PrimeSTAR® Mutagenesis Basal Kit
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- けんじ おおふさ
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1 PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit 説明書 v201107da
2 目次 I. キットの内容...3 II. 保存...3 III. 本システムの原理...3 IV. プライマー設計について...5 V. 操作...8 VI. 実験例...10 VII. トラブルシューティング...13 VIII. 関連製品...13 IX. 注意
3 PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit は ハイフィデリティー PCR 酵素 PrimeSTAR Max DNA Polymerase による極めて正確でスピーディーな増幅に基づく新しい変異導入システムです 鋳型であるターゲット領域を含むプラスミド DNA と変異導入用プライマーを用いて PrimeSTAR Max で増幅した PCR 産物を そのまま直接大腸菌に形質転換するだけの非常に簡単な操作で 変異導入体を高い効率で取得できます PrimeSTAR Max の有する世界最高の伸長速度 (5 sec/kb) と抜群の正確性により 長鎖のプラスミドでも極めて短時間に増幅でき さらに目的の変異導入部位以外に PCR 増幅エラーが入ることはほとんどありません 独自のプライマー設計により PCR の過程で PCR 産物が環状構造になるため リン酸化反応やライゲーション反応を行うことなく PCR 産物を直接形質転換に使用できます ( 特許出願中 ) I. キットの内容 (25 回分 ) PrimeSTAR Max Premix(2 ) 625 μl Control template(puc118 DNA:50 ng/μl) * 10 μl Control Primer F(20 pmol/μl) * 10 μl Control Primer R(20 pmol/μl) * 10 μl Xho I * 10 μl 10 Xho I buffer * 10 μl *:6 塩基挿入変異のコントロール実験 (10 回分 ) と結果の確認 (10 クローン分 ) が行えます Control template は 滅菌蒸留水で 10 ~ 100 pg/μl に希釈して使用してください ( 用時調製 ) II. 保存 - 20 III. 本システムの原理 プラスミドを鋳型に 5 側が 15 塩基オーバーラップしたプライマーを用いて外向きに PCR 増幅を行うことで オーバーラップ部分が 5 突出した PCR 産物が得られます ( 図 1) この増幅産物は形質転換可能な環状構造をとることができます 本システムでは オーバーラップ部分に変異を導入したプライマーと PrimeSTAR Max を用いて PCR を行い 増幅した PCR 産物で直接大腸菌を形質転換する簡便な方法で変異導入体を取得します 適切な PCR 増幅産物が形質転換可能な環状構造をとるため ライゲーション反応や増幅断片のゲルからの回収は不要です PrimeSTAR Max の極めて高い正確性により 狙った部位のみに確実に変異を導入でき 目的部位以外に PCR エラーが入ることはほとんどありません 3
4 図 1.PCR の過程で形質転換可能な環状二本鎖が得られる原理 4
5 PrimeSTAR Max の正確性について Thermus thermophilus HB8 ゲノム DNA を鋳型として 任意に選択した 8 領域 * ( 増幅サイズはそれぞれ約 500 bp) を PCR 増幅後 ベクターにクローニングし 各配列について複数クローンをピックアップしてそのシーケンスを確認し mutation frequency を求めました PrimeSTAR Max DNA Polymerase で増幅した場合 実際に解析した 塩基のうちエラーはわずか 9 塩基であり PrimeSTAR HS DNA Polymerase や A 社 High Fidelity PCR 酵素以上の正確性を示しました この方法は実際の PCR に即した Fidelity の求め方であり PrimeSTAR Max は正確性が重要な反応に安心して用いることができます *:PCR エラーが起こりやすい GC リッチな領域を選択しています PrimeSTAR Max PrimeSTAR HS A 社 High Fidelity 酵素 Pfu DNA Polymerase Taq DNA Polymerase なお 本キットのコントロール実験において取得したプラスミドの配列を解析した結果 目的部位以外の変異数は 解析した全塩基数 370,656 塩基中わずか 4 塩基のみでした ( エラー率 : %) ( 実験例 2) IV. プライマー設計について 変異導入に用いるプライマーは 図 3 A ~ C に示すように目的とする変異を導入した配列を想定し その部位を含む形で設計します まず変異部位を中心にしてオーバーラップ領域を 15 塩基選定し 次に変異部分から 3 側に 18 塩基伸ばしたものをプライマー配列として選択します 置換 欠失 挿入のいずれの場合もプライマー設計法は同じです 置換および挿入は 1 ~ 15 塩基の範囲で可能です 欠失の場合 サイズに制限はありません また 本法は形質転換にライゲーション反応を必要としないので プライマーのリン酸化は不要です プライマー設計上の注意変異導入プライマーの 5 側 15 塩基のオーバーラップ配列の GC 含量が 75% を超えると PCR 効率が低下し変異体が得られない場合があります その場合には プライマー設計あるいは PCR 条件の検討が必要です また 変異導入プライマーの 5 側 15 塩基のオーバーラップ配列全長がリピート配列の場合 リピート単位の欠失 挿入が起こる場合があります なお PCR で増幅しない配列を含むプラスミドには本法は利用できません 5
