デ に ル テ イ ン が 大 量 に 含 ま れ て い る こ と を 発 見 し た 2-2 機 能 性 成 分 の 抽 出 と 特 定 1) 紅 タ デ よ り 有 効 機 能 性 成 分 を 抽 出 す る 方 法 を 確 立 し た 2) 機 能 性 物 質 は 芽 タデではシアニジン 系 成 分 ( イ デ イ ン な ど ) ケ ル セ チ ン 系 成 分 ( イ ソ ケ ル シ ト リ ン な ど ) で あ る こ と を 明 ら か に し た 3) 生 長 タ デ に 高 濃 度 に ル テ イ ン が 存 在 す る こ と を 発 見 し そ の 効 率 的 抽 出 法 を 開 発 し た ( 特 許 申 請 手 続 中 ) 2-3 生 体 調 整 機 能 の 解 明 1) 酸 化 モ デ ル ラ ッ ト ( イ ン ビ ボ ) に 酢 酸 抽 出 物 を 投 与 し た 結 果 ( 1 ) 赤 血 球 変 形 能 ( サ ラ サ ラ 度 ) の 改 善 ( 2 ) 血 糖 降 下 肝 機 能 改 善 ( 3 ) 白 血 球 低 下 防 止 血 小 板 増 大 2)ヒ ト 細 胞 ( イ ン ビ ト ロ ) に 酢 酸 抽 出 物 を 投 与 し た 結 果 ( 1 ) 免 疫 活 性 化 ( T 細 胞 の 活 性 化 TNF-αの 増 強 ) ( 2 ) 血 栓 防 止 効 果 ( 血 小 板 凝 集 能 の 抑 制 ) ( 3 ) 赤 血 球 変 形 能 ( サ ラ サ ラ 度 ) の 改 善 3) 芽 タ デ よ り 抽 出 さ れ た イ デ イ ン と イ ソ ケ ル シ ト リ ン は 強 い 抗 酸 化 活 性 を 示 し 同 時 に 強 い ヒ ト 赤 血 球 変 形 能 低 下 抑 制 効 果 を 示 し た 4)イ デ イ ン と イ ソ ケ ル シ ト リ ン は ヒ ト 血 小 板 凝 集 抑 制 効 果 を 示 し 特 に イ デ イ ン に 顕 著 であった 5)イ デ イ ン は ヒ ト 白 血 球 B 細 胞 に お い て CD69 と HLA-DR の 発 現 を 増 大 さ せ た ( 免 疫 活 性 化 ) ル テ イ ン は ヒ ト 白 血 球 T 細 胞 に お い て CD25 の 発 現 を 低 下 さ せ た( ア レ ル ギ ー 低 下 ) 上 記 の 結 果 を ま と め て 特 許 申 請 を 行 な っ た 2-4 健 康 補 助 食 品 の 開 発 と 評 価 1)ド リ ン ク ジ ュ ー ス の 開 発 を 行 い 細 菌 数 色 安 全 性 味 覚 に 問 題 が ないことを 確 認 した 2)ド リ ン ク の 抗 酸 化 能 を 確 認 し ヒ ト に 投 与 し た 結 果 コ レ ス テ ロ ー ル お よ び 血 糖 降 下 作 用 が 見 ら れ た 3)カ プ セ ル お よ び 錠 剤 を 試 作 し た 2

5 3 成 果 の 市 場 性 優 位 性 本 研 究 で 得 ら れ た 研 究 成 果 は 現 在 の 日 本 の 医 療 状 況 ( 生 活 習 慣 病 の 増 大 ) に 寄 与 す る こ と が 大 き い こ と を 示 唆 し て い る す な わ ち 赤 血 球 変 形 能 を 改 善 し 血 小 板 凝 集 能 を 抑 制 す る こ と は 主 要 死 因 の 一 つ で あ る 脳 心 臓 血 管 の 血 栓 ( 脳 梗 塞 心 筋 梗 塞 ) の 防 止 に 大 変 有 用 で あ り 血 糖 低 下 作 用 肝 機 能 の 改 善 効 果 が 見 ら れ た こ と は 軽 症 糖 尿 病 や 肝 疾 患 の 治 療 補 完 と 予 防 に 役 立 つ こ と を 示 し て い る こ れ ら の 成 果 か ら 市 場 性 の 大 き い 機 能 性 食 品 や 健 康 ド リ ン ク 剤 の 素 材 と し て も 紅 タ デ が 利 用 さ れ る よ う に な る こ と が 期 待 さ れ る ま た 医 学 的 機 能 が 実 証 さ れ た 機 能 性 食 品 は 極 め て 尐 な い の で 紅 タ デ 関 連 商 品 が 開 発 さ れ れ ば そ の 優 位 性 は 大 変 高 く な る そ し て 本 研 究 チ ー ム の ク ロ レ ラ 工 業 と ふ く れ ん は 薬 局 系 ( 約 3,000 店 ) コ カ コ ー ラ 製 造 業 者 大 手 ド ラ ッ ク ス ト ア ー 生 協 な ど の 大 手 一 般 食 品 店 農 協 関 連 の 販 売 店 な ど の 販 売 ル ー ト を す で に 保 有 し て い る の で 市 場 展 開 の 現 実 性 が 高 い 生 産 加 工 精 製 筑 前 あさくら 農 業 協 同 組 合 原 料 (タデ)の 生 産 クロレラ 工 業 ( 株 ) 原 料 の 乾 燥 粉 末 化 溶 媒 抽 出 濃 縮 粉 末 化 製 品 化 クロレラ 工 業 ( 株 ) 錠 剤 カプセル 薬 局 薬 店 大 手 ドラッグストアー コカ コーラ ルート ( 株 )ふくれん 生 活 協 同 組 合 ジュースなどドリンク 類 一 般 食 品 ストア 原 料 販 売 ファンケルなど 独 自 のブ ランドを 販 売 する 健 康 食 品 販 売 業 者 4 研 究 成 果 の 地 域 経 済 お よ び 関 連 分 野 へ の 波 及 効 果 本 研 究 に よ り 紅 タ デ の 医 学 的 機 能 が 明 ら か に な っ た こ と は 一 般 消 費 者 の 食 用 と し て の 利 用 増 大 を 促 し そ の 結 果 農 業 生 産 が 拡 大 す る さらに 市 場 性 が 高 く そ の 規 模 も 大 き い 機 能 性 食 品 ド リ ン ク 剤 の 原 料 と し て 紅 タ デ と 開 発 商 品 の 生 産 規 模 が 飛 躍 的 に 増 大 することが 期 待 さ れ る そ の 結 果 新 た な 産 業 経 済 の 促 進 に つ な が る 5 研 究 開 発 終 了 後 の 具 体 的 展 望 1) 農 業 生 産 の 面 で は 本 研 究 に よ り 紅 タ デ の 医 学 的 機 能 が 明 ら か に な っ た こ と は そ の 需 要 が 大 き く 増 大 す る こ と が 推 定 さ れ る 紅 タ デ の 品 種 と 栽 培 法 が 確 立 さ れ た こ と で 需 要 に 対 応 し た 効 率 の 良 い 量 産 が 可 能 と な る 2) 紅 タ デ の 機 能 性 物 質 を 利 用 し た 新 た な 商 品 開 発 と 発 売 を 行 う す な わ ち 具 体 的 に は 紅 タ デ ド リ ン ク と 機 能 性 成 分 抽 出 物 の カ プ セ ル 商 品 の 具 体 化 が 進 行 中 で あ る 3) 本 研 究 に よ り 食 用 と 機 能 性 食 品 の 分 野 で 紅 タ デ の 飛 躍 的 消 費 増 大 が 期 待 さ れ る が そ れ は 即 ち 国 民 の 生 活 習 慣 病 の 予 防 と 治 療 に 大 き く 寄 与 す る こ と に つ な が る 3

6 1 高 成 分 品 種 の 選 定 と 簡 易 栽 培 技 術 の 開 発 1-1 高 成 分 品 種 の 選 定 福 岡 県 農 業 総 合 試 験 場 研 究 員 水 田 一 枝 専 門 研 究 員 山 下 純 隆 食 品 流 通 部 長 許 斐 健 治 研 究 員 馬 場 紀 子 研 究 員 池 田 浩 暢 プ ロ ジ ェ ク ト 全 体 に お け る 本 研 究 開 発 部 分 の 位 置 づ け こ れ ま で タ デ は 生 食 用 と し て の 色 彩 や 栽 培 の 難 易 を 中 心 に 品 種 選 定 が 行 わ れ て お り 内 容 成 分 に 注 目 し た 品 種 選 定 は 行 わ れ て い な い そ こ で タ デ の 抗 酸 化 性 等 の 機 能 性 成 分 に 着 目 し た 品 種 選 定 を 行 う 目 標 と 目 的 タ デ の 抗 酸 化 性 に つ い て 品 種 間 差 を 明 ら か に し 健 康 補 助 食 品 等 を 製 造 す る 場 合 に 用 い る 原 料 タ デ の 品 種 を 選 定 す る 実 験 方 法 お よ び 実 験 条 件 ( 1 ) 供 試 品 種 お よ び 栽 培 概 要 1 抗 酸 化 性 に よ る 選 定 ( 株 ) 福 岡 園 芸 が 保 有 す る ヤ ナ ギ タ デ 16 系 統 を 供 試 し 対 照 と し て 系 統 R(( 株 ) 福 岡 園 芸 生 食 用 現 行 )を 用 い た 栽 培 は 雤 よ け ハ ウ ス ( 図 1 ) で 行 い 2003 年 3 月 および 8 月 に 播 種 し 本 葉 出 現 前 に そ れ ぞれ 収 穫 した 2 収 量 性 に よ る 選 定 1 の 結 果 よ り 抗 酸 化 性 の 高 い 6 系 統 を 供 試 し 対 照 と し て 系 統 R を 用 い た 栽 培 は 雤 よ け ハ ウ ス で 2004 年 2 月 6 月 10 月 に 行 った 図 1 雨 よけハウスでの 栽 培 の 様 子 ( 2 ) 抗 酸 化 性 測 定 方 法 タ デ ( 生 ま た は 凍 結 保 存 品 ) に 80%エ タ ノ ー ル を 加 え て 磨 砕 し 遠 心 分 離 し て 得 ら れ た (1 2) 上 澄 み 液 を 供 試 し た β - カ ロ テ ン 退 色 法 により 抗 酸 化 性 を 測 定 し タデ( 生 鮮 物 ) 100g あたりの BHA 相 当 量 と し て 換 算 した 4

7 BHA 相 当 量 mg/100gfw 収 量 (g/m2) (3) 収 量 調 査 収 穫 し た タ デ を 水 洗 脱 水 後 製 品 収 量 を 調 査 し た 実 験 結 果 ( 1 ) 系 統 別 抗 酸 化 性 16 系 統 間 には 抗 酸 化 性 に 差 があり 6 系 統 ( 系 統 番 号 )で 対 照 系 統 R と 同 等 またはそれ 以 上 の 抗 酸 化 性 を 示 した( 図 2 ) (2) 収 量 性 抗 酸 化 性 の 高 い 6 系 統 の 収 量 調 査 を 行 っ た 結 果 3 系 統 ( 系 統 番 号 2 5 8)が 対 照 系 統 R より 高 い 収 量 性 を 示 した( 図 3 ) R 系 統 番 号 0 R 系 統 番 号 図 2 系 統 別 抗 酸 化 性 図 3 系 統 別 収 量 性 注 )2003 年 平 均 値 注 )2004 年 平 均 値 研 究 成 果 加 工 原 料 用 タ デ と し て 抗 酸 化 性 が 高 く 収 量 性 に も 優 れた 3 系 統 ( 系 統 番 号 2 5 8) を 選 定 した 今 後 の 課 題 と 取 組 選 定 し た 有 望 系 統 の 実 用 化 に 伴 い 原 料 供 給 を 行 う 場 合 は 十 分 な 種 子 の 供 給 を 図 る た め の 増 殖 が 必 要 で あ り 研 究 協 力 者 で あ る 福 岡 園 芸 が 実 施 す る 参 考 文 献 引 用 文 献 ( 1 ) 各 種 野 菜 類 の 抗 酸 化 能 の 評 価 お よ び 数 種 の 抗 酸 化 能 成 分 の 同 定 津 志 田 藤 二 郎 鈴 木 雅 博 黒 木 柾 吉 日 本 食 品 工 業 学 会 Vol.41. 9( 1994) ( 2 ) 食 品 機 能 研 究 法 篠 原 和 毅 鈴 木 建 夫 上 野 川 修 一 編 著 5

8 1 高 成 分 品 種 の 選 定 と 簡 易 栽 培 技 術 の 開 発 1-2 簡 易 栽 培 技 術 の 開 発 福 岡 県 農 業 総 合 試 験 場 研 究 員 水 田 一 枝 専 門 研 究 員 山 下 純 隆 食 品 流 通 部 長 許 斐 健 治 研 究 員 馬 場 紀 子 研 究 員 池 田 浩 暢 プ ロ ジ ェ ク ト 全 体 に お け る 本 研 究 開 発 部 分 の 位 置 づ け 現 在 タ デ は 芽 だ し 直 後 の も の が 生 食 用 と し て 出 荷 さ れ て い る が 投 下 労 力 当 た り の 収 量 が 尐 な い た め 原 料 用 と し て 用 い る 場 合 は コ ス ト が 合 わ な い 可 能 性 が あ る そ こ で タ デ を 健 康 補 助 食 品 等 の 原 料 と し て 供 給 す る 場 合 の 簡 易 栽 培 法 や 多 収 穫 栽 培 法 に つ い て 検 討 する 目 標 と 目 的 播 種 量 や 生 育 日 数 延 長 が タ デ の 収 量 や 抗 酸 化 性 に 及 ぼ す 影 響 を 明 ら か に し て 簡 易 栽 培 法 や 多 収 穫 生 産 法 を 確 立 す る 実 験 方 法 お よ び 実 験 条 件 ( 1 ) 播 種 量 が 収 量 抗 酸 化 性 に 及 ぼ す 影 響 播 種 量 が 慣 行 (100%と す る ) お よ び 200%の 4 試 験 区 を 設 定 し た 栽 培 は 2004 年 6 月 9 月 12 月 2005 年 2 月 に 行 った ( 2 ) 生 育 日 数 延 長 が 収 量 抗 酸 化 性 に 及 ぼ す 影 響 播 種 量 を 慣 行 の 50%と し 通 常 栽 培 ( 芽 だ し ; 子 葉 の み ) と 生 育 日 数 延 長 栽 培 ( 本 葉 1 ~ 2 枚 )の 2 試 験 区 を 設 け た 栽 培 は 2004 年 6 月 9 月 12 月 2005 年 2 月 に 行 った 各 栽 培 時 期 で の 生 育 期 間 ( 播 種 後 日 数 ) を 表 1に 示 した 表 1 各 栽 培 時 期 に お け る 生 育 日 数 栽 培 方 法 6 月 9 月 12 月 2 月 通 常 栽 培 7 日 7 日 12 日 16 日 生 育 日 数 延 長 区 14 日 14 日 32 日 26 日 (3) 収 量 調 査 各 試 験 区 とも 1m 2 当 た り の 製 品 収 量 ( 収 穫 後 水 洗 脱 水 ) を 調 査 し た 6

