Table IHC 自動染色プロトコール ①熱処理一次抗体の抗原賦活処理として熱処理 ②インヒビターを滴約 μl 加え分間反応 ③インヒビターを洗浄後一次抗体を滴約 μl 加え分間反応 ④一次抗体を洗浄後ビオチン標識 Ig を滴約 μl 加え 8 分間反応 ⑤ビオチン標識 I

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ほだかちとく
7 years ago
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1 技術論文乳癌における Dual Color in situ Hybridization 法による HER 遺伝子増幅の検出 FISH 法との比較田中京子 ) 武田麻衣子 ) 西川武 ) 中井登紀子 ) 小関久恵 ) 笠井孝彦 ) ) 奈良県立医科大学附属病院病院病理部 6-85 ) 奈良県立医科大学病理診断学講座 ) 産業医科大学第病理学教室要森田剛平 ) 大林千穂 ) 奈良県橿原市四条町 8 旨乳癌における HER 検査での DISH 法の有用性を検討したので報告する HER immunohistochemistry IHC 法にてスコア +であった浸潤性乳癌 7 例を用い FISH 法および DISH 法での HER 遺伝子増幅の有無を検討した HER DISH 法の判定は名で行いその判定者間での結果も比較した DISH 法の測定者間での比較では測定値では例 7% で測定者間でばらつきがみられたが判定結果の相違はいずれの症例も確認されなかった FISH 法および DISH 法での判定結果の比較では例 78% では一致していたが 6 例 % で乖離が見られた FISH 法と DISH 法の測定値は有意な相関がみられたキーワード乳癌 DISH FISH HER 遺伝子増幅乳癌における HER 遺伝子増幅やタンパク質過剰にて浸潤性乳管癌と診断され HER immuno- 発現は予後因子となるばかりでなく分子標的治 histochemistry 以下 IHC 法にてスコア +と判定療薬の標的となっているされた 7 症例の手術材料を用いた ), ) 乳癌における Dual Color in situ hybridization 法は 7 番染色体に存在す検査方法る HER 遺伝子とセントメアにハイブリダイズした対象例について HER Fluorescence in situ プローブに標識されているハプテンをパーオキシ hybridization 以下 FISH 法と Dual Color in situ ダーゼ系とアルカリフォスファターゼ系の二種類 hybridization 以下 DISH 法との比較検討を行ったの酵素を標識した抗ハプテン抗体を用いて黒色標本は %中性ホルマリンにて原則時間か HER 遺伝子と赤色第 7 番染色体セントロメら時間最長 8 時間固定されパラフィン包埋アのシグナルとしてそれぞれ検出させる方法で後薄切切片を作成した IHC 法は自動免疫染色そのシグナルは光学顕微鏡下で観察が可能である装置 Ventana BenchMark XT Roche を用いた IHC 今回乳癌において Dual Color ISH HER を用い法の一次抗体は I-VIEW パスウエー HER B5 ) た HER 検査の有用性を検討したので報告するキット Roche を用い二次抗体から発色までは I-VIEW DAD ユニバーサルキット Roche を使用 I 対象及び方法しマニュアル Table に沿って自動染色した FISH 法はパスビジョン HER DNA プローブキッ対象年 6 月から年 6 月までの期間で当院ト Abbott を使用し染色を行った DISH 法は IHC 法と同様の自動免疫染色装置を用いた試薬は平成 5 年月 7 日受付平成 6 年月 6 日受理 5 57