6 GAC の部分を TGA に置換する場合 5'-C G T C G T T T T A C A A C G T C G T G A C T G G G A A A A C C C T G G C G T T A C C C A A C -3' 3'-G C A G C A A A A T G T T C G A G C A C T G A C C C T T T T G G G A C C G C A A T G G G T T G -5' 置換を行う 5'-C G T C G T T T T A C A A C G T C G T T G A T G G G A A A A C C C T G G C G T T A C C C A A C -3' 3'-G C A G C A A A A T G T T C G A G C A A C T A C C C T T T T G G G A C C G C A A T G G G T T G -5' オーバーラップ領域を 15 base 選定する ( 変異部分をなるべく中心にする ) 5'-C G T C G T T T T A C A A C G T C G T T G A T G G G A A A A C C C T G G C G T T A C C C A A C -3' 3'-G C A G C A A A A T G T T C G A G C A A C T A C C C T T T T G G G A C C G C A A T G G G T T G -5' 変異部分 から 18 base 3' 側に伸ばす 5'- C G T C G T T T T A C A A C G T C G T T G A T G G G A A A A C C C T G G C G T T A C C C A A C -3' 3'- G C A G C A A A A T G T T C G A G C A A C T A C C C T T T T G G G A C C G C A A T G G G T T G -5' 部分を削除して プライマー配列とする 5'- C G T C G T T G A T G G G A A A A C C C T G G C G T T -3' 3'- C A G C A A A A T G T T C G A G C A A C T A C C C T T -5' * 1 ~ 15 塩基の置換が可能です 図 3 A. 置換変異のためのプライマー設計 の部分を欠失させる場合 5'-C G T C G T T T T A C A A C G T C G T G A C T G G G A A A A C C C T G G C G T T A C C C A A C -3' 3'-G C A G C A A A A T G T T C G A G C A C T G A C C C T T T T G G G A C C G C A A T G G G T T G -5' 5'-C G T C G T T T T A C A A C G T C G T G A C 3'-G C A G C A A A A T G T T C G A G C A C T G 5'-C G T C G T T T T A C A A C G T C G T G A C 3'-G C A G C A A A A T G T T C G A G C A C T G 5'- C G T C G T T T T A C A A C G T C G T G A C 3'- G C A G C A A A A T G T T C G A G C A C T G 5'- T C G T G A C 3'- C A A A A T G T T C G A G C A C T G 欠失を行う G A A A A C C C T G G C G T T A C C C A A C -3' C T T T T G G G A C C G C A A T G G G T T G -5' オーバーラップ領域を 15 base 選定する ( 変異部分をなるべく中心にする ) G A A A A C C C T G G C G T T A C C C A A C -3' C T T T T G G G A C C G C A A T G G G T T G -5' 変異部分 から 18 base 3' 側に伸ばす G A A A A C C C T G G C G T T A C C C A A C -3' C T T T T G G G A C C G C A A T G G G T T G -5' 部分を削除して プライマー配列とする G A A A A C C C T G G C G T T A C C -3' C T T T T G G G-5' * 欠失のサイズに制限はありません 図 3 B. 欠失変異のためのプライマー設計 6
7 の部分に (CTCGAG) を挿入する場合 5'-C G T C G T T T T A C A A C G T C G T G A C T 3'-G C A G C A A A A T G T T C G A G C A C T G A G G G A A A A C C C T G G C G T T A C C C A A C -3' C C C T T T T G G G A C C G C A A T G G G T T G -5' Insertion を行う 5'-CG T C G T T T T A C A A C G T C G T G A C T C T C G A G GG G A A A A C C C T G G C G T T A C C C A A C-3' 3'-GC A G C A A A A T G T T C G A G C A C T G A G A G C T C C C C T T T T G G G A C C G C A A T G G G T T G-5' オーバーラップ領域を 15 base 選定する ( 変異部分をなるべく中心にする ) 5'-CG T C G T T T T A C A A C G T C G T G A C T C T C G A G G G G A A A A C C C T G G C G T T A C C C A A C-3' 3'-GC A G C A A A A T G T T C G A G C A C T G A G A G C T C C C C T T T T G G G A C C G C A A T G G G T T G-5' 変異部分 から 18 base 3' 側に伸ばす 5'- C G T C G T T T T A C A A C G T C G T G A C T C T C G A G G G G A A A A C C C T G G C G T T A C C C A A C-3' 3'-G C A G C A A A A T G T T C G A G C A C T G A G A G C T C C C C T T T T G G G A C C G C A A T G G G T T G-5' 部分を削除して プライマー配列とする 5'-G A C T C T C G A G G G G A A A A C C C T G G C G T T A-3' 3'-A A A A T G T T C G A G C A C T G A G A G C T C C C C T T -5' * 1 ~ 15 塩基の挿入が可能です 図 3 C. 挿入変異プライマーの設計 7