9 BHAmg 相 当 量 /100gFW (4) 抗 酸 化 性 タ デ ( 生 ま た は 凍 結 保 存 品 ) に 80%エ タ ノ ー ル を 加 え て 磨 砕 し 遠 心 分 離 し て 得 ら れ た 上 澄 み 液 を 供 試 し た β - カ ロ テ ン 退 色 法 お よ び DPPH ラジカル 消 去 法 に よ り 抗 酸 化 性 を 測 定 し た β - カ ロ テ ン 退 色 法 は タ デ( 生 鮮 物 )100g あたりの BHA 相 当 量 と し て 換 算 し DPPH ラ ジ カ ル 消 去 法 で は Trolox 相 当 量 と し て 換 算 し た 実 験 結 果 ( 1 ) 播 種 量 が 収 量 および 抗 酸 化 性 に 及 ぼ す 影 響 播 種 量 が 多 く な る ほ ど 収 量 は 増 加 し た( 表 2 ) 抗 酸 化 性 は 収 穫 時 期 に よ る 差 は あ る も の の 播 種 量 に よ る 差 は 認 め ら れ な か っ た ( 図 1 図 2 ) 表 2 播 種 量 が 収 量 に 及 ぼ す 影 響 ( g/m2) 播 種 量 栽 培 時 期 6 月 9 月 12 月 2 月 1 50% % ( 慣 行 ) % % 月 9 月 12 月 2 月 播 種 量 試 験 区 図 1 播 種 量 が 抗 酸 化 性 に 及 ぼ す 影 響 ( β - カ ロ テ ン 退 色 法 ) 7

10 Trolox nmol/100fw 収 量 (g/m2) Trolox nmol/100gfw 月 9 月 12 月 2 月 播 種 量 試 験 区 図 2 播 種 量 が 抗 酸 化 性 に 及 ぼ す 影 響 ( DPPH ラ ジ カ ル 消 去 法 ) ( 2 ) 栽 培 形 態 が 収 量 および 抗 酸 化 性 に 及 ぼ す 影 響 生 育 日 数 延 長 区 は 通 常 栽 培 区 に 比 べ て い ず れ の 時 期 も 収 量 が 多 か っ た ( 図 3 ) ま た 生 育 日 数 延 長 区 は 通 常 栽 培 区 よりも DPPH ラジカル 消 去 法 による 抗 酸 化 性 が 高 かった( 図 4 ) 通 常 栽 培 生 育 延 長 月 9 月 12 月 2 月 図 3 生 育 日 数 延 長 が 収 量 に 及 ぼ す 影 響 通 常 栽 培 生 育 延 長 月 9 月 12 月 2 月 図 4 生 育 日 数 延 長 が 抗 酸 化 性 に 及 ぼ す 影 響 ( DPPH ラ ジ カ ル 消 去 法 ) 8

11 1-2-5 研 究 成 果 播 種 量 を 多 く す る と 多 収 と な り 生 育 日 数 を 延 長 さ せ る と 抗 酸 化 性 が 高 く な る こ と が 明 ら か と な っ た こ れ ら の 結 果 を 組 み 合 わ せ る こ と で 原 料 タ デ の 効 率 的 生 産 が 可 能 と な る 今 後 の 課 題 と 取 組 現 在 加 工 用 と し て の タ デ は 栽 培 さ れ て い な い が 本 研 究 成 果 を 基 礎 に 栽 培 技 術 を 確 立 し 効 率 的 な 原 料 供 給 体 制 を 構 築 す る 必 要 が あ る 9

12 2 タデの 品 種 別 および 生 育 時 期 別 成 分 含 量 と 機 能 性 の 評 価 2-1 品 種 別 および 生 育 時 期 別 品 質 と 収 量 の 検 討 福 岡 県 農 業 総 合 試 験 場 研 究 員 水 田 一 枝 専 門 研 究 員 山 下 純 隆 食 品 流 通 部 長 許 斐 健 治 研 究 員 馬 場 紀 子 研 究 員 池 田 浩 暢 プ ロ ジ ェ ク ト 全 体 に お け る 本 研 究 開 発 部 分 の 位 置 づ け 生 食 用 と し て 収 穫 出 荷 さ れ て い る 芽 だ し 直 後 の タ デ よ り も 生 育 を 延 長 し た 方 が 収 量 性 や 抗 酸 化 能 が 高 い こ と が 明 ら か と な っ た こ の た め タ デ を さ ら に 生 育 さ せ た 場 合 の 各 生 育 段 階 に お け る 品 質 や 収 量 性 を 検 討 す る 目 標 と 目 的 生 食 用 の 品 種 を 用 い て 各 生 育 段 階 の 品 質 や 収 量 性 を 明 ら か に し 原 料 に 適 す る 収 穫 時 期 を 明 ら か に す る 実 験 方 法 お よ び 実 験 条 件 ( 1 ) 栽 培 試 験 方 法 系 統 A を 供 試 し 雤 よけハウスで 栽 培 した 播 種 後 一 定 期 間 毎 に 収 穫 する 収 穫 時 期 別 の 試 験 と 2 週 間 毎 に 播 種 を 行 う 播 種 時 期 別 の 試 験 を 行 っ た ( 2 ) 収 穫 時 期 別 試 験 5 月 11 日 播 種 後 6 月 1 日 6 月 29 日 7 月 29 日 および 8 月 30 日 に 収 穫 した 生 育 期 間 は 各 々 播 種 後 日 に 相 当 す る ( 3 ) 播 種 時 期 別 試 験 5 月 11 日 5 月 25 日 6 月 8 日 6 月 22 日 7 月 6 日 7 月 20 日 8 月 3 日 8 月 17 日 および 8 月 31 日 に 播 種 し 9 月 9 日 に 一 斉 収 穫 し た 生 育 期 間 は 各 々 播 種 後 日 に 相 当 す る (4) 調 査 項 目 草 丈 収 穫 量 病 害 虫 発 生 程 度 を 調 査 し た 実 験 結 果 タ デ は 播 種 後 か ら の 生 育 日 数 が 経 過 す る に つ れ て 草 丈 も 伸 び 播 種 後 90 日 以 降 で は 100cm を 超 えた( 図 1) ま た 播 種 後 121 日 ま で は 生 育 日 数 が 経 過 す る ほ ど 粗 収 量 も 増 10

13 収 量 (kg/m2) 草 丈 (cm) 加 した( 図 2) 病 害 虫 と し て ア ブ ラ ム シ の 発 生 が 6 月 ~7 月 に 認 め ら れ た 8 月 は 高 温 の た め 一 時 減 尐 し た も の の 気 温 が 下 が っ た 8 月 中 旬 に は 再 度 増 加 し た ( 図 3 ) 播 種 時 期 別 収 穫 時 期 別 生 育 日 数 図 1 タ デ の 生 育 日 数 別 草 丈 播 種 時 期 別 収 穫 時 期 別 生 育 日 数 図 2 生 育 日 数 別 収 量 11

14 頭 数 / 葉 1 枚 /25 6/ 研 究 成 果 6/8 6/15 6/22 図 3 ア ブ ラ ム シ の 発 生 状 況 4~ 5 月 に 播 種 を 行 うと 収 量 が 多 く アブラムシの 影 響 も 尐 なく 加 工 用 原 料 の 栽 培 に 適 し て い る こ と が 明 ら か に な っ た 6/29 7/6 7/13 7/20 7/27 8/3 8/10 8/ 今 後 の 課 題 と 取 組 本 試 験 で は 主 に ア ブ ラ ム シ の 発 生 が 認 め ら れ た が 現 地 の 状 況 に よ り 他 の 病 害 虫 の 発 生 も 懸 念 さ れ る た め 栽 培 期 間 中 は 留 意 す る 必 要 が あ る 12

15 BAHmg 相 当 量 /100gFW Trolox nmol/100gfw 2 タデの 品 種 別 および 生 育 時 期 別 成 分 含 量 と 機 能 性 の 評 価 2-2 品 種 および 生 育 時 期 別 機 能 性 の 評 価 福 岡 県 農 業 総 合 試 験 場 研 究 員 水 田 一 枝 専 門 研 究 員 山 下 純 隆 食 品 流 通 部 長 許 斐 健 治 研 究 員 馬 場 紀 子 研 究 員 池 田 浩 暢 プ ロ ジ ェ ク ト 全 体 に お け る 本 研 究 開 発 部 分 の 位 置 づ け 生 育 時 期 別 の 機 能 性 に つ い て 評 価 し 機 能 性 の 高 い 収 穫 時 期 を 明 ら か に す る 目 標 と 目 的 2-1 と 関 連 し て 生 育 時 期 ご と の 抗 酸 化 能 や 成 分 含 量 の 違 い を 明 ら か に す る 実 験 方 法 お よ び 実 験 条 件 抗 酸 化 性 は β -カ ロ テ ン 退 色 法 お よ び DPPH ラジカル 消 去 法 で 評 価 した タデ 中 のルテ インおよびβ- カロテン 含 量 は 満 田 らの 分 析 法 (1) に 準 じて 溶 媒 で 抽 出 後 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー ( 島 津 製 作 所 ) で 測 定 し た 実 験 結 果 タ デ の 生 育 が 進 む に つ れ て β -カ ロ テ ン 退 色 法 お よ び DPPH ラジカル 消 去 法 に よ る 抗 酸 化 性 は 高 く な っ た( 図 1 ) 植 物 体 の 部 位 別 で は い ず れ の 生 育 時 期 で も 葉 の 抗 酸 化 性 が 高 か っ た( 図 2 ) ま た タ デ の 葉 に は ル テ イ ン と β - カ ロ テ ン が 含 ま れ 生 育 時 期 が 進 む に つ れ て 含 有 量 は 増 加 し た ( 図 3) β -カロテン 退 色 法 DPPHラジカル 消 去 法 播 種 後 日 数 ( 日 ) 図 1 生 育 時 期 別 の 抗 酸 化 性

16 mg/100gfw BHA 相 当 量 (mg/100gfw) 根 茎 葉 播 種 後 日 数 ( 日 ) 図 2 植 物 の 部 位 別 の 抗 酸 化 性 ルテイン β-カロテン 芽 タ デ 播 種 後 日 数 ( 日 ) 図 3 生 育 時 期 別 の ル テ イ ン お よ び β - カ ロ テ ン 含 量 研 究 成 果 タ デ は 生 育 日 数 が 多 い ほ ど 抗 酸 化 性 が 高 く な る こ と が 明 ら か と な っ た ま た タ デ は ル テ イ ン を 豊 富 に 含 み 生 長 さ せ る と さ ら に 含 量 は 高 く な る こ と が 明 ら か と な っ た 今 後 の 課 題 と 取 組 本 研 究 成 果 で は 生 育 ス テ ー ジ 別 の 機 能 性 に つ い て β - カ ロ テ ン 退 色 法 DPPH ラジカ ル 消 去 法 カ ロ テ ノ イ ド 含 量 か ら 評 価 し た が タ デ の 機 能 性 成 分 で あ る イ デ イ ン や ケ ル シ ト リ ン 等 の 含 量 変 化 に つ い て 検 討 す る こ と も 今 後 必 要 と 考 え ら れ る 参 考 文 献 引 用 文 献 (1) 高 速 液 体 クロマトグラフィーによる 野 菜 のカロテノイドおよびクロロフィルの 同 時 分 析 満 田 幸 恵 新 本 洋 士 小 堀 真 珠 子 津 志 田 藤 二 郎 日 本 食 品 科 学 工 学 会 誌 第 49 号 第 7 巻 (2002) 14