2 Table IHC 自動染色プロトコール ①熱処理一次抗体の抗原賦活処理として熱処理 ②インヒビターを滴約 μl 加え分間反応 ③インヒビターを洗浄後一次抗体を滴約 μl 加え分間反応 ④一次抗体を洗浄後ビオチン標識 Ig を滴約 μl 加え 8 分間反応 ⑤ビオチン標識 Ig を洗浄後アビジン-HRP 滴約 μl 加え 8 分間反応 ⑥アビジン-HRP を洗浄後 DAB 試薬と HO 試薬を滴ずつ約 μl 加え 8 分間反応 ⑦DAB 試薬と HO 試薬を洗浄後 COPPER 試薬を滴約 μl 加え分間反応 ⑧COPPER を洗浄 ⑨対比染色核染色および色出し Table DISH 自動染色プロトコール ①熱処理一次抗体の抗原賦活処理として熱処理 ②HER DNA カクテルプローブ滴約 μl 滴下し 6 時間反応 ③HER DNA カクテルプローブを洗浄後抗 DNP 抗体滴約 μl 滴下し分間反応 ④抗 DNP 抗体を洗浄後 HRP 標識抗体滴約 μl 滴下し 6 分間反応 ⑤HER 標識抗体を洗浄後発色試薬 A 滴約 μl に発色試薬 B と発色試薬 C 滴ずつ約 μl 滴下し分間反応 ⑥発色液 ABC 洗浄後抗 DIG 抗体滴約 μl 滴下し分間反応 ⑦抗 DIG 抗体洗浄後 AP 標識抗体滴約 μl 滴下し分間反応 ⑧AP 標識抗体洗浄後 PH エンハンサー試薬滴約 μl に Naphthol 試薬滴約 μl と Fast Red 試薬滴約 μl 滴下し 8 分間反応 ⑨対比染色核染色および色出しベンタナインフォーム Dual ISH HER キット対する HER のシグナル総数の比率を算出して Roche を使用しマニュアル Table に沿って HER/CEP7 が.8 未満を陰性 negative. を超自動染色したえる場合を陽性 positive とし HER/CEP7 が.8 判定方法以上で. 未満の場合は境界域 equivocal とした HER 遺伝子増幅やタンパク過剰発現の評価方法 FISH 法の計測値は目視判定法と CV 法で相関係は American Society of Clinical Oncology ASCO / 数 r =.79 と良い相関を得ていた Figure ので College of American Pathologists CAP HER 検査ガ以下の DISH 法との比較には CV 法での測定結果をイドラインに準拠した IHC 法 FISH 法 DISH 用い検討した DISH 法の測定値は名 A B 法に使用する切片は連続切片で同一部位を計測 C D 細胞検査士を含むで目視判定を行いそのした判定者間での結果を比較するとともに DISH 法で ) FISH 法の判定は IHC 法で染色強度を観察し測定部位をマーキングし浸潤部分を特定し個の乳の名の計測値の平均値で得られた結果を FISH 法 CV 法で得られた結果と比較した癌細胞での HER 7 番染色体セントロメア DISH 法での測定者間の再現性については変動 CEP7 のシグナル数を蛍光顕微鏡 BIOREVO 係数標準偏差/平均値 % を求め比較 BZ-9 KEYENCE を用いた従来の目視計測お検討を行った FISH 法および DISH 法での解析評価よび自動解析装置 CytoVision Leica を用いた自動での一致率および相関の検討には Pearson の検定を計測以下 CV 法を行った総数の比 HER/CEP7 用いたを求め.8 未満を陰性 negative. を超える場合を陽性 positive HER/CEP7 が.8 以上で. II 結果未満の場合は境界域 equivocal とした ) DISH 法の判定は FISH 法で特定した同箇所におそれぞれの症例の FISH 法および DISH 法の計測おいて HER は黒色のシグナルとして CEP7 は赤よび判定結果を Table に示す色のシグナルとして染色されるため各々の核にお DISH 法の測定者間での比較けるシグナル数を計測し CEP7 のシグナル総数に 58 5 名 A B C D の測定者間での結果の相違

3 FISH-CV method n = 7 r =.79 y = x p< FISH-ocular observation method Figure Scatter diagram of HER gene/cep7 signal ratios by ocular observation method and CV method There was a considerably correlation between the two. FISH, fluorescence in situ Hybridization. を比較した判定結果の相違はいずれの症例も確認おいて予後因子でありトラスツズマブによる分子されなかった 7 症例のうち例 7% では標的治療薬の特異的ターゲットである ), ) そのた変動係数は %を超え測定者間でのバラツキがみめ治療に先立ち乳癌組織での HER 遺伝子増幅やられたタンパク過剰発現の状況を確認することは必要不可 FISH 法と DISH 法の比較欠でありその検査判定方法が治療方針を大きく FISH 法および DISH 法での判定結果の比較では左右する FISH 法は HER 遺伝子増幅の検出のひ例 78% では一致していたが 6 例 % Case とつで現在最も広く使われている方法であるし No. 7 8 で乖離していた Table かし染色手順が煩雑で機械での自動染色が汎 FISH 法で陽性であった症例のうち症例 Case 用されていない観察には蛍光顕微鏡が必要で No. 6 が DISH 法でも陽性であったがもう症蛍光顕微鏡下で病理組織像との対比が困難である例 Case No. は陰性と判定された Table 測定者間における再現性が低いすぐに色素 Figure また FISH 法で陰性であった症例のが退色するため反復して観察することや長期保存うち DISH 法では陽性と判定された症例が症例が不可能であるなどの問題点が指摘されている 5) % Case No. Figure 境界域と判定された一方 DISH 法は異なるハプテンが標識された HER 症例が症例 % Case No. あった FISH 法遺伝子と第 7 番染色体セントロメアに対するミッで境界領域と判定された症例 Case No. 7 クスプローブを同時に標的遺伝子にハイブリダイ 8 はいずれも DISH 法では陰性と判定されたゼーションさせ標識されたハプテンを Silver in situ FISH 法および DISH 法の測定値の比較では相関係 hybridization SISH 法と Chromogenic in situ 数 r =.598 をもって有意の相関がみられた Hybridization CISH 法により可視化させる方法で Figure そのシグナルは光学顕微鏡下で観察が可能であるため ) 病理組織との対比も容易で反復して観察 III 考察することや長期保存ができるまた自動免疫染色装置 Ventana BenchMark XT Roche を用い自動 HER 遺伝子増幅やタンパク過剰発現は乳癌に的に染色することが可能である 55 59