8 V. 操作 1) 精製したプラスミド (~ 10 kb *1 ) の濃度を測定して 滅菌蒸留水で 10 ~ 100 pg/μl *2 に希釈する ( 用時調製 ) 2) 下記に示す反応液を調製する < Mutagenesis PCR 反応液組成 > PrimeSTAR Max Premix(2 ) Primer 1 Primer 2 Plasmid(10 ~ 100 pg/μl) 滅菌蒸留水 使用量 25 μl 10 pmol 10 pmol 1 μl up to 50 μl 最終濃度 μm 0.2 μm 3) 下記の条件で PCR を行う PCR 条件 sec 15 sec 5 sec./kb 30 cycles *3 PrimeSTAR Max DNA Polymerase を用いた高速増幅システムでは 伸長因子の効果を最大限に発揮させるために 3 ステップでの反応をお勧めします 4) 目的サイズの増幅産物を確認後 * 4 PCR 反応液 2 μl をコンピテントセル * μl に添加し 形質転換を行う * 1: プラスミドサイズが大きくなるに従い 増幅効率とコンピテントセルの形質転換効率 (cfu/μg プラスミド DNA) が低下し形質転換体の出現数は減少します プラスミドサイズと形質転換効率の関係の一例を以下に示します 鋳型プラスミド由来のバックグラウンドを見積もる際の参考にしてください 形質転換効率は鋳型の質 配列によっても変化し プラスミドを PCR サイクルに供した後の形質転換ではさらに小さくなります コンピテントセルに余裕がある場合は変異導入用プライマーなしで反応した場合の鋳型に由来するバックグラウンドをあらかじめ測定することをお勧めします プラスミドサイズ形質転換効率 (cfu/μg プラスミド ) 3.2 kb 7.2 kb 11.7 kb * 2: 重要 PCR 反応液 (50 μl) に添加する鋳型プラスミド量は 10 pg から 100 pg に設定してください 本法は少量の鋳型プラスミド DNA より PCR の過程で変異部位を含む形質転換可能な環状二本鎖 DNA 分子を効率よく作製することを特長としています PCR 反応液 (50 μl) 中のプラスミド DNA 量が 100 pg を超えると 鋳型プラスミド由来のバックグラウンドのため形質転換後の変異導入体の取得率が低下する恐れがあります * 3: 鋳型プラスミド DNA(10 ~ 100 pg) から大腸菌を効率よく形質転換するために十分な変異導入環状二本鎖 DNA 分子を得るためには 30 サイクルの反応が必要です * 4: 目的サイズの増幅産物が少なくても電気泳動で増幅が確認できる場合は操作を継続してください 非特異的増幅産物が混在していても 多くの場合 目的の変異導入体を得ることが出来ます 目的サイズの増幅産物が電気泳動で確認できない場合はトラブルシューティングに従い PCR からやり直すことをお勧めします 8
9 * 5: プラスミドサイズが大きい場合や PCR 後の目的サイズの増幅産物量が少ない場合に形質転換体が得にくいことがあります 10 8 cfu/μg puc118 以上の形質転換効率を持つコンピテントセルを使用してください * 6: エレクトロポレーションにより形質転換を行う場合は エタノール沈殿などにより DNA を回収してから行ってください エレクトロポレーションにおいても高い陽性率で変異体を取得することができますが 変異導入プライマーが効率よく働かず 環状構造をとる PCR 産物が少ない場合に 直鎖状の PCR 産物が末端の平滑部で連結した ( 変異導入部位がタンデムに連結した ) プラスミドを有するコロニーがバックグラウンドとして生じる場合があるので ご注意ください ( 通常のケミカルコンピテントセルを使用した場合には このようなバックグラウンドが生じることはほとんどありません ) * 7: コンピテントセルの種類により PCR 反応液をそのまま添加すると 反応液組成の影響で形質転換が阻害される場合が稀にあります この場合 PCR 反応液を 5 倍希釈した溶液を使用するか またはエタノール沈殿により DNA を回収してから使用することで形質転換体を効率よく取得することができます タカラバイオの E.coli HST08 Premium JM109 DH5α HST02 Competent cells を使用する場合は PCR 反応液をそのまま使用しても問題ありません < コントロール反応 > puc118 DNA を鋳型にしたコントロール反応の場合 β- ガラクトシダーゼの α 相補性が利用できる大腸菌を形質転換すると X-Gal IPTG を含む L-Amp プレート上で変異導入体は白コロニーとなり 鋳型由来のバックグラウンドは青コロニーとなります また 白コロニーより調製したプラスミドを制限酵素 Xho I で切断することにより変異導入を確認することができます 実験例 1 および 2 を参考にしてください 9