17 3 機 能 性 成 分 の 特 定 と 生 体 調 整 機 能 の 解 明 3-1 芽 タデの 機 能 性 成 分 の 同 定 と 定 量 法 の 開 発 福 岡 県 工 業 技 術 セ ン タ ー 生 物 食 品 研 究 所 機 能 材 料 課 小 野 昌 志 芽 タ デ の 機 能 性 成 分 の 同 定 と 定 量 法 に 関 す る 研 究 開 発 芽 タ デ が 有 す る 循 環 系 改 善 機 能 ( 血 液 サ ラ サ ラ 効 果 ) を は じ め と す る 生 理 活 性 の 発 現 元 と な る 物 質 を 明 ら か に す べ く そ の 成 分 研 究 を 実 施 し た 本 サ ブ テ ー マ で の 検 討 項 目 1. 芽 タ デ エ キ ス の 抽 出 2. 抽 出 エ キ ス 中 の 機 能 性 成 分 の 分 離 精 製 3. 抗 酸 化 活 性 測 定 に よ る 機 能 性 成 分 の 同 定 4. 試 作 製 品 中 の 機 能 性 成 分 の 分 析 プ ロ ジ ェ ク ト 全 体 に お け る 本 研 究 開 発 部 分 の 位 置 づ け 本 プ ロ ジ ェ ク ト が 開 始 す る に あ た り 研 究 グ ル ー プ 内 で 芽 タ デ を 摂 取 す る と 赤 血 球 変 形 能 改 善 効 果 高 血 糖 値 低 下 効 果 お よ び 血 液 中 の コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 効 果 を 見 い だ し て い た 芽 タ デ を 使 用 し た 健 康 補 助 食 品 を 開 発 す る た め に は そ の 機 能 を 発 現 す る 元 と な る 物 質 を 明 ら か に す る 必 要 が あ る 目 的 と 目 標 タ デ は そ の 全 草 は 水 蓼 ( す い り ょ う )と い う 名 の 漢 方 薬 で あ り 古 来 か ら 利 尿 解 熱 虫 さ さ れ 食 あ た り へ の 効 能 効 果 で 民 間 薬 と し て 利 用 さ れ て き た ま た 蓼 食 う 虫 も 好 き 好 き という 諺 も あ る よ う に そ の 成 分 中 に は ポ リ ゴ ジ ア ー ル を は じ め と す る 昆 虫 摂 食 阻 害 作 用 を 有 す る 辛 み 成 分 が 含 ま れ て い る こ と が 報 告 さ れ て い る た だ こ れ ま で の 報 告 は 大 き く 成 長 し た 草 本 の 含 有 成 分 で あ り 今 回 我 々 グ ル ー プ が 対 象 と す る 幼 芽 ( ス プ ラ ウ ト ) の 成 分 に 関 す る も の は ほ と ん ど な い 今 回 健 康 補 助 食 品 開 発 に あ た り そ の 有 効 成 分 を 明 ら か に す る た め 幼 芽 の 成 分 の 調 査 を 開 始 し た ま た 単 離 し た 物 質 に 関 し て 血 液 サ ラ サ ラ 効 果 と 相 関 関 係 が 見 ら れ た 抗 酸 化 性 に つ い て ラ ジ カ ル 捕 捉 効 果 を 指 標 に 調 査 し 製 品 中 に 含 ま れ る 生 理 活 性 物 質 を 明 ら か に す る こ と を 目 標 に 実 験 を 開 始 し た 実 験 方 法 および 実 験 条 件 ( 1 ) 芽 タ デ エ キ ス の 抽 出 製 品 の 抽 出 法 が 決 定 し て い な い 時 期 に 抽 出 操 作 を 実 施 し た た め 芽 タ デ 成 分 の 大 部 分 が 抽 出 可 能 と 期 待 さ れ る 50%エ タ ノ ー ル を 抽 出 溶 媒 と し て 選 択 し た 凍 結 乾 燥 済 み の 芽 タ デ( JA 筑 前 朝 倉 産 四 季 紅 )1.5kg を ス テ ン レ ス 製 容 器 に 入 れ 50% エ タ ノ ー ル( 30L)を 注 ぎ 込 み 室 温 で 6 時 間 攪 拌 抽 出 を 行 っ た 濾 過 し た 後 エ バ ポ レ ー 15

18 タ( 水 浴 温 度 40 )で エ タ ノ ー ル を 減 圧 留 去 し た 濃 縮 し た エ キ ス( 容 量 0.6L)に 純 水 ( 3L) を 加 え て 凍 結 乾 燥 を 行 っ た 抽 出 残 渣 は 同 様 の 手 法 で 再 抽 出 を 行 っ た 2 回 目 に 使 用 した 50%エ タ ノ ー ル は 15L 抽 出 時 間 は 16 時 間 である ( 2 ) 分 離 精 製 前 項 で 得 ら れ た エ キ ス の 一 部 を 50%メ タ ノ ー ル に 溶 解 し ヘ キ サ ン と 分 配 し 脱 脂 を 行 った 50%メ タ ノ ー ル 層 の メ タ ノ ー ル を ロ ー タ リ ー エ バ ポ レ ー タ で 蒸 発 さ せ た 後 ア ン バ ー ライト XAD-2( オ ル ガ ノ 社 製 ) へ 加 え 吸 着 し な い 糖 や ア ミ ノ 酸 無 機 物 質 と い っ た 水 溶 性 成 分 を 洗 い 流 し た ア ン バ ー ラ イ ト に 吸 着 し た 成 分 は メ タ ノ ー ル で 溶 出 さ せ 溶 出 液 を 濃 縮 し 粗 精 製 エ キ ス を 得 た 粗 精 製 エ キ ス は 再 び 水 に 溶 解 し た 後 ク ロ ロ ホ ル ム 酢 酸 エ チ ル の 順 に 分 配 を 行 い ク ロ ロ ホ ル ム 可 溶 成 分 酢 酸 エ チ ル 可 溶 成 分 水 溶 性 成 分 の 3 つ に 分 配 し た 各 分 配 エ キ ス を シ リ カ ゲ ル カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 等 各 種 ク ロ マ ト グ ラ フ の 操 作 に よ り 分 離 精 製 を 進 め て い っ た タデ 50%エ タ ノ ー ル エ キ ス 脱 脂 操 作 50%メタノール アンバーライト XAD-2- メ タ ノ ー ル で 吸 着 成 分 を 溶 出 ヘキサン 非 吸 着 成 分 吸 着 成 分 有 機 溶 媒 に よ る 分 離 操 作 ク ロ ロ ホ ル ム 可 溶 成 分 酢 酸 エ チ ル 可 溶 成 分 水 溶 性 成 分 各 種 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ る 分 離 精 製 操 作 シ リ カ ゲ ル カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー ( ク ロ ロ ホ ル ム - メ タ ノ ー ル ) ODS カラムクロマトグラフィー(メタノール- 水 ) ( 3 ) 抗 酸 化 活 性 評 価 DPPH( 1,1-diphenylpicryl-hydrazyl 図 1 )の ラ ジ カ ル 消 去 活 性 を 指 標 に 抗 酸 化 性 評 価 を 行 っ た 手 法 は 独 立 行 政 法 人 食 品 総 合 研 究 所 の ホ ー ム ペ ー ジ に 記 載 さ れ て い る 方 法 ( 参 考 に し 以 下 の 手 順 で 行 った 16

19 手 順 1. 試 験 管 に 希 釈 済 み の サ ン プ ル 200μ L を 入 れ る 2.0.1M Tris 緩 衝 液 ( ph 7.4) 800μ L で サ ン プ ル を 希 釈 す る 3.500μ M DPPH エ タ ノ ー ル 溶 液 を 1mL 加 え よ く 攪 拌 す る 4. 室 温 暗 所 で 20 分 間 反 応 させる 5.517nm の 吸 光 度 を 測 定 す る 6. 濃 度 と 吸 光 度 の 減 尐 率 を プ ロ ッ ト し て 最 小 二 乗 法 で 傾 き を 求 め る 7. 各 サ ン プ ル の 活 性 の 強 さ を ポ ジ テ ィ ヴ コ ン ト ロ ー ル の α - ト コ フ ェ ロ ー ル 50μ M の 活 性 に 換 算 する N N O 2 N NO 2 図 1 DPPH( 1,1-diphenylpicryl-hydrazyl) NO 2 ( 4 ) ド リ ン ク 中 の フ ラ ボ ノ イ ド の 定 量 クロレラ 工 業 ( 株 )が ド リ ン ク 製 品 に 利 用 し て い る ク エ ン 酸 抽 出 物 に つ い て イ ソ ケ ル シ ト リ ン 等 の 単 離 し た フ ラ ボ ノ イ ド の 存 在 に つ い て 以 下 の 方 法 で 確 認 を 行 っ た 手 順 1.ク エ ン 酸 抽 出 物 を 20mL ア ン バ ー ラ イ ト XAD2(φ1cm 20cm)に 通 し 蒸 留 水 500mL で 洗 う 2. 吸 着 成 分 を メ タ ノ ー ル 500mL で 洗 い 流 し 濃 縮 凍 結 乾 燥 す る 3. 残 渣 の 一 部 を メ タ ノ ー ル に 溶 解 後 ボ ン ド エ ル ー ト C18( 1mL)に 通 し HPLC および LC/MS の サ ン プ ル と す る 4.HPLC および LC/MS で 分 析 す る HPLC は LC-10AD( 送 液 ポ ン プ ) を は じ め と す る シ ス テ ム ( ( 株 ) 島 津 製 作 所 製 ) を 使 用 し LC/MS は ( 株 ) 久 留 米 リ サ ー チ パ ー ク の 施 設 を 使 用 し て 測 定 を 行 っ た ( 図 2) そ れ ぞ れ の 分 析 条 件 は 以 下 の 通 り で あ る HPLC 分 析 条 件 カラム:Wakosil-II5C18 φ 4.6mm 250mm( 和 光 純 薬 工 業 ( 株 ) 製 ) 流 速 :1mL/min 検 出 波 長 :270nm 移 動 相 :0.1% TFA- ア セ ト ニ ト リ ル 17

20 溶 媒 比 : 0~ 10min ま で ア セ ト ニ ト リ ル 10% 10~ 20min まで 20% 20~ 30min まで 30% 30~ 40min まで 50% 注 入 量 : 20μ L LC/MS 分 析 条 件 イオン 化 法 :APCI+ カラム:Wakosil-II5C18 φ 4.6mm 250mm( 和 光 純 薬 工 業 ( 株 ) 製 ) 流 速 :1m L/min 検 出 波 長 : 270nm 移 動 相 :0.1% TFA: ア セ ト ニ ト リ ル 溶 媒 比 :0~ 15min ま で ア セ ト ニ ト リ ル 25% 15~ 30min まで 70% 注 入 量 :10μ L 図 2 分 析 に 使 用 し た LC/MS (( 株 ) 久 留 米 リ サ ー チ パ ー ク ) ドリンク 試 作 品 中 に 含 ま れ る イ ソ ケ ル シ ト リ ン の 定 量 は 以 下 の 手 法 で 行 っ た 手 順 1.ドリンク20mLを ア ン バ ー ラ イ ト XAD2(φ1cm 20cm) に 通 し 蒸 留 水 500mLで 洗 う 2. 吸 着 成 分 を メ タ ノ ー ル 500mLで 洗 い 流 す 3. メ タ ノ ー ル 溶 出 成 分 を エ バ ポ レ ー タ で 濃 縮 4. 濃 縮 サ ン プ ル を メ タ ノ ー ル に 再 溶 解 し メ ス フ ラ ス コ で 10mLと し 定 量 サ ン プ ル と す る 5. イ ソ ケ ル シ ト リ ン 標 準 サ ン プ ル を 作 り メ タ ノ ー ル 溶 液 と し た 標 準 サンプルは23.6mg/100mLの 溶 液 を 倍 に 希 釈 し た イ ソ ケ ル シ ト リ ン の 分 子 イオン 465の ピ ー ク の 面 積 に よ り 検 量 線 を 作 成 し 濃 度 を 計 算 し た 18

21 LC/MS 条 件 イオン 化 法 :APCI+ カラム:Mightysil aqua φ 4.6mm 250mm( 関 東 科 学 ( 株 ) 製 ) 流 速 :1m L/min 移 動 相 :0.1% TFA- ア セ ト ニ ト リ ル 溶 媒 比 : 0 ~ 15min ま で ア セ ト ニ ト リ ル 10% 10.1~ 20minまで 20% 20.1~ 30minまで 30% 30.1~ 50min まで 50% ( 5 ) フ ラ ボ ノ イ ド 以 外 の 物 質 に つ い て フ ラ ボ ノ イ ド 以 外 の 機 能 性 物 質 の 発 見 を 目 指 し 芽 タ デ の 辛 み 成 分 タ デ オ ナ ー ル の 探 索 を 行 っ た 芽 タ デ の メ タ ノ ー ル 抽 出 物 を 調 製 し ヘ キ サ ン 可 溶 成 分 を 精 製 し た ま た ( 1 ) で 調 製 し た 50%エ タ ノ ー ル 抽 出 物 か ら ア ン ト シ ア ニ ン 色 素 を 精 製 し HPLC に よ る 分 析 を 行 っ た 実 験 結 果 ( 1 ) 芽 タ デ エ キ ス の 抽 出 1 回 目 の 抽 出 では 233.9g( 15.6%) 2 回 目 の 抽 出 で は 198.1g( 13.2%)の 深 紫 色 の 粉 末 が 得 られた 3 回 目 の 抽 出 を 行 っ た が 2 回 の 操 作 と 比 較 し ほ と ん ど エ キ ス は 得 ら れ ず 50% エ タ ノ ー ル に よ る 芽 タ デ の 抽 出 で は 約 30%の 収 率 で 抽 出 エ キ ス が 得 ら れ る こ と が 分 か っ た ( 2 ) 分 離 精 製 各 種 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り 以 下 の フ ラ ボ ノ イ ド が 単 離 さ れ た ほ と ん ど フ ラ ボ ノ ー ル 骨 格 を 持 つ フ ラ ボ ノ イ ド で あ り 主 要 物 質 は ケ ル セ チ ン - グ ル コ シ ド で あ る イ ソ ケ ル シ (1 ト リ ン で あ っ た 各 物 質 の NMR および MS ス ペ ク ト ル に 関 し て は 過 去 の 文 献 2) と 照 らし 合 わせた 新 規 物 質 の 単 離 を 期 待 し て い た が こ れ ま で に 報 告 の あ る 成 長 草 本 の も の に あ る も の ば か り と い う 残 念 な 結 果 と な っ た 各 物 質 の 機 器 分 析 デ ー タ お よ び 収 量 ( 粗 エ キ ス 120g からの 量 ) は 以 下 の 通 り で あ る HO O OH OH イ ソ ケ ル シ ト リ ン 収 量 : 4.44g 1 H NMR(DMSO-d6,TMS) : (m, sugar H), 4.44 (brs, 1H, OH), 4.85 (brs, 1H, OH), 5.13 (brs, 1H, OH), 5.38 (d, J = 7.8 Hz, 1H anomeric H), 6.20 (d, J = 2.0 Hz, OH O O-Glc 1H, C 6 H), 6.40 (d, J = 2.0 Hz, 1H, C 8 H), 6.82 (d, J = 8.3 Hz, 1H, C 5 H), 7.53 (d, J = 2.0 Hz, 1H, C 2 H), 7.67 (dd, J = 2.0, 8.3Hz, 1H, C 6 H), (s, 1H, C 5 OH). MS(FAB) m/z 465(MH+) 303( 465-glucose) 19

