免疫組織化学染色

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1 免疫組織化学染色

2 平成 29 年度免疫組織化学サーベイ報告 免疫組織化学染色 (TTF-1) はじめに Thyroid transcription factor-1 (TTF-1) はホメオドメインタンパクファミリーに属し 甲状腺 肺の上皮細胞で特異的に発現している転写因子である このタンパクは甲状腺特異遺伝子の転写調節因子であり また肺特異分化誘導遺伝子の活性化にも関与していることが示されている 本抗体の染色 正常組織においては 肺の II 型肺胞上皮細胞 クララ細胞 甲状腺濾胞上皮細胞の核に反応性を示す 腫瘍組織においては肺および甲状腺の腫瘍細胞に反応性を示す また 大部分の肺小細胞癌と原発性および転移性肺腺癌と反応するが 中皮腫とは反応を示さないことから 原発性の肺腺癌と悪性中皮腫を鑑別するのに有用なマーカーのひとつである 材料および実施方法 今回使用した検体は肺腫瘍 ( 手術材料 ;10% 中性緩衝ホルマリン液固定 ) を薄切し 室温で1 時間乾燥させたものを2 枚配布し各施設で染色していただいた なお 染色工程により染色結果に差異が生じると思われたので 所定の報告書をweb 上で公開し 各施設で現在行っている方法の記入もお願いした また 一次抗体販売メーカー 4 社 アジレント テクノロジ- 株式会社 ( 以下アジレント社 ) ロシュ ダイアグノスティックス株式会社 ( 以下ロシュ社 ) ニチレイバイオサイエンス株式会社 ( 以下ニチレイ社 ) ライカマイクロシステムズ株式会社( 以下ライカ社 ) に同一標本を染色していただき その染色性を判定の基準として使用した 判定方法 下記の項目を基準に判定した 1 目的とする細胞 部位が染色されていること 2 染色ムラや非特異反応がないこと 以上の項目について判定者は 兵臨技 病理細胞検査研究班解析委員で行い 病理医の立場から 伊藤智雄先生 ( 神戸大学医学部附属病院病理部 ) にご確認頂いた 判定基準は AあるいはB. 診断上支障のない標本 C. 診断上支障をきたす標本 として 慎重なる評価判定を行った 結果 < 集計にあたって> 1) 申し込み施設 32 施設に対し 回収施設数 32 施設 (100%) であった 昨年のKi-67の参加 34 施設に比べ2 施設減少した < 集計結果 > TTF-1 染色についての集計結果は別表に示すごとくである また 日常業務でのTTF-1 染色についても記載している

3 染色の判定結果および講評評価平成 29 年度の免疫染色サーベイではTTF-1をテーマに染色 評価を行った 参加施設は32 施設で 協力メーカーは ( アジレント ロシュ ニチレイ ライカの4 社 各施設で使用した一次抗体メーカーの染色性と見比べ 染色強度や陽性率 染色ムラ 非特異的反応 切片の剥離について メーカーの染色性と遜色ない染色性であった施設を A メーカーの染色性よりも弱いまたは強い 切片の剥離 細胞形態の異常がみられた施設は B 陽性所見がないまたは非特異反応が強すぎるなど判定に影響がある施設は C として評価をおこなった 今回の評価結果は A が18 施設 B が14 施設となり C 評価の施設はなく比較的良好な結果となったが 残念なことに標本を紛失した施設が1 施設あった 染色対象は肺組織を使用し 腫瘍部分と正常部分の確認できるものを使用した 染色方法については自動染色装置を使用した施設が27 施設 (84%) 用手法は5 施設 (16%) であった 自動染色装置はロシュ社が74% と多く ライカ社 22% ニチレイ社 4% のシェアであった 用手法についてはニチレイ社のみであった 自動染色装置で染色した施設と 用手法で染色した施設間での違いは見られなかった 一次抗体についてはアジレント社 (8G7G3/1) を使用している施設が最も多く12 施設 ロシュ (SP141) を使用している施設は9 施設 次いでニチレイ社 (SPT24) は6 施設 ライカ社 (SPT24) は4 施設 日本ターナー株式会社 (8G7G3/1)1 施設であった 染色結果について TTF 1というメジャーな抗体であるがメーカー間での染色性が異なっていた 特にメーカー間というよりは抗体クローンにより染色性の差異が認められた (SP141) 抗体を用いた施設にA 判定が多く染色性がきれいであった (8G7G3/1) 抗体は染色性が比較的薄く ムラの多い施設が多かった TTF 1に関してクローンの違いによる染色性の検討が行われており 肺癌に対する感度と特異性の相違ならびに肺腺癌以外に肺扁平上皮癌や悪性中皮腫との反応性が報告されている 今回は肺腺癌の組織を使用したが 使用するクローンの特性や染色性をよく理解したうえで その評価および判定 解釈について十分注意して染色をする必要がある 参加施設の判定結果 ( ランク総数 ) は ( 表 1) に示し 染色の評価は下記のごとくである ( 表 2) 参加施設の判定結果 ( ランク総数 )( 表 1) 判定 A および B. 診断上支障のない標本 C. 診断上支障をきたす標本 標本数 32 0 (%) 100% 0% 目的とする細胞 部位が染色され 判定に影響のある染色ムラや AおよびB 非特異反応が見られない 病理診断をするにおいて差し支えのな診断上支障のない標本い標本である 目的とする細胞 部位が染色されていない または判定に影響の C ある染色ムラや非特異反応が見られる 診断上支障をきたす標本診断上支障をきたす標本である 結語 TTF-1 染色の精度管理における結果は 診断上支障のない標本 と判定されたのが 32 施設中 32 施設 (100%) という満足な結果が得られた ( 文責 : 病理細胞検査研究班 精度管理解析 編集委員 )