10 VI. 実験例 実験例 - 1; 変異導入効率の確認 方法 puc118 DNA 10 pg を鋳型に 前述の プライマー設計について で例示した各変異導入 ( 置換 欠失 挿入 ) 用プライマーと PrimeSTAR Max を用いて PCR(50 μl) を行った その 2 μl を E.coli JM109 コンピテントセル ( cfu/μg puc118)100 μl に添加し 0 30 分 秒の処理後 SOC 培地 1 ml を加えて 37 で 1 時間振とう培養した そのうち 100 μl を選択プレート (LB + Amp IPTG X-gal) 上で培養し 白コロニー ( 変異体 ) と青コロニー ( バックグラウンド ) をカウントした PCR 条件 sec 15 sec 20 sec 30 cycles 結果 表 1. 変異導入効率変異のタイプ 白コロニー 青コロニー 変異導入効率 置換 (3 塩基 ) 1, % 欠失 (3 塩基 ) % 挿入 (6 塩基 ) 1, % 6 塩基挿入に用いたプライマーは キットコンポーネントの Control primer F と Control primer R に相当します 表 1 に示すように puc118 DNA 10 pg を鋳型にした場合 3 種類の変異導入体 ( 置換 欠失 挿入 ) が 99% 以上の非常に高い確率で取得できることを確認しました 実験例 - 2; 変異導入の正確性の検証 方法 実験例 - 1 で得た挿入変異導入体の白コロニー 117 個よりそれぞれプラスミドを調製し そのすべてのプラスミドについて全長の塩基配列を解析した 結果 117 クローンすべてにおいて目的の変異導入が確認されました また 目的部位以外の変異は全塩基数 370,656 塩基中わずか 4 塩基のみでした ( エラー率 : %) ハイフィデリティ PCR 酵素 PrimeSTAR Max DNA Polymerase では PCR 増幅エラーがほとんど無いため 非常に正確な変異導入が可能です 10
11 実験例 - 3;8.5 kb の欠失変異体の作製 方法 puc118 DNA の Hinc II サイトに 8.5 kb 断片を挿入したプラスミドを鋳型とし その 8.5 kb を欠失した変異体の取得を試みた 前述のプライマー設計方法に基づいて作製した変異導入プライマーを用い プラスミド 100 pg を鋳型として PrimeSTAR Max による PCR 増幅を行った (50 μl 反応系 ) その 2 μl を E.coli JM109 コンピテントセル ( cfu/μg puc118)100 μl に添加し 0 30 分 秒の処理後 SOC 培地 1 ml を加えて 37 で 1 時間振とう培養した そのうち 100 μl を選択プレート (LB + Amp IPTG X-gal) 上で培養し 青コロニー ( 変異導入体 ) と白コロニー ( バックグラウンド ) をカウントした さらに 得られた青コロニー ( 変異導入体 )10 個よりそれぞれプラスミドを調製し プラスミドサイズおよび Hinc II サイト復活の確認した PCR 条件 sec 15 sec 20 sec 30 cycles 結果 プラスミド 100 pg を鋳型とした場合 変異導入体 ( 青コロニー )158 個に対しバックグラウンド ( 白コロニー ) は 3 個で 98% の確率で変異体が取得できました 変異導入体 ( 青コロニー )10 個より取得したプラスミドはすべて 8.5 kb が欠失したサイズのプラスミドであり ( 図 4A) Hinc II で 1 箇所切断され 3.2 kb の DNA 断片が得られることから ( 図 4B) 正しく変異導入 ( 欠失 ) できていることが確認されました M M レーン 1: 変異導入前 2 ~ 11: 変異導入後 M:λ -Hind III digest 図 4 A. プラスミドサイズの確認 (non-cut で電気泳動 ) M M レーン 1: 変異導入前 2 ~ 11: 変異導入後 M:λ -Hind III digest 図 4 B.Hinc II 切断後の電気泳動 11
12 実験例 - 4; プラスミドサイズによる変異導入効率の変動 方法 サイズが 3.2 kb 7.2 kb 11.7 kb のプラスミド ( いずれも puc118 DNA ベース ) それぞれ 100 pg を鋳型に Xho I サイトを導入する変異導入プライマーと PrimeSTAR Max を用いて PCR(50 μl 反応系 ) を行った その 2 μl を E.coli JM109 コンピテントセル ( cfu/μg puc118)100 μl に添加し 0 30 分 秒の処理後 SOC 培地 1 ml を加えて 37 で 1 時間振とうした そのうち 100 μl を選択プレート (LB + Amp) 上で培養し コロニーをカウントした さらに 得られたコロニー ( 変異導入体 ) 各 10 個よりプラスミドを調製して Xho I 切断を行い Xho I サイトの有無ならびに変異導入の成否 ( 正しく変異導入が起こった場合 プラスミドはそれぞれ一箇所で切断される ) を判定した PCR 条件 sec 15 sec X sec 30 cycles X:20 秒 (3.2 kb) 40 秒 (7.2 kb) 60 秒 (11.7 kb) 結果 3.2 kb 7.2 kb 11.7 kb の各プラスミドを用いた変異導入 ( 挿入 ) 実験でそれぞれ 1,496 個 534 個 21 個のコロニーが得られました それらより任意に取得したプラスミドの変異導入効率は それぞれ 100%(10/10) 100%(10/10) 80%(8/10) でした ( 図 5) 鋳型のプラスミドサイズが大きくなるに従い得られる変異体の数は減少しますが 変異導入効率は 7.2 kb のプラスミドで 100% 11.7 kb のプラスミドでも 80% と高効率であることが確認できました 3.2 kb 7.2 kb 11.7 kb 図 5.Xho I 切断後の電気泳動 ( 上 ;3.2 kb 中 ;7.2 kb 下 ;11.7 kb) 12
13 VII. トラブルシューティング 現象 改善するポイント 対策 PCR において目的サイズの増幅が全く見られない 少ない アニーリング温度 2 ずつ下げてみる 2 ずつ上げてみる 2 step PCR(98 10 sec/ 68 5 ~ 10 sec/kb) を試す サイクル数 35 ~ 40 サイクルに設定する エクステンション時間 エクステンション時間を 10 sec/kb に設定する 鋳型の純度 DNA の精製度を上げる PCR においてエキストラバンドがでる スメアする 形質転換体が得られない 少ない 変異を含まない形質転換体が多い アニーリング温度 アニーリング時間エクステンション時間鋳型の純度コンピテントセルの形質転換効率 サイクル数タンパク質発現が大腸菌に致死的 PCR 反応液中の鋳型プラスミド量が多い 2 ずつ上げてみる 2 step PCR(98 10 sec/ 68 5 ~ 10 sec/kb) を試す 5 sec に設定する エクステンション時間を 10 sec/kb に設定する DNA の精製度を上げる 10 8 cfu/μg puc118 以上の効率のコンピテントセルを使用する 形質転換に使用する PCR 溶液を 4 μl に増やす 35 ~ 40 サイクルに設定する 適切な宿主 - ベクター系で行う PCR(50 μl) を鋳型プラスミド量 10 ~ 100 pg の範囲で行う VIII. 