22 ケ ル セ チ ン - ア ラ ビ ノ シ ド 収 量 :895 mg OH OH 1 H NMR(CD 3 OD) : 3.43(dd, J = 2.9, 13.2 Hz, 1H, one of C 5 H), 3.64 (dd, J = 2.9, 8.3 Hz, 1H, C 3 H), 3.80 (ddd, HO OH O O O-Ara J = 2.9, 2.9, 3.4 Hz, C 4 H), 3.82 (dd, J = 2.9, 13.2 Hz, 1H, one of C 5 H), 3.89 (dd, J = 6.3, 8.3 Hz, 1H, C 2 H), 5.15 (d, J = 6.3 Hz, 1H, C 1 H) 6.19 (d, J = 2.0 Hz, 1H, C 8 H), 6.39 (d, J = 2.0 Hz, 1H, C 6 H), 6.86 (d, J = 8.3 Hz, 1H, C 5 H), 7.57(dd, J = 2.0, 8.3 Hz, 1H, C 6 H), 7.74 (d, J = 2.0 Hz, 1H, C 2 H). MS(FAB) m/z 435(MH+), 303(quercetin+1) OMe OH ケルセチン-3,7- ジ メ チ ル エ ー テ ル ( ラ ム ナ ジ ン ) 収 量 : 108 mg MeO OH O O OH 1 H NMR(DMSO-d6,TMS) : 3.86 (s, 3H, OMe), 3.88 (s, 3H, OMe), 6.36 (d, J = 2.0 Hz, 1H, C 6 H), 6.79 (d, J = 2.0 Hz, 1H, C 8 H), 6.95 (d, J = 8.3 Hz, 1H, C 5 H), 7.75 (dd, J = 2.0, 8.3 Hz, 1H, C 6 H) 7.79 (d, J = 2.0 Hz, 1H, C 2 H), (s, 1H, C 5 OH). MS(FAB) m/z 331(MH+) OH OMe ケルセチン 4'- メ チ ル エ ー テ ル ( タ マ リ キ セ チ ン ) 収 量 : 28 mg HO OH O O OH 1 H NMR(DMSO-d6,TMS) : 3.84 (s, 3H, OMe), 4.04 (s, 1H, OH), 6.18 (d, J = 2.0 Hz, 1H, C 6 H), 6.46 (d, J = 2.0 Hz, 1H, C 8 H), 6.94 (d, J = 8.8 Hz, 1H, C 5 H), 7.68 (dd, J = 2.0, 8.8 Hz, 1H, C 6 H) 7.75 (d, J = 2.0 Hz, 1H, C 2 H), (s, 1H, C 5 OH). MS(FAB) m/z 317(MH+) ケルセチン 収 量 : 602 mg ( 3 ) 抗 酸 化 活 性 評 価 DPPH( 1,1-diphenylpicryl-hydrazyl)の ラ ジ カ ル 消 去 活 性 を 指 標 に 抗 酸 化 性 評 価 の 結 果 を 表 1 に 示 す 単 離 さ れ た フ ラ ボ ノ イ ド は ソ バ に 多 く 含 ま れ る ル チ ン と 比 較 し て 若 干 強 い 抗 酸 化 活 性 が あ る こ と が 分 か っ た 20

23 表 1 単 離 し た フ ラ ボ ノ イ ド の DPPH ラ ジ カ ル 消 去 活 性 トコフェロール 50μ M と 同 活 性 の 濃 度 (mg/l) HO O OH OH イ ソ ケ ル シ ト リ ン 11.3 OH O O-Glc HO OH O O OH O-Ara OH ケルセチン- アラビノシド 10.9 HO O OH OH ケルセチン 4.89 OH O OH MeO O OMe OH ラムナジン 15.2 OH O OH ルチン 15.2 ( 4 ) ド リ ン ク 中 の フ ラ ボ ノ イ ド の 定 量 ク エ ン 酸 抽 出 物 の 分 析 HPLC 図 3のチャートで 17 分 付 近 に あ る ピ ー ク は イ ソ ケ ル シ ト リ ン の ピ ー ク と 一 致 し た 図 3 ク エ ン 酸 抽 出 物 の HPLC チャート 21

24 19 分 付 近 にあるピークは ケルセチン-アラビノシド の も の で あ る 37 分 の ピ ー ク は ケ ルセチンのメ チ ル エーテルと ほ ぼ 一 致 し た ケ ル セ チ ン の ピ ー ク は 確 認 さ れ ず ほ と ん ど 含 ま れ て い な い こ と が 分 か っ た 図 4 ク エ ン 酸 抽 出 物 の LC/MS チャート LC/MS HPLC で イ ソ ケ ル シ ト リ ン で あ る と 推 定 さ れ た 物 質 の イ オ ン ピ ー ク は 465 で あ り( 図 4 ) LC/MS で も イ ソ ケ ル シ ト リ ン と 一 致 を み た し た が っ て 試 作 品 中 に も イ ソ ケ ル シ ト リ ン が 含 ま れ て い る こ と が 分 か る 残 念 な が ら ケ ル セ チ ン - ア ラ ビ ノ シ ド ケ ル セ チ ン の メ チ ル エ ー テ ル に 関 し て は 良 好 なイオ ン ピ ー ク が 得 ら れ な か っ た ド リ ン ク 試 作 品 中 に 含 ま れ る イ ソ ケ ル シ ト リ ン の 定 量 イ ソ ケ ル シ ト リ ン の ピ ー ク に 対 応 す る 分 子 イ オ ン 465 を 抽 出 したチャートを 図 5に 示 す ピ ー ク の 面 積 よ り 算 出 し た 検 量 線 よ り ド リ ン ク 1 本 ( 100mL) 中 に 含 ま れ る イ ソ ケ ル シ ト リンの 量 は 2.24mg と 計 算 さ れ た 図 5 ド リ ン ク 試 作 品 の LC/MS 分 子 イオン 465 のチャート 22

25 ( 5 ) フ ラ ボ ノ イ ド 以 外 の 物 質 に つ い て ヘ キ サ ン 可 溶 成 分 を 調 査 し た が 十 分 な 量 の タ デ オ ナ ー ル を 単 離 す る こ と は 出 来 な か っ た ア ン ト シ ア ニ ン 色 素 は 標 品 と の 比 較 に よ り イ デ イ ン で あ る こ と を 確 認 し た CHO CHO HO O + OH OH H OH O Gal タデオナール イ デ イ ン 研 究 成 果 本 研 究 で は 以 下 の 成 果 を 上 げ た 1. 芽 タ デ の 抽 出 エ キ ス よ り イ ソ ケ ル シ ト リ ン を は じ め と す る ケ ル セ チ ン 配 糖 体 や ケ ル セ チ ン 誘 導 体 を 単 離 し た 2. 上 記 物 質 の 抗 酸 化 性 を DPPH を 使 用 し た 捕 捉 活 性 ラ ジ カ ル に よ り 評 価 し ソ バ に 多 く 含 ま れ て い る ル チ ン と 比 較 し て 若 干 強 い 活 性 を 見 い だ し た 3. 試 作 ド リ ン ク 中 の イ ソ ケ ル シ ト リ ン の 含 有 量 を 調 査 し 1 本 (100mL)あ た り 2.24mg の イ ソ ケ ル シ ト リ ン を 含 有 し て い る こ と を 確 認 し た 本 分 析 法 は ド リ ン ク 製 品 の 品 質 管 理 に も 役 立 て る こ と が 出 来 る 4. イ ソ ケ ル シ ト リ ン や イ デ イ ン は 共 同 研 究 機 関 に 提 供 し 血 液 レ オ ロ ジ ー 改 善 機 能 や 血 小 板 凝 集 阻 害 効 果 が あ る こ と も 見 い だ さ れ た 今 後 の 課 題 と 取 組 本 研 究 で は 数 種 類 の 機 能 性 フ ラ ボ ノ イ ド を 単 離 し 抗 酸 化 性 評 価 を 実 施 し 他 機 関 の 協 力 に よ り 血 液 レ オ ロ ジ ー 改 善 機 能 や 血 小 板 凝 集 阻 害 効 果 に つ い て も 確 認 す る こ と が 出 来 た た だ こ れ ら の デ ー タ は 全 て in vitro の 実 験 結 果 で あ り 動 物 実 験 臨 床 実 験 の デ ー タ で は な い 今 後 一 番 の 課 題 は in vivo の 実 験 へ の 展 開 で あ る ま た 機 能 性 成 分 分 析 に 関 し て も イ ソ ケ ル シ ト リ ン の み に つ い て で あ り 多 成 分 分 析 に 対 応 さ せ る こ と が 必 須 で あ る 更 に 錠 剤 や カ プ セ ル と い っ た 液 体 で な い 製 品 開 発 も 予 定 さ れ て お り 固 体 粉 末 製 品 の 成 分 分 析 法 の 開 発 も 課 題 で あ る こ の 3 点 を 中 心 に 今 後 取 り 組 んでいきたいと 考 え ている 参 考 文 献 引 用 文 献 (1) Haraguchi, H., Hashimoto, K., Yagi, A., J. Agri. Food Chem. 40, , (2) Arima, M., Danno, G., Biosci. Biotechnol. Biochem., 66(8), ,

26 3 機 能 性 成 分 の 特 定 と 生 体 調 整 機 能 の 解 明 3-2 タデ 抗 酸 化 成 分 の 抽 出 分 画 と 分 析 並 びに ヒト 赤 血 球 変 形 能 低 下 抑 制 物 質 の 同 定 レ オ ロ ジ ー 機 能 食 品 研 究 所 顧 問 船 津 軍 喜 所 長 藤 野 武 彦 研 究 員 茂 田 陽 子 研 究 の 背 景 と プ ロ ジ ェ ク ト 全 体 に お ける 位 置 づ け 近 年 生 体 内 で 生 成 さ れ る 活 性 酸 素 や フ リ ー ラ ジ カ ル に よ る 組 織 の 酸 化 障 害 が 生 活 習 慣 病 の 発 症 や 進 行 に 関 与 す る こ と が 明 ら か に さ れ 植 物 ポ リ フ ェ ノ ー ル や フ ラ ボ ノ イ ド 類 が 注 目 さ れ て い る 疫 学 調 査 に よ り フ ラ ボ ノ イ ド の 摂 取 が 冠 動 脈 心 疾 患 を 予 防 す る 可 能 性 が 示 さ れ 現 に 水 溶 性 で 生 体 吸 収 性 の 高 い プ ロ ア ン ト シ ア ニ ジ ン を 主 体 と す る ブ ド ウ 種 子 抽 出 物 が 血 管 治 療 薬 と な っ て い る 朝 倉 地 区 で 多 量 に 生 産 さ れ る 紅 タ デ の 芽 タ デ は イ デ イ ン と 呼 ばれるアントシアニン 系 の 紅 色 の 色 素 を 41.5μg/100g ポ リ フ ェ ノ ー ル 類 を 230mg/100g と 多 量 に 含 み 高 い 抗 酸 化 活 性 を 有 す る こ と か ら 循 環 器 疾 患 の 予 防 の た め の 新 たな 健 康 補 助 食 品 素 材 と し て 期 待 さ れ る 本 課 題 では タ デ に 含 ま れ る 抗 酸 化 成 分 の 抽 出 法 と 分 画 法 に つ い て 検 討 し さ ら に 各 画 分 に 含 ま れ る 抗 酸 化 成 分 の 分 析 を 行 う と と も に プ ロ ジ ェ ク ト の 最 大 目 標 の 1 つ で あ る 赤 血 球 変 形 能 を 改 善 す る 抗 酸 化 成 分 を 明 ら か に し こ れ ら 成 分 を 含 む 健 康 補 助 食 品 の 開 発 に 資 す る こ と を 目 標 と し た 目 的 と 目 標 本 研 究 は 我 々 が 開 発 し た 高 濃 度 酢 酸 処 理 と 希 酢 酸 -エ タ ノ - ル 抽 出 法 を 用 い て 芽 タ デ お よ び 成 長 タ デ か ら 抗 酸 化 成 分 を 抽 出 そ れ ら の 抗 酸 化 活 性 と 成 分 の 分 析 を 行 な う と と も に ヒ ト 赤 血 球 の 変 形 能 低 下 を 抑 制 す る 成 分 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と す る 実 験 方 法 および 実 験 条 件 (1) 材 料 細 葉 紅 タ デ の 芽 タ デ 四 季 紅 は 筑 前 あ さ く ら 農 業 協 同 組 合 よ り 成 長 タ デ は 福 岡 県 農 業 総 合 試 験 場 よ り 供 与 さ れ た も の を 用 い た (2)ゲル 濾 過 凍 結 乾 燥 した AcOH 抽 出 物 ま た は フ ェ ノ - ル 酸 含 有 画 分 を 1% 酢 酸 溶 液 に 溶 解 し 遠 心 分 離 し て 得 ら れ た 上 清 を 予 め 1% 酢 酸 溶 液 で 洗 浄 し た Bio-Gel P-10カ ラ ム ま た は Bio-Gel P-2 カラムに 供 し 1% 酢 酸 溶 液 で 展 開 し た 溶 出 液 は ド ロ ッ ブ カ ウ ン タ ー を 用 い て 一 定 量 ず つ 分 取 した 24