4 Table Result of FISH and DISH test for each case FISH 法 DISH 法 Case No. HER/ HER/Chr7 Result* Chr7 A B C D Mean Result* SD CV (%) ± ± ± ± FISH, fluorescence in situ Hybridization; DISH, dual color in situ hybridization; SD, standard deviation; CV, coefficient of variation. * : negative, +: positive, ±: equivocal Table Concordance of FISH and DISH HER amplification status based on ASCO/CAP criteria ) DISH FISH HER amplification HER equivocal HER not amplified Total HER amplification HER equivocal HER not amplified Total 7 FISH 法と DISH 法を比較検討した既報告では, 乖離率は.6~8% 5 )~ 9 ) と幅があるが, 今回の検討でも,7 症例中 6 症例で判定結果の乖離 ( 乖離率.%) がみられた. 乖離例の内訳は例が FISH 陽性 /DISH 陰性, 例が FISH 境界域 /DISH 陰性, 例が FISH 陰性 /DISH 境界域, 例が FISH 陰性 /DISH 陽性であった. FISH 法と DISH 法で乖離のみられた原因について考察する.DISH 法が FISH 法より過大評価になった症例については,DISH 法にて小さな銀の沈着が目立ち, 個々の不規則な小さな点を HER シグナルとして有意と評価するか, いわゆる塵であるのか判断が難しい症例がみられた. 特に,FISH 法と DISH 法の測定値に大きな差違がみられた Case No. では,DISH 法にて非特異的な塵をシグナルとしてカウントしてしまった可能性も考えられる. (6)56

a b Figure A case in which results from DISH and FISH were inconsistent (Case No. ) a: FISH results were indicative of a signal ratio of. and HER gene amplification (orange: HER, green: CEN7).

5 a b Figure A case in which results from DISH and FISH were inconsistent (Case No. ) a: FISH results were indicative of a signal ratio of. and HER gene amplification (orange: HER, green: CEN7). b: DISH results were indicative of a signal ratio of. and HER gene non-amplification (black: HER, red: CEN7). a b Figure A case in which results from DISH and FISH were inconsistent (Case No. ) a: FISH results were indicative of a signal ratio of.5 and HER gene non-amplification (orange: HER, green: CEN7). b: DISH results were indicative of a signal ratio of.75 and HER gene amplification (black: HER, red: CEN7). 次に DISH 法が FISH 法より過小評価になった症 DISH 法ではより多くのシグナルが核内に存在すれ例については Mansfield らの報告のなかでは二ば互いのシグナルが重なり判定しづらくなることつの要因を推察している一つめの要因としてを挙げている特に赤色の CEP7 シグナル数増加 FISH 法では蛍光顕微鏡フィルターを変えることにが著しい場合は互いのシグナルが重なり黒色のよってそれぞれのシグナルを個々に評価できるが HER シグナルが正確にカウントしづらく実際より 8) 57 6