関連製品 PrimeSTAR Max DNA Polymerase( 製品コード R045A) E. coli HST08 Premium Competent Cells( 製品コード 9128) E.coli JM109 Competent Cells( 製品コード 9052) E.coli DH5 α Competent Cells( 製品コード 9057) E.coli HST2 Competent Cells( 製品コード 9127) IX. 注意 本製品は研究用として販売しております ヒト 動物への医療 臨床診断用には使用しないようご注意ください また 食品 化粧品 家庭用品等として使用しないでください タカラバイオの承認を得ずに製品の再販 譲渡 再販 譲渡のための改変 商用製品の製造に使用することは禁止されています 本説明書に記載されている商品名などは 特に記載がなくても各社の商標または登録商標です ライセンスなどに関する最新の情報は弊社ウェブカタログをご覧ください 13
14 NOTICE TO PURCHASER:LIMITED LICENSE [L15] Hot Start PCR Licensed under U.S. Patent No. 5,338,671 and 5,587,287 and corresponding patents in other countries. [M54] PrimeSTAR HS DNA Polymerase This product is the subject of the pending U.S. patent application and its foreign counterparts. [M70] PrimeSTAR Mutagenesis This product is the subject of the pending Japanese patent application. 14
15 15
16 201107Da
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Bacterial 16S rDNA PCR Kit
研究用 Bacterial 16S rdna PCR Kit 説明書 v201802da 微生物の同定は 形態的特徴 生理 生化学的性状 化学分類学的性状などを利用して行われますが これらの方法では同定までに時間を要します また 同定が困難な場合や正しい結果が得られない場合もあります 近年 微生物同定にも分子生物学を利用した方法が採用されるようになり 微生物の持つ DNA を対象として解析を行う方法が活用されています
Gen とるくん™（酵母用）High Recovery
研究用 Gen とるくん ( 酵母用 ) High Recovery 説明書 v201510da Gen とるくん ( 酵母用 )High Recovery は 細胞壁分解酵素による酵母菌体処理と塩析による DNA 精製の組み合わせにより 効率良く酵母ゲノム DNA を抽出 精製するためのキットです 本キットを用いた酵母ゲノム DNA 調製操作は 遠心による酵母菌体の回収 GenTLE Yeast
Bacterial 16S rDNA PCR Kit
研究用 Bacterial 16S rdna PCR Kit 説明書 v201307da 微生物の同定は 形態的特徴 生理 生化学的性状 化学分類学的性状などを利用して行われますが これらの方法では同定までに時間を要します また 同定が困難な場合や正しい結果が得られない場合もあります 近年 微生物同定にも分子生物学を利用した方法が採用されるようになり 微生物の持つ DNA を対象として解析を行う方法が活用されています
LA PCR™i n vitro Cloning Kit
研究用 LA PCR in vitro Cloning Kit 説明書 v201201da 本キットは Cassette および Cassette Primer を使用することにより cdna やゲノム上の未知領域を特異的に増幅させる従来の PCR in vitro Cloning Kit に 長鎖 DNA を効率良く増幅する LA PCR Technology を応用したシステムです これにより
3'-Full RACE Core Set
研究用 3'-Full RACE Core Set 説明書 v201703da RNA の解析において RT-PCR を利用することにより目的の領域を増幅した後 クローニングやシーケンスを行うことが可能です しかしながら mrna から完全長の cdna を得ることは困難であることが多く この様な場合 得られた cdna の情報を元にさらに上流や下流をクローニングする RACE(Rapid Amplification
Microsoft Word - FMB_Text(PCR) _ver3.doc
2.PCR 法による DNA の増幅 現代の分子生物学において その進歩に最も貢献した実験法の1つが PCR(Polymerase chain reaction) 法である PCR 法は極めて微量の DNA サンプルから特定の DNA 断片を短時間に大量に増幅することができる方法であり 多大な時間と労力を要した遺伝子クローニングを過去のものとしてしまった また その操作の簡便さから 現在では基礎研究のみならず臨床遺伝子診断から食品衛生検査
cDNA cloning by PCR
cdna cloning/subcloning by PCR 1. 概要 2014. 4 ver.1 by A. Goto & K. Takeda 一般的に 細胞または組織由来の RNA から作製した cdna(cdna pool) から 特定の cdna をベクターに組み込む操作を cdna cloning と呼ぶ その際 制限酵素認識配列を付与したオリゴ DNA primer を用いた PCR
PrimeScript®One Step RT-PCR Kit Ver. 2
PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2 説明書 v201112da PCR(Polymerase Chain Reaction) は 目的とする DNA 領域をはさむ 2 種のプライマーを用いて特定の DNA 塩基配列を増幅する反応です PCR 法は原理的に DNA を増幅する反応であり RNA は直接の鋳型とはなりえませんが 逆転写酵素によって RNA から
遺伝子検査の基礎知識
リアルタイム PCR( インターカレーター法 ) 実験ガイドこの文書では インターカレーター法 (TB Green 検出 ) によるリアルタイム PCR について 蛍光検出の原理や実験操作の流れなどを解説します 実際の実験操作の詳細については 各製品の取扱説明書をご参照ください - 目次 - 1 蛍光検出の原理 2 実験に必要なもの 3 実験操作法 4 結果の解析 1 1 蛍光検出の原理 インターカレーターによる蛍光検出の原理
pCold™ TF DNA
研究用 pcold TF DNA 説明書 v201810da タンパク質の構造や機能の解明はポストゲノムの重要な研究対象で 効率のよいタンパク質生産システムはポストゲノム解析に必須の基盤技術です 組換えタンパク質の生産には大腸菌を宿主とする発現系が広く利用されています しかしながら 大腸菌発現系は扱いやすく 低コストである反面 遺伝子によっては発現できない あるいは発現タンパク質が不溶化するという問題が起こることがあります
pBAsi DNA シリーズ
研究用 pbasi DNA シリーズ 説明書 v201603da 目次 I. 製品説明と原理... 3 II. 準備 : ヘアピン型 RNA を発現させるための DNA 合成... 5 III. pbasi ベクターへのヘアピン型 RNA 発現のための合成 DNA の挿入... 6 III-1. 必要な器具 装置... 6 III-2. 用意するもの... 6 III-3. ベクターおよびインサート
pCold™ ProS2 DNA
研究用 pcold ProS2 DNA 説明書 v201810da タンパク質の構造や機能の解明はポストゲノムの重要な研究対象で 効率の良いタンパク質生産システムはポストゲノム解析に必須の基盤技術です 組換えタンパク質の生産には大腸菌を宿主とする発現系が広く利用されています しかしながら 大腸菌発現系は扱いやすく 低コストである反面 遺伝子によっては発現できない あるいは発現タンパク質が不溶化するという問題が起こることがあります
PrimeScript® One Step RT-PCR Kit Ver. 2 (Dye Plus)
研究用 PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2 (Dye Plus) 説明書 v201312da PCR(Polymerase Chain Reaction) は 目的とする DNA 領域をはさむ 2 種のプライマーを用いて特定の DNA 塩基配列を増幅する反応です PCR 法は原理的に DNA を増幅する反応であり RNA は直接の鋳型とはなりえませんが 逆転写酵素によって
16S (V3-V4) Metagenomic Library Construction Kit for NGS
研究用 16S (V3-V4) Metagenomic Library Construction Kit for NGS 説明書 v201705da 本製品は イルミナ社 MiSeq で 16S rrna 細菌叢解析を行うための PCR 増幅キットです 細菌 16S rrna 遺伝子の V3-V4 領域を対象とし PCR 酵素に 多様な配列を効率よく増幅可能な Tks Gflex DNA Polymerase
SC-85X2取説
I II III IV V VI .................. VII VIII IX X 1-1 1-2 1-3 1-4 ( ) 1-5 1-6 2-1 2-2 3-1 3-2 3-3 8 3-4 3-5 3-6 3-7 ) ) - - 3-8 3-9 4-1 4-2 4-3 4-4 4-5 4-6 5-1 5-2 5-3 5-4 5-5 5-6 5-7 5-8 5-9 5-10 5-11
<4D6963726F736F667420506F776572506F696E74202D208376838C835B83938365815B835683878393312E707074205B8CDD8AB78382815B83685D>
i i vi ii iii iv v vi vii viii ix 2 3 4 5 6 7 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
5’-Full RACE Core Set
研究用 5 -Full RACE Core Set 説明書 v201703da RNA の解析において RT-PCR を利用することにより 目的の領域を増幅した後 クローニングやシーケンスを行うことが可能です しかしながら mrna から完全長の cdna を得ることは非常に困難であることが多く このような場合 得られた cdna の情報を元に さらに上流や下流をクローニングする RACE(Rapid
DNA/RNA調製法 実験ガイド
DNA/RNA 調製法実験ガイド PCR の鋳型となる DNA を調製するにはいくつかの方法があり 検体の種類や実験目的に応じて適切な方法を選択します この文書では これらの方法について実際の操作方法を具体的に解説します また RNA 調製の際の注意事項や RNA 調製用のキット等をご紹介します - 目次 - 1 実験に必要なもの 2 コロニーからの DNA 調製 3 増菌培養液からの DNA 調製
Western BLoT Rapid Detect
研究用 Western BLoT Rapid Detect 説明書 v201212 Western BLoT Rapid Detect は 標識二次抗体の代わりに独自の IgG Detector(HRP labeled) を利用して一次抗体を検出するウェスタンブロッティング専用の検出試薬キットです 本製品を利用することで 標識二次抗体を用いて検出する従来法ではできなかった迅速検出 高感度検出 シグナルの増強
pRI 201 DNA シリーズ