27 ( 3 ) リ ノ ー ル 酸 の 酸 化 に 対 す る 抗 酸 化 活 性 の 測 定 リ ノ ー ル 酸 の 酸 化 物 が β -カ ロ テ ン を 退 色 さ せ る 作 用 を 利 用 し た Miller ら の 方 法 に 準 じ て 行 っ た す な わ ち 試 料 液 0.1ml を 分 注 し た 分 光 光 度 計 用 試 験 管 セ ル に リ ノ ー ル 酸 - β -カロテン 溶 液 4.9ml を 加 え て 撹 件 し 50 の 恒 温 槽 で 一 定 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 場 合 のβ-カ ロ テ ン の 退 色 度 を 470nm の 吸 光 度 に よ っ て 求 め 試 料 を 加 え な い 場 合 の 酸 化 度 を 100%と し て 酸 化 度 を 表 す か ま た は ブ チ ル ヒ ド ロ キ シ ア ニ ソ ー ル( BHA) 濃 度 に 換 算 し て 表 した ( 4 ) ラ ジ カ ル 捕 捉 活 性 の 測 定 DPPH( 1,1-ジ フ ェ ニ ル -2-ピ ク リ ル ヒ ド ラ ジ ル ) 溶 液 ( DPPH 400μ M:MES 200μ M:20%エタ ノール=1:1:1) 900μl に 80%エ タ ノ ー ル ( 300-a) μl と 試 料 a μl を 加 え 室 温 で 20 分 間 反 応 さ せ た 後 520nm で の 吸 光 度 の 減 尐 を 測 定 し ア ス コ ル ビ ン 酸 ( AsA) 濃 度 に 換 算 して 表 した ( 5 ) 赤 血 球 変 形 能 低 下 抑 制 能 の 測 定 37 に イ ン キ ュ ベ ー ト し た 6%ヒ ト 赤 血 球 浮 遊 液 5.34ml に 500mM の AAPH( 2.2'-アゾビス ( 2-ア ミ ジ ノ プ ロ パ ン ) 二 塩 酸 塩 ) 溶 液 0.6ml と 試 料 液 0.06ml を 加 え 37 で 45 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後 Nickel mesh filtration 法 によって 測 定 し その 変 形 能 は 対 照 液 の 流 量 に 対 す る 赤 血 球 浮 遊 液 の 流 量 ( %) を も っ て 表 し た ( 6 ) 逆 相 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ( HPLC) Waters 社 製 の HPLC 装 置 に Symmetry C18( 5μm) カラム( mm) を 取 り 付 け 溶 出 は 0.1%ト リ フ ル オ ロ 酢 酸 ( TFA) 溶 液 - 60%ア セ ト ニ ト リ ル( MeCN) 系 または MeCN:H 2 0(9:1) - 酢 酸 エ チ ル 系 を 用 い て 行 っ た ( 7 ) 吸 収 ス ペ ク ト ル の 測 定 試 料 を 1 % 酢 酸 溶 液 ま た は 80%エ タ ノ ー ル 溶 液 に 溶 解 し た 後 島 津 製 作 所 製 の 自 記 分 光 光 度 計 ( UV-2200A 型 ) を 用 い て 測 定 し た 実 験 結 果 ( 1 ) 成 分 の 抽 出 と 分 画 生 凍 結 乾 燥 ま た は 通 風 乾 燥 し た 材 料 を 高 濃 度 酢 酸 溶 液 で 処 理 し た 後 そ の 成 分 を 水 を 加 え て 抽 出 さ れ る 希 酢 酸 可 溶 画 分 ( AcOH 抽 出 物 ) と そ の 残 渣 か ら 50%エ タ ノ ー ル 溶 液 で 抽 出 さ れ る 画 分 ( E 50 抽 出 物 ) と に 分 画 し 残 り を E 50 抽 出 残 渣 と し た 得 ら れ た 2 つの 抽 出 物 の 収 量 を 表 1 に 示 す AcOH 抽 出 物 の 収 量 は 多 く の 水 溶 性 成 分 を 含 む ため E 50 抽 出 物 よ り 遙 か に 多 く また 通 風 乾 燥 し た 場 合 が 生 や 凍 結 乾 燥 し た 場 合 よ り 収 量 が 多 か っ た ま た 成 長 タ デ で は AcOH 抽 出 物 の 収 量 は 芽 タ デ よ り 尐 な い が E 50 抽 出 物 の 収 量 は 芽 タ デ よ り か な り 多 か っ た 25

28 表 1 芽 タ デ お よ び 成 長 タ デ 葉 か ら の AcOH 抽 出 物 と E 50 抽 出 物 の 収 量 材 料 使 用 量 AcOH 抽 出 物 E 50 抽 出 物 芽 タデ 凍 結 乾 燥 50g ( 100%) 11.93g(23.86%) 2.70g(5.40%) 通 風 乾 燥 30g(100%) 8.64g(28.80%) 1.62g(5.40%) 成 長 タデ 凍 結 乾 燥 30g(100%) 5.59g(18.63%) 2.23g(7.43%) 酢 酸 浸 漬 2Kg 80.5g ( 4.03%) 29.5g ( 1.48%) (1 年 4 ヶ 月 ) ( 2 ) 抽 出 物 の 抗 酸 化 活 性 上 で 得 られた AcOH 抽 出 物 と E 50 抽 出 物 の リ ノ ー ル 酸 の 酸 化 に 対 す る 抗 酸 化 活 性 と DPPH ラ ジ カ ル 捕 捉 活 性 を 図 1 に 示 す 芽 タ デ と 成 長 タ デ で は リ ノ ー ル 酸 酸 化 に 対 す る 抗 酸 化 作 用 に 於 い て 芽 タ デ E 50 抽 出 物 が 成 長 タデ E 50 抽 出 物 よ り 高 い 活 性 を 示 す 以 外 に は 大 差 は 見 ら れ な か っ た E 5 0 抽 出 物 は 抗 酸 化 活 性 も ラ ジ カ ル 捕 捉 活 性 も 高 か っ た AcOH 抽 出 物 ではリノール 酸 の 酸 化 に 対 しては 強 い 抗 酸 化 活 性 を 示 し た が DPPH ラ ジ カ ル 捕 捉 活 性 は 著 し く 低 か っ た 芽 タ デ の 場 合 通 風 乾 燥 し て も 凍 結 乾 燥 し て も 抗 酸 化 成 分 の 活 性 に は 余 り 影 響 な い こ と が わ か っ た ( 3 ) ポ リ フ ェ ノ - ル 成 分 の 分 析 AcOH 抽 出 物 と E 50 抽 出 物 か ら 得 ら れ た 50%エ タ ノ ー ル 可 溶 性 画 分 に 含 ま れ る ポ リ フ ェ ノ ール 成 分 を HPLC で 分 析 し た そ の HPLC パ タ ー ン を 図 2 に 示 す 得 られた 4 つの HPLC パターンと 各 ピークの 吸 収 ス ペ ク ト ル か ら 4 つ の 抽 出 物 に 含 ま れ 26

29 る ポ リ フ ェ ノ - ル 成 分 の 種 類 と 量 は 大 き く 異 な り 成 長 タ デ に は 芽 タ デ よ り 多 く の 種 類 の ポ リ フ ェ ノ ー ル 成 分 が 含 ま れ る こ と が わ か っ た 500nm に 吸 収 極 大 を 有 す る 紅 色 の シ ア ニ ジン( イ デ イ ン )は 芽 タ デ で は 両 抽 出 物 に 含 ま れ た が 成 長 タ デ に は 殆 ど 含 ま れ な か っ た E 50 抽 出 物 300mg に 水 を 加 え 希 NaOH 溶 液 で ph を 7 に す る と 芽 タ デ の 場 合 272mg(91%) 成 長 タデの 場 合 165mg(55%)が 溶 解 し 殆 ど 同 じ 抗 酸 化 活 性 を 示 し E 50 抽 出 物 に 含 ま れ る ポ リ フ ェ ノ ー ル の 多 く が 水 溶 性 で あ る こ と が わ か っ た (4) 芽 タデ AcOH 抽 出 物 成 分 の 分 離 芽 タデ AcOH 抽 出 物 500 mg を 1% 酢 酸 溶 液 に 溶 解 し 遠 心 分 雄 し て 得 ら れ た 上 清 を Bio-Ge1 P-10 カラムに 供 し 1% 酢 酸 溶 液 で 展 開 し た そ の ゲ ル 濾 過 パ タ ー ン を 図 3 に 示 す 19 画 分 に 分 画 した 後 収 量 と 抗 酸 化 活 性 を 測 定 した その 結 果 を そ れ ぞ れ 表 2 と 図 4 に 示 す 27

30 リノール 酸 酸 化 量 (%) 1111 図 3 芽 タデ AcOH 抽 出 物 の Bio-Gel P-10 カ ラ ム ( 4 45cm) に よ る ゲ ル 濾 過 ( 1% 酢 酸 溶 液 中 ) 表 2 芽 タデ AcOH 抽 出 物 の ゲ ル 濾 過 で 得 ら れ た 19 画 分 の 収 量 画 分 画 分 画 分 mg ( 46.74%) mg ( 7.76%) mg ( 0.58%) ( 9.32) (1.38) (3.34) ( 5.50) (0.52) (4.02) ( 3.02) (1.78) (0.88) ( 3.16) (0.80) (1.54) ( 0.98) (1.22) ( 3.32) (0.62) 合 計 486.2mg(97.24%) 対 照 画 分 図 4 芽 タデ AcOH 抽 出 物 のゲル 濾 過 で 得 られた 19 画 分 の 抗 酸 化 活 性 28

31 芽 タデ AcOH 抽 出 物 の 50% 以 上 は 画 分 1~ 3 の 高 分 子 領 域 に 溶 出 さ れ 紫 外 部 に 高 い 吸 収 を 有 す る 成 分 が ゲ ル に 対 す る 吸 着 性 の 違 い に よ り 分 離 さ れ た 強 い 抗 酸 化 活 性 は 画 分 7 ~ 9 の 低 分 子 領 域 と 画 分 に 認 め ら れ た が 吸 収 ス ペ ク ト ル 解 析 か ら 前 者 は 主 に フ ェ ノ ー ル 酸 を 後 者 は フ ラ ボ ノ イ ド を 含 む こ と が わ か っ た ( 5 ) 抗 酸 化 活 性 フ ェ ノ ー ル 酸 の 分 離 芽 タデ AcOH 抽 出 物 の Bio-Gel P-10 カラム( 6.5 9cm) ゲ ル 濾 過 に よ っ て 得 た フ ェ ノ ー ル 酸 含 有 画 分 を Bio-Gel P-2 カラム( 4 40cm) によるゲル 濾 過 と HPLC に 供 し て 抗 酸 化 活 性 フ ェ ノ ー ル 酸 を 分 離 し た そ の ゲ ル 濾 過 パ タ ー ン と 抗 酸 化 活 性 を 図 5 に 示 す 29

32 全 て の 画 分 に 抗 酸 化 活 性 が 認 め ら れ た が 管 数 50~ 80 と 110~ 150 では 抗 酸 化 活 性 は 高 か っ た が ラ ジ カ ル 捕 捉 活 性 は 低 く 一 方 管 数 85~ 105 で は ラ ジ カ ル 捕 捉 活 性 は 高 か っ た が 抗 酸 化 活 性 は な く 管 数 165~ 240 で は 両 活 性 と も 高 か っ た 11 画 分 に 分 画 し た 後 HPLC で 成 分 を 分 離 し 抗 酸 化 活 性 と 吸 収 スペクトルを 測 定 した 結 果 図 6に 示 すような 吸 収 ス ペ ク ト ル を 有 す る 抗 酸 化 活 性 成 分 が 得 ら れ 画 分 3 はアスコルビ ン 酸 画 分 ( 7+8)は ト リ プ ト フ ァ ン で あ っ た 図 6 フェノール 酸 含 有 画 分 から 得 られた 主 な 抗 酸 化 活 性 成 分 の 吸 収 スペクトル ( 6 ) ル テ イ ン 高 含 有 画 分 の 分 離 ルテインが 成 長 タデ 葉 の E 50 抽 出 残 渣 に 含 ま れ ア セ ト ン で は ク ロ ロ フ ィ ル や β -カロテ ン と と も に 抽 出 さ れ 80%エ タ ノ ー ル 溶 液 で は ク ロ ロ フ ィ ル や β -カ ロ テ ン は 余 り 抽 出 さ れ ないことが 見 い だ さ れ た 酢 酸 処 理 し た 成 長 タ デ 葉 粉 末 の ア セ ト ン 抽 出 物 を 減 圧 濃 縮 し て 得 ら れ た 不 溶 物 に 80%エ タ ノ ー ル 溶 液 を 加 え て 溶 解 し た 後 再 度 減 圧 濃 縮 し て 油 性 画 分 30

33 を 分 離 し 吸 収 ス ペ ク ト ル と HPLC パ タ ー ン を 調 べ た 結 果 図 7 に 示 す よ う に ル テ イ ン を 多 く 含 む こ と が わ か っ た ル テ イ ン 含 量 は 14.04%で 乾 燥 葉 か ら の 収 量 は 0.543%と 算 出 さ れた 得 ら れ た 油 性 画 分 を ル テ イ ン 高 含 有 画 分 と し て そ の リ ノ ー ル 酸 の 酸 化 に 対 す る 抗 酸 化 活 性 を 測 定 し た 結 果 1g 当 たり 65.8mg の BHA に 相 当 することがわかった ( 7 ) ヒ ト 赤 血 球 変 形 能 低 下 抑 制 物 質 の 同 定 芽 タデと 成 長 タ デ か ら 調 製 し た AcOH 抽 出 物 に つ い て 赤 血 球 変 形 能 低 下 抑 制 効 果 を 調 べ た 結 果 図 8 に 示 す よ う に 芽 タ デ AcOH 抽 出 物 に 抑 制 効 果 が あ る こ と が わ かった 31