4 平成 29 年度 ( 第 37 回 ) 兵臨技臨床検査精度管理 TTF-1 免疫染色検査報告書 ( 表 2) 施設番号評価備考 B やや感度不足 B 感度不足 B やや感度不足 A A A B コントラスト悪く 非特異反応あり B 感度不足 A A A A A B 感度不足 非特異反応 A B やや感度不足 B 非特異反応 不適切 counter stain A B 共染 A A B 感度不足 B 感度不足 A B 感度不足 A A B 非特異反応 A B わずかに非特異反応 A A

5 免疫染色サーベイ :TTF-1 第 37 回兵臨技 アジレント社 (8G7G3/1) B 評価 : アジレント社 (8G7G3/1) 使用施設 ニチレイ社 (SPT24) 切片上のキズは標本送付時についたものです B 評価 : ニチレイ社 (SPT24) 使用施設 ライカ社 (SPT24) B 評価 : ライカ社 (SPT24) 使用施設 ロシュ社 (SP141) A 評価 : ロシュ社 (SP141) 使用施設

6 TTF-1 染色についての集計 1. 貴施設では 1 ヶ月何枚位 TTF-1 染色をしていますか 染色枚数 施設数 % 10 枚以下 % 11~30 枚 6 19 % 31~50 枚 3 9 % 2. 何 μm で薄切していますか 厚さ (μm) 施設数 % ~ % ~ % ~5 2 6 % 3. 今回貴施設で行った方法を下記の欄に具体的に記入して下さい (1) 染色方法 染色方法施設数 % 自動染色装置 % 用手法 5 16 % 染色装置メーカー 染色装置名 施設数 % ベンチマーク XT 7 26 % ロシュ ベンチマーク GX 5 18 % ベンチマーク ULTRA 8 30 % ライカ BOND MAX 4 15 % BOND Ⅲ 2 7 % ニチレイ HISTOSTAINER 36A 1 4 % (2) 使用試薬 一次抗体 メーカー名 クローン名 自動染色施設数 用手法施設数 合計施設数 アジレント 8G7G3/ % ロシュ SP % ニチレイ SPT % ライカ (Novocastra) SPT % 日本ターナー 8G7G3/ % % 二次抗体 発色基質 メーカー名 ロシュ キット名 自動染色施設数 用手法施設数 合計施設数 I-VIEW DAB ユニハ ーサルキット % ultraview DAB ユニハ ーサルキット % 記載なし % %

7 ライカ Bond Polymer Refine Detection % ニチレイ ヒストファインシンフ ルステイン MAX-PO(MULTI) DAB 基質キット % 染色方法 使用試薬まとめ 一次抗体メーカー / 染色方法 装置名クローン名 検出キット 施設数 I-VIEW DABユニハ ーサルキット 1 アシ レント / 8G7G3/1 ultraview DABユニハ ーサルキット 1 ヘ ンチマークXT ロシュ / SP141 ultraview DABユニハ ーサルキット 2 ニチレイ / SPT24 I-VIEW DABユニハ ーサルキット 1 日本ターナー / 8G7G3/1 I-VIEW DABユニハ ーサルキット 1 I-VIEW DABユニハ ーサルキット 2 アシ レント / 8G7G3/1 ヘ ンチマークGX ロシュ / SP141 I-VIEW DABユニハ ーサルキット 2 アシ レント / 8G7G3/1 ultraview DABユニハ ーサルキット 1 ヘ ンチマークULTRA I-VIEW DABユニハ ーサルキット 3 ロシュ / SP141 ultraview DABユニハ ーサルキット 2 ニチレイ / SPT24 ultraview DABユニハ ーサルキット 1 BOND MAX アシ レント / 8G7G3/1 2 Bond Polymer Refine Detection ライカ / SPT24 2 BOND Ⅲ アシ レント / 8G7G3/1 1 Bond Polymer Refine Detection ライカ / SPT24 1 HISTOSTAINER 36A ニチレイ / SPT24 ヒストファインシンフ ルステイン 1 アシ レント / 8G7G3/1 1 用手法 ニチレイ / SPT24 ヒストファインシンフ ルステイン 3 ライカ / SPT24 1 (3) 染色プロトコール 抗原賦活化 抗原賦活化 自動染色施設数 用手法施設数 施設数 % する % しない % 抗原賦活化方法 自動染色 賦活装置 ロシュ染色装置 ライカ染色装置 緩衝液名 緩衝液 ph 処理温度 処理時間 施設数 60 分 6 64 分 3 CC1 buffer ~ 分 1 90 分 1 記載なし 8 Epitope Retrieval 分 1 Solution 1 30 分