研究用 pri 201 DNA シリーズ ( 植物形質転換用高発現ベクター ) 説明書 v201703da pri 201 DNA シリーズは pri 101 DNA シリーズ ( 製品コード 3262/3263) よりも更に高い形質転換植物における外来遺伝子の発現を目的としたベクターです カリフラワーモザイクウイルス (CaMV) の 35S プロモーターの下流に ADH(Alcohol Dehydrogenase)
[ ]...1 [ ] Inverse PCR...2 [ ]...3 [ ]...4 Plasmid PCR Primer...4 PCR...5 PCR 2nd-site mutation...5 Plasmid...6 [ ]...8 Inverse PCR Dpn I
![[ ]...1 [ ] Inverse PCR...2 [ ]...3 [ ]...4 Plasmid PCR Primer...4 PCR...5 PCR 2nd-site mutation...5 Plasmid...6 [ ]...8 Inverse PCR Dpn I](/thumbs/82/85541655.jpg "[ ]...1 [ ] Inverse PCR...2 [ ]...3 [ ]...4 Plasmid PCR Primer...4 PCR...5 PCR 2nd-site mutation...5 Plasmid...6 [ ]...8 Inverse PCR Dpn I")
06-12 KOD - Plus- Mutagenesis Kit (Code No. SMK-101) TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN 0 [ ]...1 [ ] Inverse PCR...2 [ ]...3 [ ]...4 Plasmid.....4 PCR Primer...4 PCR...5 PCR 2nd-site
コメDNA 抽出キット（精米、玄米1 粒スケール）
食品 環境分析用 コメ DNA 抽出キット ( 精米 玄米 1 粒スケール ) 説明書 v201703da 本キットは未加熱の精米あるいは玄米 1 粒から DNA の調製を行う際に使用します 最終的に回収された DNA 溶液は 直接 PCR 反応などに利用することができ また 制限酵素処理やサブクローニングに使用することもできます 本キットを用いた DNA 調製には 劇物であるフェノールやクロロホルムは使用しません
取扱説明書
19-02 One-step RT-PCR Kit RT-PCR Quick Master Mix (Code No. PCR-311F) 取扱説明書 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN A3647K - 目次 - [1] はじめに 1 [2] 製品内容 2 [3] 使用方法 3 [4] 実施例 5 [5] 関連プロトコル 6 [6]
井上先生 報告書 清水
派遣研究室 : ボン大学 Life and Medical Sciences(LIMES) Institute, Prof.Michael Hoch 研究室 研究 交流概要近年 TAL effector nuclease (TALEN) や CRISPR/Cas9 システムが効率的で簡便なゲノム編集技術として注目されている 派遣者は TALEN を用いてゼブラフィッシュに遺伝子変異を導入する実験を行った
Mutan-Express Km Enzyme/Oligo Set, Vector/Host Set
製品コード 6090 製品コード 6091 Site-directed mutagenesis system Mutan -Express Km Enzyme/Oligo Set( 製品コード 6090 ) Vector/Host Set( 製品コード 6091 ) 説明書 New Site-Directed Mutagenesis System Mutan-Express Km は ODA 法 (
TB Green™ Fast qPCR Mix
研究用 製品コード RR430S RR430A TB Green Fast qpcr Mix 説明書 タカラバイオでは インターカレーター法のリアルタイム PCR(qPCR) 試薬の製品名を 2017 年 10 月下旬より順次 TB Green シリーズ に名称変更いたします 製品コードや試薬の性能に変更はありません これまで通りご使用ください なお ロット切り替え時の変更となりますので 製品ラベルやチューブラベルに先行してウェブサイト
これわかWord2010_第1部_100710.indd
i 1 1 2 3 6 6 7 8 10 10 11 12 12 12 13 2 15 15 16 17 17 18 19 20 20 21 ii CONTENTS 25 26 26 28 28 29 30 30 31 32 35 35 35 36 37 40 42 44 44 45 46 49 50 50 51 iii 52 52 52 53 55 56 56 57 58 58 60 60 iv
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i 1 1 2 2 3 3 4 4 4 5 7 8 8 9 9 10 11 13 14 15 16 17 19 ii CONTENTS 2 21 21 22 25 26 32 37 38 39 39 41 41 43 43 43 44 45 46 47 47 49 52 54 56 56 iii 57 59 62 64 64 66 67 68 71 72 72 73 74 74 77 79 81 84
これでわかるAccess2010
i 1 1 1 2 2 2 3 4 4 5 6 7 7 9 10 11 12 13 14 15 17 ii CONTENTS 2 19 19 20 23 24 25 25 26 29 29 31 31 33 35 36 36 39 39 41 44 45 46 48 iii 50 50 52 54 55 57 57 59 61 63 64 66 66 67 70 70 73 74 74 77 77
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i ii iii iv v 43 43 vi 43 vii T+1 T+2 1 viii 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 a) ( ) b) ( ) 51