34 ついで 芽 タデ AcOH 抽 出 物 か ら 分 離 し た フ ェ ノ ー ル 酸 画 分 と フ ラ ボ ノ イ ド 画 分 に つ い て 調 べ た 結 果 図 9 に 示 す よ う に フ ラ ボ ノ イ ド 画 分 に 抑 制 作 用 が あ る こ と が わ か っ た さ ら に フ ラ ボ イ ド 画 分 を HPLC に 供 し 成 分 の 分 離 を 行 っ た と こ ろ 図 10に 示 すよう に 2 つのピーク( a と b)が 得 ら れ い ず れ も AAPH による 赤 血 球 変 形 能 の 低 下 を 抑 制 した ピークaとピーク b の 吸 収 スペ ク ト ル を 図 11に 示 す が HPLC の 溶 出 位 置 や 質 量 分 析 の 結 果 と 併 せ て そ れ ぞ れ イ デ イ ン( シ ア ニ ジ ン -3-ガラクト シド)と イ ソ ケ ル シ ト リ ン( ケル セチン-3-グ ル コ シ ド ) と 同 定 さ れ た そ れ ら の 構 造 を 図 12に 示 す 32

35 3-2-5 研 究 成 果 我 々 が 開 発 し た 高 濃 度 酢 酸 処 理 と 酢 酸 - エ タ ノ ー ル 抽 出 法 を 用 い る こ と で 生 お よ び 成 長 タ デ か ら 安 定 且 つ 効 率 よ く 抗 酸 化 成 分 を 抽 出 分 画 で き る こ と が 明 ら か に な っ た ま た そ の 成 分 分 析 に よ り 芽 タ デ と 生 長 タ デ に 含 ま れ る 抗 酸 化 成 分 の 種 類 と 含 量 は か な り 異 な る こ と が 明 ら か に な っ た さ ら に 芽 タ デ に 含 ま れ る イ デ イ ン と イ ソ ケ ル シ ト リ ン が ヒ ト 赤 血 球 の 変 形 能 低 下 を 抑 制 す る こ と が 見 出 さ れ た 今 後 の 課 題 と 取 組 本 研 究 で 得 ら れ た 各 画 分 の 生 理 機 能 に つ い て 明 ら か に す る こ と 33

36 3 機 能 性 成 分 の 特 定 と 生 体 調 整 機 能 の 解 明 3-3 機 能 性 成 分 の 生 体 機 能 の 解 明 レ オ ロ ジ ー 機 能 食 品 研 究 所 所 長 藤 野 武 彦 顧 問 灘 修 身 研 究 員 武 田 誠 子 プ ロ ジ ェ ク ト 全 体 に お け る 本 研 究 開 発 部 分 の 位 置 づ け 紅 タ デ は 古 来 よ り 種 々 の 効 能 が 謳 わ れ て い る が そ の 医 学 的 検 証 は 全 く 行 わ れ て い な い 本 課 題 で は 紅 タ デ よ り 抽 出 さ れ た 機 能 性 成 分 の 医 学 的 機 能 性 と く に 生 理 学 的 機 能 に つ いて 評 価 する 目 的 と 目 標 紅 タ デ よ り 抽 出 さ れ た 機 能 性 成 分 に つ い て 動 物 お よ び ヒ ト を 対 象 に イ ン ビ ト ロ イ ン ビ ボ 実 験 を 行 い 赤 血 球 変 形 能 ( 血 液 サ ラ サ ラ 度 ) 改 善 能 血 糖 降 下 作 用 肝 機 能 改 善 能 コ レ ス テ ロ - ル 低 下 作 用 の 有 無 を 明 ら か に す る 実 験 方 法 お よ び 実 験 条 件 (1)STZ 糖 尿 病 ラ ッ ト ( 予 防 モ デ ル ) イ ン ビ ボ 実 験 1 材 料 及 び 実 験 方 法 10 週 齢 の Wistar 雄 ラット 24 匹 は 日 本 チ ャ ー ル ス リ バ ー 社 よ り ス ト レ プ ト ゾ シ ン(STZ) は シ グ マ 社 よ り MF 粉 末 飼 料 は オ リ エ ン タ ル 酵 母 工 業 よ り 購 入 し た 飲 水 は 水 道 水 を 自 由 摂 取 さ せ た 実 験 飼 料 は 芽 タ デ 酢 酸 抽 出 物 を 0.5% の 割 合 で MF 粉 末 に 混 合 し た も の を 用 い た 2 飼 料 及 び 飼 育 条 件 室 温 23±2 相 対 湿 度 50~ 60% 12 時 間 の 明 暗 サ イ ク ル( 7:00~ 19:00)の 環 境 下 で 1 週 間 の 予 備 飼 育 後 動 物 を 各 8 匹 の 3 群 に 分 けた Ⅰ 群 ( 正 常 対 照 ラット)には 4 週 間 30g/ 匹 / 日 の 割 合 で MF 粉 末 を 与 え た Ⅱ 群 ( STZ 投 与 - 実 験 飼 料 非 投 与 ラ ッ ト ) には 2 週 間 30g/ 匹 / 日 の 割 合 で MF 粉 末 を 与 え た 後 STZ(45mg/Kg)を 腹 腔 内 投 与 し 以 後 2 週 間 は 30g/ 匹 / 日 の 割 合 で MF 粉 末 を 与 え た Ⅲ 群 ( STZ 投 与 - 実 験 飼 料 餌 投 与 ラ ッ ト )に は 2 週 間 30g/ 匹 / 日 の 割 合 で MF を 与 えた 後 STZ(45mg/Kg)を 腹 腔 内 投 与 し 以 後 2 週 間 は 30g/ 匹 / 日 の 割 合 で 実 験 飼 料 を 与 え た 3 測 定 項 目 1. 経 過 観 察 1 ) 血 糖 値 ( 尾 静 脈 ) STZ 投 与 時 及 び 屠 殺 時 にグルテストエース R( 三 和 化 学 研 究 所 )を 用 い て エ ー テ ル 麻 酔 下 で 尾 静 脈 か ら 測 定 し た な お 測 定 前 日 17 時 より 絶 食 した 34

37 2) 体 重 入 荷 時 STZ 投 与 時 及 び 屠 殺 時 に 測 定 し た 2. 屠 殺 ネ ン ブ タ ー ル ( 大 日 本 製 薬 ) 麻 酔 下 で 屠 殺 し た 3. 血 液 検 査 腹 大 動 脈 か ら 採 血 し 血 液 一 般 生 化 学 検 査 ( 血 漿 ) 赤 血 球 変 形 能 ( 孔 径 :4.23μ m) を 測 定 した (1 2) (2)STZ 糖 尿 病 ラ ッ ト ( 治 療 モ デ ル ) イ ン ビ ボ 実 験 1 材 料 及 び 実 験 方 法 8 週 齢 の Wistar 雄 ラ ッ ト 32 匹 は 日 本 チ ャ ー ル ス リ バ ー 社 よ り ス ト レ プ ト ゾ シ ン(STZ) は シ グ マ 社 よ り MF 粉 末 飼 料 は オ リ エ ン タ ル 酵 母 工 業 よ り 購 入 し た 飲 水 は 水 道 水 を 自 由 摂 取 さ せ た 実 験 飼 料 は 芽 タ デ 酢 酸 抽 出 物 を 0.5% の 割 合 で MF 粉 末 に 混 合 したもの( 実 験 飼 料 A) 及 び 生 長 タデ 80% エ タ ノ ー ル 抽 出 物 を 0.1% 割 合 で MF 粉 末 に 混 合 し た も の ( 実 験 飼 料 B) を 用 い た 2 飼 料 及 び 飼 育 条 件 室 温 23±2 相 対 湿 度 50~ 60% 12 時 間 の 明 暗 サ イ ク ル( 7:00~ 19:00)の 環 境 下 で 1 週 間 の 予 備 飼 育 後 動 物 は 正 常 対 照 群 ( Ⅰ 群 )8 匹 と STZ 投 与 群 24 匹 に 分 け STZ 投 与 群 には STZ(80mg/Kg)を 腹 腔 内 投 与 し た Ⅰ 群 ( 正 常 対 照 ラ ッ ト )に は 4 週 間 30g/ 匹 / 日 の 割 合 で MF 粉 末 を 与 え た STZ 投 与 群 は 2 週 間 30g/ 匹 / 日 の 割 合 で MF 粉 末 を 与 え 血 糖 値 に 基 づ き 各 8 匹 ( Ⅱ ~ Ⅳ 群 ) に 分 け た Ⅱ 群 ( STZ 投 与 実 験 飼 料 非 投 与 ラット)には 2 週 間 30g/ 匹 / 日 の 割 合 で MF 粉 末 を 与 え た Ⅲ 群 ( STZ 投 与 実 験 飼 料 A 投 与 ラット)には 2 週 間 30g/ 匹 / 日 の 割 合 で 実 験 飼 料 A を 与 え た Ⅳ 群 ( STZ 投 与 実 験 飼 料 B 投 与 ラ ッ ト ) に は 2 週 間 30g/ 匹 / 日 の 割 合 で 実 験 飼 料 B を 与 えた 3 測 定 項 目 1. 経 過 観 察 1) 血 糖 値 ( 尾 静 脈 ) STZ 投 与 時 群 分 け 時 及 び 屠 殺 時 に グ ル テ ス ト エ ー ス R( 三 和 化 学 研 究 所 )を 用 い て エ ー テ ル 麻 酔 下 で 尾 静 脈 か ら 測 定 し た な お 測 定 前 日 17 時 よ り 絶 食 し た 2) 体 重 入 荷 時 STZ 投 与 時 及 び 屠 殺 時 に 測 定 し た 2. 屠 殺 ネ ン ブ タ ー ル ( 大 日 本 製 薬 ) 麻 酔 下 で 屠 殺 し た 3. 血 液 検 査 腹 大 動 脈 か ら 採 血 し 血 液 一 般 生 化 学 検 査 ( 血 漿 ) 赤 血 球 変 形 能 ( 孔 径 :4.23μ m) を 測 定 した (3) 赤 血 球 変 形 能 測 定 法 赤 血 球 の 直 径 は 約 8μ m で あ る が 自 己 の 直 径 よ り 細 い 管 を パ ラ シ ュ ー ト 状 さ ら に は 折 れ 曲 が っ て 変 形 し な が ら 通 過 し 得 る こ の 赤 血 球 の 変 形 す る 能 力 ( 赤 血 球 変 形 能 ) を 測 定 35

38 す る 血 管 モ デ ル と し て ニ ッ ケ ル メ ッ シ ュ を 用 い て 重 力 を 駆 動 力 と す る 重 力 式 ニ ッ ケ ル メ ッ シ ュ 透 過 法 を 用 い た (3 4 5) (4) 赤 血 球 変 形 能 測 定 法 ( 酸 化 モデル) 酸 化 ス ト レ ス に よ っ て 赤 血 球 変 形 能 が 低 下 す る 酸 化 モ デ ル を 作 成 し そ れ を ヒ ト 赤 血 球 に 応 用 した 酸 化 ス ト レ ス と し て は 2,2 -ア ゾ ビ ス ( 2-ア ミ ジ ノ プ ロ パ ン ) 二 塩 酸 基 ( AAPH) を 使 用 した ヒト 赤 血 球 は HEPES バ ッ フ ァ ー で 洗 浄 し HEPES バ ッ フ ァ ー で ヘ マ ト ク リ ッ ト を 調 整 し た AAPH 芽 タ デ も HEPES バ ッ フ ァ ー で 調 整 し た 最 終 濃 度 は 赤 血 球 液 3% AAPH 50mM と し た 赤 血 球 液 AAPH 液 と も に 37 5 分 間 プ レ イ ン キ ュ ベ ー ト し そ の 後 に AAPH を 赤 血 球 液 に 添 加 し 反 応 さ せ た 45 分 間 後 に 試 験 管 を 氷 に 入 れ 反 応 を 停 止 さ せ 変 形 能 測 定 前 に 7 分 間 25 におき 引 き 続 き 25 で 変 形 能 を 測 定 し た フ ィ ル タ ー は 5.35μ 孔 径 を 用 いた (5) 免 疫 機 能 ( TNF-α ) 測 定 法 ヒトの 静 脈 血 から 分 離 した 好 中 球 を タ デ 抽 出 物 を 添 加 し た 培 地 で 6 時 間 培 養 を 行 い TNF-α 産 生 促 進 効 果 の 有 無 を 調 べ た ま た 上 記 の 培 地 に LPS を 添 加 し て 好 中 球 に 刺 激 を 与 えて TNF-αを 大 量 に 産 生 する 条 件 を 作 りタデ 抽 出 物 による 産 生 抑 制 効 果 有 無 も 同 時 に 調 べた TNF-α の 産 生 量 は バ イ オ ソ ー ス 社 の ELISA キ ッ ト を 用 い て 測 定 し た (6) 生 化 学 的 指 標 の 測 定 血 液 を 用 い て 下 記 の 生 化 学 指 標 を 検 査 セ ン タ ー に 委 託 し て 測 定 し た 赤 血 球 数 赤 血 球 形 態 白 血 球 数 血 小 板 数 ヘ モ グ ロ ビ ン 総 蛋 白 ア ル ブ ミ ン A/G 比 AST ALT LDH ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ γ -GTP 総 ビ リ ル ビ ン 総 コ レ ス テ ロ ー ル HDL コ レ ス テ ロ ー ル LDL コレステロー ル 中 性 脂 肪 尿 素 窒 素 ク レ ア チ ニ ン 尿 酸 Na K Cl CPK アミラー ゼ 血 糖 HbA 1 C (7)タ デ 抽 出 物 の 安 全 性 試 験 1 タ デ 抽 出 物 の 安 全 性 試 験 ( 厚 生 労 働 省 基 準 ) 1. 材 料 及 び 実 験 方 法 7 週 齢 の Wistar 雄 ラット 6 匹 は 日 本 チ ャ ー ル ス リ バ ー 社 よ り MF 飼 料 は オ リ エ ン タ ル 酵 母 工 業 よ り 購 入 し た 飲 水 は 水 道 水 を 自 由 摂 取 さ せ た 2. 飼 料 及 び 飼 育 条 件 室 温 23±2 相 対 湿 度 50~ 60% 12 時 間 の 明 暗 サ イ ク ル ( 7:00~ 19:00)の 環 境 下 で 1 週 間 の 予 備 飼 育 後 タデ 抽 出 物 (2.5g/Kg) を 胃 ゾ ン デ に て 単 回 投 与 した 3. 観 察 接 触 刺 激 に 対 す る 反 応 運 動 呼 吸 痙 攣 排 泄 物 体 毛 お よ び 皮 膚 病 理 組 織 学 的 変 化 体 重 の 変 化 の 観 察 を 行 っ た 36