8 用手法 自動制御恒温装置 HEAT PRO Ⅱ 電子レンジ ウォーターバス Epitope Retrieval Solution 2 ヒストファイン抗原賦活液 ヒストファイン抗原賦活液 10mM クエン酸緩衝液 ヒストファイン抗原賦活液 分 1 記載なし 分 分 2 回 分 分 1 60 分 1 その他記載なし 分 1 一次抗体 染色法 ロシュ染色装置 一次抗体メーカー アジレント ロシュ 一次抗体希釈倍率 反応温度 反応時間 施設数 希釈済み 分 1 室温 32 分 1 50 倍 32 分 分 倍 分 1 記載なし 3 16 分 3 希釈済み 分 2 36 分 分 1 記載なし 2 16 分 1 32 分 1 ニチレイ希釈済み 37 日本ターナー 100 倍 分 1 希釈済み 室温 15 分 1 アジレント 200 倍 室温 15 分 1 ライカ 染色装置 希釈済み 室温 15 分 1 ライカ 100 倍 室温 15 分 倍 室温 15 分 1 ニチレイ ニチレイ 希釈済み 室温 30 分 1 用手法 アジレント 100 倍 室温 30 分 1 20 分 1 ニチレイ 希釈済み 室温 30 分 1 60 分 1 ライカ 100 倍 室温 60 分

9 二次抗体 染色法 二次抗体メーカー 反応温度 反応時間 施設数 室温 16 分 1 ロシュ染色装置 ロシュ 37 8 分 分 3 記載なし 5 ライカ染色装置 ライカ 室温 8 分 6 ニチレイ染色装置 ニチレイ 室温 30 分 1 用手法ニチレイ室温 30 分 5 発色基質 染色法 発色基質メーカー 反応時間 施設数 8 分 14 ロシュ染色装置 ロシュ 20 分 1 記載なし 5 ライカ染色装置 ライカ 10 分 6 ニチレイ染色装置 ニチレイ 5 分 1 用手法 ニチレイ 1 分未満 1 2~3 分 1 5 分 1 5~10 分 1 10 分 1 日常業務での TTF-1 染色についての集計 1. 固定液 固定液の種類 施設数 20% ホルマリン 1 10% 中性緩衝ホルマリン 23 15% 中性緩衝ホルマリン 2 20% 中性緩衝ホルマリン 6 2. 採取から固定までの時間 3. 固定時間 時間 施設数 直ちに 分以内 2 30 分以内 4 1 時間以内 3 2 時間以内 1 不明 2 固定時間 施設数 12 時間以内 5 24 時間以内 時間以内 5 72 時間以内 3 4. コントロールの有無 施設数 自動染色 用手法 あり なし

10 コントロールの材料 材料 施設数 マルチコントロール 1 肺 10 甲状腺 6 肺 甲状腺 1 肺腺癌 肺扁平上皮癌 大腸癌を一つにしたもの 1 5. 染色のコツがあれば記入してください 標本撥水防止のため スキムミルクに10 分浸す 背景汚染の対処を行うため 染色装置にかける前に5% スキムミルクに10 分程度反応させる 内部コントロールで染色態度がわかる抗体はコントロールをつけていないが 陽性がわからない抗体は陽性コントロールを同じプレパラートをつけて染色している 6. 日常業務の免疫組織化学での悩みなどあればご記入してください 染色頻度が少ない抗体は使用期限内に使用できないことがある コントロールをどのように作製すれば良いのかわからない 稀に機械のエラーでうまく染まらないことがある コントロールが無く 見つけるのに苦労しています コントロールの確保 管理 コントロールが立てられないものへの対応について( ウイルス関係など ) 一次抗体の種類が多く 管理が難しい p53を染色時 特に検体が骨髄液の場合バックグラウンドが染まってしまう 7. 今後 免疫染色サーベイを行ってほしい項目があれば記入してください CD30 p53 項目の希望ではないですが 試料の送付をブロックでして頂けると助かります

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結果 この CRE サイトには転写因子 c-jun, ATF2 が結合することが明らかになった また これら の転写因子は炎症性サイトカイン TNFα で刺激したヒト正常肝細胞でも活性化し YTHDC2 の転写 に寄与していることが示唆された ( 参考論文 (A), 1; Tanabe et al. 氏名 ( 本籍 ) 田辺敦 ( 神奈川県 ) 学位の種類博士 ( 学術 ) 学位記番号学位授与年月日学位授与の要件学位論文題名 甲第 64 号平成 28 年 3 月 15 日学位規則第 3 条第 2 項該当 RNA ヘリカーゼ YTHDC2 の転写制御機構と癌転移における YTHDC2 の 役割についての解析 論文審査委員 ( 主査 ) 佐原弘益 ( 副査 ) 村上賢 滝沢達也 代田欣二 論文内容の要旨

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