2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 I II III 11 IV 12 V 13 VI VII 14 VIII. 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 _ 33 _ 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 VII 51 52 53 54 55 56 57 58 59
IFN Response Watcher(for RNAi experiment)
IFN Response Watcher (for RNAi experiment) 説明書 v201111 哺乳動物細胞などでは 長い二本鎖 RNA(dsRNA) がインターフェロン応答を誘導し 図 1 に示す二つの経路が活性化されることで非特異的な転写の抑制が起こることが知られていました RNAi 実験に用いられる sirna(short interfering RNA) は短い dsrna を使用することにより
平成18年版 男女共同参画白書
i ii iii iv v vi vii viii ix 3 4 5 6 7 8 9 Column 10 11 12 13 14 15 Column 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Column 27 28 29 30 Column 31 32 33 34 35 36 Column 37 Column 38 39 40 Column 41 42 43 44 45
TB Green™ Premix Ex Taq ™ II (Tli RNaseH Plus)
研究用 TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) 説明書 Lot. AGY1013N より 本製品の長期保存 (6 ヵ月以上 ) 温度が 20 に変わりました いったん融解後は 4 保存し 6 ヵ月を目途にご使用ください タカラバイオでは インターカレーター法のリアルタイム PCR(qPCR) 試薬の製品名を 2017 年 10 月下旬より順次 TB Green
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i 1 1 2 3 5 5 6 7 7 8 9 9 10 11 11 11 12 2 13 13 14 15 15 16 17 17 ii CONTENTS 18 18 21 22 22 24 25 26 27 27 28 29 30 31 32 36 37 40 40 42 43 44 44 46 47 48 iii 48 50 51 52 54 55 59 61 62 64 65 66 67 68
MLPA 法 Q&A 集
MLPA 法 Q&A 集 目次 1. MLPA 法の導入 Q1. 導入にあたり 何が必要になりますか? Q2. 実験にはどのようなサンプルが必要でしょうか? Q3. サンプルDNAはどれくらい用意すれば良いですか? Q4. キャピラリーシーケンサが自施設に無い場合でも実験はできますか? Q5. FFPE 検体でも実験はできますか? 2. 実験のセットアップ Q1. 実験において重要なポイントはありますか?
01_.g.r..
I II III IV V VI VII VIII IX X XI I II III IV V I I I II II II I I YS-1 I YS-2 I YS-3 I YS-4 I YS-5 I YS-6 I YS-7 II II YS-1 II YS-2 II YS-3 II YS-4 II YS-5 II YS-6 II YS-7 III III YS-1 III YS-2
ii iii iv CON T E N T S iii iv v Chapter1 Chapter2 Chapter 1 002 1.1 004 1.2 004 1.2.1 007 1.2.2 009 1.3 009 1.3.1 010 1.3.2 012 1.4 012 1.4.1 014 1.4.2 015 1.5 Chapter3 Chapter4 Chapter5 Chapter6 Chapter7
活用ガイド （ソフトウェア編）
(Windows 95 ) ii iii iv NEC Corporation 1999 v P A R T 1 vi P A R T 2 vii P A R T 3 P A R T 4 viii P A R T 5 ix x P A R T 1 2 3 1 1 2 4 1 2 3 4 5 1 1 2 3 4 6 5 6 7 7 1 1 2 8 1 9 1 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4
KOD FX 説明書.pdf
14-04 取扱説明書 高成功率 PCR 酵素 KOD FX Code No. KFX-101 Code No. KFX-101X5 Code No. KFX-101X10 保存温度 -20 本製品は KOD DNA Polymerase をベースに開発された高性能 PCR 試薬です 優れた 増幅成功率 伸長性 増 幅効率 を示し 幅広い PCR において確実な結果を期待できます また 本酵素には
困ったときのQ&A
ii iii iv NEC Corporation 1997 v P A R T 1 vi vii P A R T 2 viii P A R T 3 ix x xi 1P A R T 2 1 3 4 1 5 6 1 7 8 1 9 1 2 3 4 10 1 11 12 1 13 14 1 1 2 15 16 1 2 1 1 2 3 4 5 17 18 1 2 3 1 19 20 1 21 22 1
Human Housekeeping Gene Primer Set, Mouse Housekeeping Gene Primer Set, Rat Housekeeping Gene Primer Set
研究用 Human Housekeeping Gene Primer Set ( 製品コード 3790) Mouse Housekeeping Gene Primer Set ( 製品コード 3791) Rat Housekeeping Gene Primer Set ( 製品コード 3792) 説明書 v201710da 通常 リアルタイム RT-PCR による遺伝子発現解析は相対定量により行われ