39 2 Wistar 系 SPF ラットのタデ 抽 出 物 添 加 実 験 1. 材 料 及 び 実 験 方 法 9 週 齢 の Wistar 雄 ラット 24 匹 は 日 本 チ ャ ー ル ス リ バ ー 社 よ り MF 粉 末 飼 料 は オ リ エ ン タ ル 酵 母 工 業 よ り 購 入 し た 飲 水 は 水 道 水 を 自 由 摂 取 さ せ た 実 験 飼 料 は 芽 タ デ 酢 酸 抽 出 物 を 0.5% の 割 合 で MF 粉 末 に 混 合 し た も の ( 実 験 飼 料 A) 及 び 生 長 タデ 80% エ タ ノ ー ル 抽 出 物 を 0.1% 割 合 で MF 粉 末 に 混 合 したもの( 実 験 飼 料 B)を 用 いた 2. 飼 料 及 び 飼 育 条 件 室 温 23±2 相 対 湿 度 50~ 60% 12 時 間 の 明 暗 サ イ ク ル ( 7:00~ 19:00)の 環 境 下 で 1 週 間 の 予 備 飼 育 後 動 物 は 各 8 匹 を 3 群 に 分 け た Ⅰ 群 ( 正 常 対 照 ラ ッ ト ) に は 2 週 間 30g/ 匹 / 日 の 割 合 で MF 粉 末 を 与 え た Ⅱ 群 ( 実 験 飼 料 A 投 与 ラ ッ ト )に は 2 週 間 30g/ 匹 / 日 の 割 合 で 実 験 飼 料 A を 与 え た Ⅲ 群 ( 実 験 飼 料 B 投 与 ラ ッ ト ) に は 2 週 間 30g/ 匹 / 日 の 割 合 で 実 験 飼 料 B を 与 えた 3. 測 定 項 目 1) 体 重 入 荷 時 群 分 け 時 及 び 屠 殺 時 に 測 定 し た 2) 屠 殺 ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル ナ ト リ ウ ム 麻 酔 下 で 屠 殺 し た 3) 血 液 検 査 腹 大 動 脈 か ら 採 血 し 血 液 一 般 生 化 学 検 査 ( 血 漿 ) 赤 血 球 変 形 能 ( 孔 径 : μ m) を 測 定 し た (8)ヒ ト に 対 す る 機 能 性 成 分 含 有 ド リ ン ク 剤 の 投 与 法 対 象 1. 年 齢 (24~ 51 歳 ) 2. 性 別 女 性 3. 健 常 者 被 検 者 数 12 名 試 験 デザイン プ ラ セ ボ 対 照 単 盲 検 並 行 比 較 試 験 タデドリンク 1 日 1 回 1 本 を 1 週 間 摂 取 し 有 効 性 と 安 全 性 を 評 価 する 有 効 性 評 価 項 目 血 液 生 化 学 的 検 査 摂 取 前 摂 取 後 に 空 腹 時 血 糖 総 コ レ ス テ ロ ー ル HDL コ レ ス テロール LDL コ レ ス テ ロ ー ル 等 の 測 定 を 行 っ た な お い ず れ も イ ン フ ォ ー ム ド コ ン セ ン ト を 得 ら れ た 者 に 行 っ た 37

40 3-3-4 実 験 結 果 (1)STZ 糖 尿 病 ラ ッ ト ( 予 防 モ デ ル ) イ ン ビ ボ 実 験 ( 図 1) 紅 タ デ 抽 出 成 分 の 投 与 に よ り 下 記 の 結 果 が 得 られた 1) 酸 化 に よ る 肝 機 能 ( AST,ALT) の 悪 化 を 統 計 的 に 有 意 に 防 止 し た 2) 総 コ レ ス テ ロ - ル に 差 は な か っ た が LDL コ レ ス テ ロ - ル が 低 下 し た 3) 赤 血 球 変 形 能 ( サ ラ サ ラ 度 ) の 低 下 ( 悪 化 )を 防 止 す る 傾 向 が み ら れ た 4)そ の 他 の 測 定 項 目 に は 有 意 な 変 化 は 見 ら れ な か っ た 白 血 球 ( 10 2 /μ l) 血 小 板 ( 10 4 /μ l) STZ(-) 実 験 食 (-) 対 照 群 STZ(+) 実 験 食 (-) 群 STZ(+) 実 験 食 (+) 群 STZ(-) 実 験 食 (-) 対 照 群 STZ(+) 実 験 食 (-) 群 STZ(+) 実 験 食 (+) 群 総 蛋 白 (g/dl) AST(IU/l) STZ(-) 実 験 食 (-) 対 照 群 STZ(+) 実 験 食 (-) 群 STZ(+) 実 験 食 (+) 群 0 STZ(-) 実 験 食 (-) 対 照 群 STZ(+) 実 験 食 (-) 群 STZ(+) 実 験 食 (+) 群 ALT(IU/l) 総 コレステロール(mg/dl) STZ(-) 実 験 食 (-) 対 照 群 STZ(+) 実 験 食 (-) 群 STZ(+) 実 験 食 (+) 群 STZ(-) 実 験 食 (-) 対 照 群 STZ(+) 実 験 食 (-) 群 STZ(+) 実 験 食 (+) 群 LDLコレステロール(mg/dl) STZ(-) 実 験 食 (-) 対 照 群 STZ(+) 実 験 食 (-) 群 STZ(+) 実 験 食 (+) 群 図 1 紅 タ デ 抽 出 成 分 投 与 後 の 血 液 生 化 学 検 査 結 果 ( 予 防 モ デ ル ) 38

41 (2)STZ 糖 尿 病 ラ ッ ト ( 治 療 モ デ ル ) イ ン ビ ボ 実 験 ( 図 2) 紅 タ デ 抽 出 物 成 分 の 投 与 に よ り 下 記 の 結 果 が 得 ら れ た 1 ) 芽 タ デ 抽 出 物 は 肝 機 能 ( AST,ALT) の 悪 化 を 有 意 に 予 防 し LDL コ レ ス テ ロ - ル を 低 下 さ せ た 血 糖 値 も 改 善 傾 向 を 示 し た ま た 赤 血 球 変 形 能 ( サ ラ サ ラ 度 ) を 改 善 した 2 ) 生 長 タ デ で は 酸 化 に よ る 白 血 球 血 小 板 低 下 を 防 止 し LDL コ レ ス テ ロ - ル を 低 下 さ せ る 効 果 が み ら れ た 赤 血 球 変 形 能 改 善 は 見 ら れ な か っ た 白 血 球 ( 10 2 /μ l) 赤 血 球 ( 10 4 /μ l) 正 常 ラット STZ 糖 尿 病 ラット STZ 糖 尿 病 ラット STZ 糖 尿 病 ラット 対 照 群 対 照 群 芽 タデ 投 与 群 生 長 タデ 投 与 群 600 正 常 ラット STZ 糖 尿 病 ラット STZ 糖 尿 病 ラット STZ 糖 尿 病 ラット 対 照 群 対 照 群 芽 タデ 投 与 群 生 長 タデ 投 与 群 血 小 板 ( 10 4 /μ l) AST(IU/l) 正 常 ラット STZ 糖 尿 病 ラット STZ 糖 尿 病 ラット STZ 糖 尿 病 ラット 0 正 常 ラット STZ 糖 尿 病 ラット STZ 糖 尿 病 ラット STZ 糖 尿 病 ラット 対 照 群 対 照 群 芽 タデ 投 与 群 生 長 タデ 投 与 群 対 照 群 対 照 群 芽 タデ 投 与 群 生 長 タデ 投 与 群 白 血 球 ( 10 2 /μ l) 赤 血 球 ( 10 4 /μ l) 正 常 ラット STZ 糖 尿 病 ラット STZ 糖 尿 病 ラット STZ 糖 尿 病 ラット 対 照 群 対 照 群 芽 タデ 投 与 群 生 長 タデ 投 与 群 600 正 常 ラット STZ 糖 尿 病 ラット STZ 糖 尿 病 ラット STZ 糖 尿 病 ラット 対 照 群 対 照 群 芽 タデ 投 与 群 生 長 タデ 投 与 群 血 小 板 ( 10 4 /μ l) AST(IU/l) 正 常 ラット STZ 糖 尿 病 ラット STZ 糖 尿 病 ラット STZ 糖 尿 病 ラット 0 正 常 ラット STZ 糖 尿 病 ラット STZ 糖 尿 病 ラット STZ 糖 尿 病 ラット 対 照 群 対 照 群 芽 タデ 投 与 群 生 長 タデ 投 与 群 対 照 群 対 照 群 芽 タデ 投 与 群 生 長 タデ 投 与 群 図 2 紅 タ デ 抽 出 成 分 投 与 後 の 血 液 生 化 学 検 査 結 果 ( 治 療 モ デ ル ) 39

42 赤 血 球 変 形 能 (%) ( 3 ) ヒ ト 赤 血 球 変 形 能 ( イ ン ビ ト ロ ) 実 験 ( 図 3) 芽 タ デ か ら 抽 出 さ れ た イ デ イ ン と イ ソ ケ ル シ ト リ ン は 共 に ヒ ト 赤 血 球 変 形 の 酸 化 に よ る 変 形 能 低 下 ( サ ラ サ ラ 度 低 下 ) を 有 意 に 防 止 し た control AAPH AAPH+イデイン AAPH+イソケルシトリン 図 3 芽 タ デ 抽 出 成 分 添 加 に よ る 赤 血 球 変 形 能 の 変 化 (4) 免 疫 機 能 ( TNF-α ) 測 定 法 芽 タ デ 酢 酸 抽 出 物 に よ り TNF-α が 有 意 に 増 大 し た (5)タ デ 抽 出 物 の 安 全 性 試 験 紅 タ デ 抽 出 物 を ラ ッ ト に 投 与 し 外 観 体 重 血 液 生 化 学 諸 指 標 に 全 く 変 化 が み ら れな かった ( 6 ) ヒ ト で の 機 能 性 成 分 含 有 ド リ ン ク 剤 の イ ン ビ ト ロ 実 験 ( 図 4) ヒ ト 赤 血 球 に 試 作 ド リ ン ク 剤 の 1000 倍 希 釈 を 添 加 し た 結 果 赤 血 球 変 形 能 の 4 時 間 後 の 劣 化 を 有 意 に 防 止 し た RCF(%) 時 間 生 食 1000 倍 希 釈 10 倍 希 釈 図 4 機 能 性 成 分 含 有 試 作 ド リ ン ク 剤 の 添 加 に よ る 赤 血 球 変 形 能 の 時 間 的 変 化 40

43 ( 7 ) ヒ ト で の 機 能 性 成 分 含 有 ド リ ン ク 剤 の イ ン ビ ボ 実 験 ( 図 5) 正 常 女 性 に ド リ ン ク 剤 を 1 週 間 投 与 し た 結 果 HbA 1 C( 糖 尿 病 指 標 )が 低 下 し コ レ ス テ ロ - ル 高 値 者 で 低 下 す る 傾 向 が 見 ら れ た し か し 中 年 男 性 が 多 い 集 団 に 行 っ た 実 験 で は 有 意 な 差 は 見 ら れ な か っ た 総 コレステロール(mg/dl) 総 コレステロール(mg/dl) 前 後 120 前 後 タデ(-)ドリンク 群 タデ(+)ドリンク 群 ヘモグロビンA1c(%) ヘモグロビンA1c(%) 前 後 4.4 前 後 タデ(-)ドリンク 群 タデ(+)ドリンク 群 図 5 機 能 性 成 分 含 有 ド リ ン ク 剤 の イ ン ビ ボ 実 験 結 果 41

44 3-3-5 研 究 成 果 動 物 お よ び ヒ ト に お け る イ ン ビ ト ロ 実 験 イ ン ビ ボ 実 験 か ら 紅 タ デ 抽 出 成 分 は 下 記 の よ う な 機 能 を 持 つ こ と が 明 ら か に な っ た 1) 赤 血 球 変 形 能 ( サ ラ サ ラ 度 ) の 改 善 2) 血 糖 値 の 低 下 3) 肝 機 能 改 善 4) 白 血 球 減 尐 防 止 5) 免 疫 機 能 (TNF-α ) の 活 性 参 考 文 献 1. Mawatari S., Saito K., Murakami K., and Fujino T.: Absence of correlation between glycated hemoglobin and lipid composition of erythrocyte membrane in type 2 diabetic patients., Metabolism, 53: (2004). 2. Iwata H.,Ukeda H.,Maruyama T.,Fujino T.,Sawamura M:Effect of carbonyl ompounds on red cells deformability. Biophys. Res Commun 321: (2004). 3. Oonishi Y., Fujino T.,Satoh A.,Takeda S., Uesaka N., Maruyama T: Effects of Oligomeric Procyanidins (OPCs) in Human Erythrocyte Filterability and Microcirculation. Journal of Japanese Society of Biorheology, Vol.19 No.2, 24-33(2005). 4. Okamoto K.,Maruyama T.,Kaji Y.,Harada M.,Mawatari S.,Fujino T.,Uesaka N.: Verapamil Prevents Impairment in Filterabirity of Human Erythrocytes Exposed to Oxidative Stress. Japanese Journal of Physiology, 54, 39-46(2004). 5. Mawatari S., Ohnishi Y., Kaji Y., Maruyama, T., Murakami, K., Tsutsui K., Fujino T.: High-cholesterol diets induce changes in lipid composition of rat erythrocyte membrane including decrease in cholesterol, increase in α -tocopherol and changes in fatty acids of phospholipids. Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, (2003). 42