6 DISH 8 n = 7 r =.598 y = x 7 6 p<. 5 FISH Figure Scatter diagram of HER gene/cep7 signal ratios by DISH and FISH method There was a considerably correlation between the two. FISH, fluorescence in situ Hybridization; DISH, dual color in situ hybridization. 少なくカウントされた可能性がある二つめの要因は FISH 法に比較し光学顕微鏡下で観察可能であとして HER 遺伝子増幅症例では CEP7 が共増幅る点や長期保存が可能であること機械で自動染 coamplify する症例があり共増幅する症例では色できるなどの多くの利点もあるが測定者間での HER/CEP7 比は過小に判定されることが挙げられバラツキもありその結果判定には注意が必要でるまた CEP7 は 7 番染色体の適切な内部標準あるではなく 8 ), ) FISH 法では CEP7 に替わる 7 番染色体上の別の領域でのプローブでの確認を推奨す今後明瞭なシグナルを得るための技術的改善や判定の標準化などが課題であるる報告がある DISH 法においても背景の非特異 ) 的沈着を防ぐ工夫や観察や判定の容易なプローブの検討などの技術面での改善が望まれるまた HER FISH 検査は判定法や判定者間に差がありその標準化が課題とされ結果の判定は複数の熟練者で行うことが推奨されている ) 今回の検討では DISH 法において名の測定者間で判定結果に相違は確認されなかったが測定値においては約 7%の症例で変動係数は %を超え判定者間にバラツキがみられた複数検者での測定や目合わせアトラス作製などによる判定の標準化なども必要と考える IV 結語乳癌での DISH 法による HER 遺伝子増幅検出 6 58 文献 ) Slamon DJ et al. : Human breast cancer : correlation of relapse and survival with amplification of the HER-/neu oncogene, Science 987 ; 5 : ) Ross JS, Fletcher JA : The HER-/neu oncogene in breast cancer : prognostic factor, predictive factor and target for therapy, Stem Cells 998 ; 6 : 8. ) Nitta H et al. : Development of aut omated brightfield double in situ hybridization (BDISH) application for HER gene and chromosome 7 centromere (CEN 7) for breast carcinomas and an assay performance comparison to manual dual color HER fluorescence in situ hybridization (FISH), Diagn Pathol 8 ; :. ) Wolff AC et al. : American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor testing in breast cancer, J Clin Oncol 7 ; 5() : ) Horii R et al. Comparison of dual-color in-situ hybridization and fluorescence in-situ hybridization in HER gene amplification in breast cancer, Breast Cancer Jan. [Epub ahead of print]. 6) Schiavon BN et al. : Evaluation of reliability of FISH versus

7 brightfield dual-probe in situ hybridization (BDISH) for frontline assessment of HER status in breast cancer samples in a community setting: influence of poor tissue preservation, Am J Surg Pathol ; 6() : ) Kim MA et al. : In situ analysis of HER mrna in gastric carcinoma: comparison with fluorescence in situ hybridization, dual-color silver in situ hybridization, and immunohistochemistry, Hum Pathol ; () : ) Mansfield AS et al. : Comparison of fluorescence in situ hybridization (FISH) and dual-ish (DISH) in the determination of HER status in breast cancer, Am J Clin Pathol ; 9() : 5. 9) Kiyose S et al. : Chromogenic in situ hybridization (CISH) to detect HER gene amplification in breast and gastric cancer: comparison with immunohistochemistry (IHC) and fluorescence in situ hybridization (FISH), Pathol Int ; 6() : ) Tse CH et al. : Determining true HER gene status in breast cancers with polysomy by using alternative chromosome 7 reference genes: implications for anti-her targeted therapy, J Clin Oncol ; 9() : Technical Article Detection of HER gene amplification in breast cancer using dualcolor in situ hybridization method in comparison with fluorescence in situ hybridization Kyoko TANAKA ) Takeshi NASHIKAWA ) Hisae KOSEKI ) Kohei MORITA ) Maiko TAKEDA ) Tokiko NAKAI ) Takahiko KASAI ) Chiho OHBAYASHI ) ) Pathology Section, Nara Medical University Hospital (8, Shijo-cho, Kashihara-shi, Nara 6-85, Japan) ) Department of Diagnostic Pathology, Nara Medical University School of Medicine ) Department of Pathology and Oncology, University of Occupational and Environmental Health, Kitakyushu, Japan Summary We examined the usefulness of the dual-color in situ hybridization (DISH) method for HER gene amplification in breast cancer. We studied 7 cases of invasive breast cancer that scored + by the HER immunohistochemistry (IHC) method. We investigated the occurrence of HER gene amplification by fluorescence in situ hybridization (FISH) and DISH methods, and compared the results obtained. Four investigators carried out the determinations by the HER DISH method and the results were compared. Comparison of the results obtained by the four investigators using the DISH method showed that cases (7%) revealed a small dispersion in the HER gene/cep7 signal ratios among the investigators, but the difference in the determined results was not confirmed in any of the cases. The FISH and DISH methods for HER gene diagnosis showed uniformity in cases (78%). Inconsistencies were prevalent in 6 cases (%). The HER gene/cep7 signal ratio obtained by the DISH method significantly correlated with the result of the FISH method. Key words: Breast cancer, DISH, FISH, HER gene amplification (Received: December 7, ; Accepted: March 6, ) 59 6

「適正なHER2検査のために」

「適正なHER2検査のために」乳癌における HER2 病理組織標本作製および病理診断のガイドライン ( 案 ) 1. はじめに p. 2 2. 標本の準備 p. 2 3. Immunohistochemistry (IHC) 法 p. 2 4. In situ hybridization (ISH) 法 (FISH 法 DISH 法 ) p. 4 5. 病理診断と HER2 分子標的治療適応のフローチャート p. 6 6. 参考文献