45 3 機 能 性 成 分 の 特 定 と 生 体 調 整 機 能 の 解 明 3-4 タデ 抽 出 物 の 血 小 板 機 能 に 及 ぼす 影 響 久 留 米 大 学 医 学 部 血 液 内 科 教 授 岡 村 孝 助 手 大 崎 浩 一 検 査 技 師 関 律 子 伝 統 野 菜 の 循 環 系 改 善 機 能 の 解 明 に よ る 新 規 健 康 補 助 食 品 の 開 発 タ デ 抽 出 物 か ら 循 環 機 能 改 善 効 果 を 示 す 分 画 を 精 製 し 新 規 健 康 補 助 食 品 と し て の 開 発 を 目 指 す プ ロ ジ ェ ク ト 全 体 に お け る 本 研 究 開 発 部 分 の 位 置 づ け 循 環 機 能 の な か の 血 小 板 機 能 を み る こ と に よ り 抗 血 栓 効 果 が 期 待 さ れ る か ど う か 検 討 し 血 小 板 機 能 抑 制 効 果 が あ れ ば 生 活 習 慣 病 に お け る 血 管 合 併 症 予 防 に よ い 健 康 食 品 と な り うる 目 的 と 目 標 血 小 板 は 出 血 時 の 止 血 に と っ て 重 要 な 血 液 細 胞 で あ る 血 管 壁 が 破 綻 し 内 皮 下 組 織 が 血 液 に 接 す る と 内 皮 下 組 織 に 存 在 す る コ ラ ー ゲ ン や ラ ミ ニ ン な ど の マ ト リ ッ ク ス 蛋 白 に 血 漿 蛋 白 で あ る フ ォ ン ウ ィ ル ブ ラ ン ド 因 子 ( v WF)が 結 合 す る こ の v WF を 認 識 し て 血 小 板 膜 蛋 白 で あ る GP Ib/IX/V 複 合 体 を 介 し て 障 害 さ れ た 血 管 壁 に 血 小 板 が 粘 着 す る こ と か ら 止 血 が 始 ま る 次 い で コ ラ ー ゲ ン を 直 接 認 識 で き る 血 小 板 膜 蛋 白 で あ る GP VI や GPIa/IIa な ど の イ ン テ グ リ ン を 介 し て 血 管 壁 に 粘 着 す る 粘 着 し た 血 小 板 は 生 理 活 性 物 質 で あ る ADP や ト ロ ン ボ キ サ ン A2 を 放 出 し 血 小 板 膜 蛋 白 IIb/IIIa を 露 呈 す る こ と に よ り 血 漿 蛋 白 で あ る フ ィ ブ リ ノ ゲ ン を 介 し て 血 小 板 同 士 が 凝 集 塊 を 形 成 す る( 図 1 ) こ れ が 一 次 止 血 と い わ れ る さ ら に 血 液 凝 固 が 活 性 化 さ れ て く る と フ ィ ブ リ ン に よ る 血 栓 が 形 成 さ れ こ れ を 二 次 止 血 と い い 止 血 機 構 が 終 了 す る 動 脈 硬 化 性 病 変 が 存 在 す る 部 位 で は こ の 止 血 機 構 が 過 剰 に 作 用 す る と 血 管 内 に 血 栓 を 形 成 し 血 栓 性 塞 栓 を き た し 脳 梗 塞 や 心 筋 梗 塞 の よ う な 深 刻 な 病 態 を 呈 す る そ こ で 現 在 で は こ れ ら の 高 度 の 動 脈 硬 化 性 病 変 を 持 つ 症 例 で は ア ス ピ リ ン や チ ク ロ ピ ジ ン な ど の 血 小 板 機 能 抑 制 剤 を 服 用 し 血 栓 形 成 を 抑 制 す る こ と が 長 期 生 存 に 貢 献 す る こ と が 種 々 の 臨 床 試 験 で 確 か め ら れ た し か し こ れ ら の 薬 剤 は 作 用 が 強 い と 副 作 用 と し て 出 血 傾 向 が み ら れ る こ と が 問 題 と な る 食 品 の 抽 出 成 分 が こ の よ う な 血 小 板 機 能 を あ る 程 度 抑 制 す る 作 用 を も つ か ど う か 検 討 す る こ と は 血 栓 症 予 防 の 観 点 か ら 健 康 補 助 食 品 と し て の 意 義 を 高 め る も の と 思 わ れ る そ こ で わ れ わ れ は タ デ 抽 出 物 か ら の 成 分 の 血 小 板 機 能 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 し 抗 血 栓 作 用 を 示 す こ と を 証 明 す る 43

46 血 小 板 凝 集 血 流 TxA2 ADP 血 小 板 粘 着 凝 集 機 序 PDGF TGF- VEGF TS vwf FV Fbg PAI-1 platel et vwf GP Ib/IX GP IIb/IIIa GP Ia/IIa GP VI fibrinogen 血 小 板 粘 着 collagen 内 皮 下 組 織 Vascular cells endothelial 図 1 血 小 板 の 障 害 血 管 壁 へ の 粘 着 凝 集 機 序 内 皮 下 組 織 が 血 流 と 接 すると 血 漿 蛋 白 であるvWF が 内 皮 下 の コ ラ ー ゲ ン と 結 合 し 構 造 変 化 したvWF を 血 小 板 膜 蛋 白 GPIbが 認 識 して 血 小 板 が 粘 着 する この 血 小 板 から ADP や TXA2 が 放 出 され GPIIb/IIIa が 表 面 に 露 呈 し 血 漿 フィブリノゲンを 介 した 血 小 板 凝 集 が 起 こるこ とにより 一 次 止 血 が 完 了 する 実 験 方 法 お よ び 実 験 条 件 健 常 者 から 0.2ml の 血 小 板 多 血 漿 ( Platelet rich plasma: PRP) を と り こ れ に 芽 タ デ 抽 出 精 製 物 a1 a2 b 分 画 : 最 終 濃 度 1 g/ml)を 添 加 し 2 分 37 で 混 和 し た の ち 血 小 板 凝 集 剤 をとして 10 M ADP あるいは 1.2mg/ml リ ス ト セ チ ン を 攪 拌 し な が ら 添 加 し て 凝 集 能 を 測 定 し た 最 大 凝 集 率 で 評 価 し コ ン ト ロ ー ル と し て は 同 じ 健 常 者 の 血 小 板 乏 血 漿 ( platelet poor plasma: PPP) を 用 い た 血 小 板 凝 集 能 は 二 光 バ イ オ サ イ エ ン ス 社 製 の 吸 光 度 計 を 用 い た ( 図 2 ) 実 験 結 果 図 3 お よ び 図 4 に 結 果 を 示 す a1 a2 分 画 は ADP お よ び リ ス ト セ チ ン 惹 起 血 小 板 凝 集 能 を 抑 制 す る 傾 向 に あ る b 分 画 は 凝 集 抑 制 作 用 は な か っ た よ っ て イ デ イ ン が 主 作 用 を 示 し て い る と 考 え ら れ る 44

47 血 小 板 凝 集 惹 起 物 質 血 小 板 凝 集 能 ADP, collagen, ristocetin, etc. 血 小 板 PRP 攪 拌 血 小 板 凝 集 塊 0% 経 時 的 観 察 90% 光 透 過 度 PPP コントロール 100% 100% 図 2 血 小 板 凝 集 能 測 定 原 理 血 小 板 を 含 ま な い PPP を コ ン ト ロ ー ル と し て 透 過 度 を 100%と し て 血 小 板 を 含 ん だ 血 漿 ( PRP) の 透 過 度 を 0%として ADP な ど の 凝 集 惹 起 物 質 を 添 加 し て 経 時 的 に 透 過 度 を 計 測 する ことにより 血 小 板 凝 集 能 を 測 定 し 最 大 凝 集 率 として 評 価 する 芽 タデ 酢 酸 抽 出 物 血 小 板 凝 集 能 抑 制 効 果 ( 代 表 例 ) 7 0 % エ タ ノ ー ル 可 溶 画 分 ( ゲ ル 濾 過 後 半 画 分 ) Ristocetin 1.2mg/ml ADP 10μM 79% 78% 57% 50% a1 分 画 (1μg/μl) 添 加 - 添 加 + Ristocetin 1.2mg/ml 85% ADP 10μM 79% 57% a2 分 画 (1μg/μl) 添 加 - 添 加 + 60% 図 3 血 小 板 凝 集 曲 線 例 リストセチン 及 び ADP による 凝 集 に 対 する a1 及 び a2 分 画 添 加 の 影 響 をみた ADP 及 びリスト セチン 凝 集 を 芽 タデ 酢 酸 抽 出 物 は 抑 制 している 特 にこの 抑 制 効 果 は a1 分 画 に 顕 著 である 45

48 血 小 板 最 大 凝 集 率 90.00% 添 加 無 し 添 加 有 り 80.00% 70.00% 60.00% 50.00% 40.00% 30.00% 20.00% 10.00% 0.00% a1 a2 b a1 a2 b ADP Ristocetin 図 4 図 4 芽 タ デ 抽 出 物 の 血 小 板 凝 集 抑 制 効 果 a1 a2 b 分 画 の ADP お よ び リ ス ト セ チ ン 惹 起 血 小 板 凝 集 抑 制 を 検 討 し a1 分 画 が 最 も 抑 制 効 果 がみられた 研 究 成 果 タ デ 抽 出 精 製 物 は in vitro で 血 小 板 機 能 を 抑 制 す る 作 用 が み ら れ た し か し こ の 濃 度 で は 完 全 に 血 小 板 機 能 を 抑 制 す る も の で は な く 軽 度 の 抑 制 で あ る こ の こ と か ら 出 血 性 副 作 用 は な い と 推 定 さ れ 新 た な 臨 床 検 討 も 可 能 で あ ろ う 生 活 習 慣 病 に 対 す る 健 康 食 品 と し て 最 近 注 目 さ れ て い る 血 液 サ ラ サ ラ に 貢 献 す る 血 液 機 能 は 赤 血 球 変 形 能 お よ び 血 小 板 凝 集 能 で あ る こ れ ら の う ち 血 小 板 凝 集 抑 制 機 能 が み ら れ る こ と か ら タ デ は 健 康 補 助 食 品 と し て の 役 割 の 一 部 を 担 う も の で あ る 今 後 の 課 題 と 取 組 今 後 こ の タ デ 抽 出 成 分 を 含 ん だ ド リ ン ク や 錠 剤 の 開 発 に よ り in vivo で の 血 小 板 凝 集 能 の 変 化 を み る こ と が 可 能 に な り 血 小 板 凝 集 能 低 下 効 果 を 確 認 し 大 規 模 試 験 で の 長 期 服 用 に よ る 心 血 管 系 合 併 症 の 減 尐 と 生 存 期 間 の 延 長 効 果 を み る こ と が 検 討 課 題 で あ る 46

49 3 機 能 性 成 分 の 特 定 と 生 体 調 整 機 能 の 解 明 3-5 タデ 由 来 機 能 性 成 分 の 免 疫 系 に 及 ぼす 作 用 の 解 析 九 州 大 学 大 学 院 医 学 研 究 院 病 態 修 復 内 科 学 分 野 教 授 原 田 実 根 助 手 塚 本 浩 タ デ 機 能 性 成 分 の 免 疫 系 に 及 ぼ す 作 用 の 解 析 タ デ 機 能 性 成 分 に つ き 免 疫 学 的 な 視 点 か ら の 解 析 を 行 う プ ロ ジ ェ ク ト 全 体 に お け る 本 研 究 の 位 置 づ け 本 プ ロ ジ ェ ク ト は 伝 統 野 菜 で あ る タ デ 由 来 の 食 品 の 開 発 が 目 的 で あ る が 開 発 さ れ た 食 品 に ど の よ う な 効 能 が あ る の か を 解 析 す る 必 要 が あ る 開 発 さ れ た 食 品 は い ろ い ろ な 効 能 を 有 す る と 予 想 さ れ る が 本 研 究 は 開 発 さ れ た 食 品 の 免 疫 学 的 作 用 に つ き 評 価 す る こ と が プ ロ ジ ェ ク ト 内 で の 役 割 で あ る 目 的 と 目 標 タ デ 由 来 機 能 性 成 分 の 免 疫 系 に 及 ぼ す 作 用 を 明 ら か に す る こ と が 目 的 で あ る 具 体 的 に は タ デ 由 来 機 能 性 成 分 の in vitro に お け る 免 疫 担 当 細 胞 へ の 作 用 を 明 ら か に す る こ と を 目 標 とした 実 験 方 法 お よ び 実 験 条 件 (1) 芽 タ デ の 免 疫 担 当 細 胞 に 及 ぼ す 作 用 の 検 討 免 疫 学 的 解 析 は 当 施 設 で こ れ ま で 行 っ て き た フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 法 を 用 い た (1~ 6) ヒ ト 末 梢 血 よ り 単 核 球 を 比 重 遠 心 法 に て 分 離 し サ イ ト カ イ ン 等 の 刺 激 下 に 24 時 間 また は 48 時 間 または 72 時 間 培 養 し た 培 養 後 CD4 陽 性 T リ ン パ 球 CD19 陽 性 B リ ン パ 球 上 の 活 性 化 表 面 マ ー カ ー の 発 現 に つ き フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に て 検 討 し た 検 討 す る 表 面 マ ー カ ー は CD4 陽 性 T 細 胞 では CD69 CD25 CD154 B 細 胞 では CD69 CD86 HLA-DR と し た こ の 系 に 1 g/ml 10 g/ml 100 g/ml の 芽 タ デ を 添 加 し 上 記 リ ン パ 球 上 の 活 性 化 マ ー カ ー 発 現 に 与 え る 影 響 を 検 図 1 リ ン パ 球 の 活 性 化 と 討 した( 図 1) 表 面 マ ー カ ー の 変 化 47