Ion Reporter ソフトウェアデモンストレーション Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel を用いたがん部および非がん部の体細胞変異比較解析 1 Ion Torrent システムを用いた実験例 Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel を 2 サンプル実施 ランレポート ランレポート サンプル 1 サンプル 2 2
研究目的 がん部と非がん部の体細胞変異を比較 Variant Callerでは サンプルごとの検出変異のみを表示 Hg19をリファレンスに検出 Variant Caller プラグインレポート Variant Caller プラグインレポート 1,300 箇所 2,000 箇所 Sample_1 1300 9 Sample_2 2000 15 サンプル 1 非がん部 (Normal) サンプル 2 がん部 (Tumor) 3 Ion Reporter ソフトウェアを用いた比較解析 がん部と非がん部で異なる変異のみを表示 全 2,000 箇所 がん部特異的 700 箇所 Ion Reporter で違いを検出 非がん部共通 1,300 箇所 4
Ion Reporter ソフトウェアによる変異の絞り込み がん部に特異的な変異の中から意義のある変異を抽出 がん部 Ion Reporter で絞り込み 非がん部 5 解析の流れ ワークフロー Torrent Server Ion Reporter のサーバー PDF や Excel ファイル データ 転送 解析 絞り込み レポート 6
事前準備 各種設定 アカウント作成 ID パスワード Torrent Server Ion Reporter のサーバー Excel や PDF ファイル データ 転送 解析 絞り込み レポート ラン設定 サンプル名 がん部 非がん部 転送設定 転送用プラグイン アカウント情報 解析設定 サンプル選択 がん部 非がん部比較 絞り込み設定 アミノ酸配列 既知 未知 レポート作成 結果確認 Excel を PDF に変換 7 Ion Reporter アクセス画面 解析条件 サンプル選択 がん部 非がん部比較 1 登録アドレス 2 登録パスワード 3 ログイン ログインのワンポイント ブラウザのバージョン確認 最新版が望ましい 8
ホーム画面 1 3 2 1 サンプル読込 : 転送済みランデータ 2 解析条件 : カスタマイズ用 3 データ解析 : 閲覧や絞り込み 9 サンプルファイルの注意点 比較解析には BAM ファイルが必要 がん部と非がん部の比較 VCFファイルではアノテーション機能に限定 解析不能 1 サンプル読込 : 転送済みランデータ サンプルファイルのワンポイント BAM: 塩基配列 位置 QV VCF: 変異情報のみ サンプル画面でのデータインポートは VCF のみ BAM ファイルはインポートできない データ転送プラグイン必須 手動でのデータ転送プラグイン使用時に注意 Ion Reporter Uploader BAM ファイルを忘れずに 10
サンプル画面 1 サンプル読込 : 転送済みランデータ VCF ファイルの手動インポート サンプル画面のワンポイント データの転送が完了しているか確認できる 11 目的のサンプル : CCP の Normal と Tumor 解析へ 12
解析を始める : Launch Analysis 3 データ解析 : 閲覧や絞り込み 解析条件を選択 Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel Tumor - Normal サンプルファイルを選択 Tumor Normal 設定の確認 解析スタート 解析条件のワンポイント すでに最適化されている 目的に合うものを選択 13 解析画面 解析画面のワンポイント 解析が始まるとリストに追加 未解析では何も表示されない 14
解析の始め方 まずは Launch Analysis をクリックし Manual を選択 15 解析の進め方 Workflow から順に選択 解析条件 16
解析条件の探し方 目的に応じて絞り込み AmpliSeq, Tumor-Normal 17 解析条件を見つけたら 目的の Workflow をハイライト Summary に条件の概要次へ 18
サンプルファイルを選択 Samples 画面と同様のリスト キーワードで絞り込み 19 1 2 目的のペアを見つけたら 1 チェックを入れる 2 Add Samplesをクリック 20
左右切り替えボタン サンプル追加のポイント Tumor と Normal に振り分け チェックを入れた順に左 右 21 サンプルの紐づけ 何のがん部 - 非がん部か 3 文字以上 22
ペアに名前を付けたら Add to Analysis 解析の準備へ 23 解析準備完了 Ready to Analyze Confirm & Launch へ 次へ 24
プラグインはスキップ 現在 準備中 Next をクリック 次へ 25 Overview へ 解析スタート Launch Analysis プラグインはスキップ 26
解析 : Overview Analysis 解析状況 準備 ~ 実行 ~ 完了 結果確認 解析段階 解析 ~ 検証 ~ レポート作成 27 100GB まで無償 解析状況 Pending 準備中 28
ステータス更新 解析状況 Running 実行中 29 解析完了 Successful リンク生成 ( 解析名の色が青 ) 自動解析はこの段階まで自動実行 30
結果検証へ 解析名クリック 変異リストへ 周辺クリック 詳細表示 31 解析から検証作業へ サンプル比較 ( 解析 ) がん部と非がん部でジェノタイプの異なる個所をリストアップ 様々なフィルター条件で変異を絞り込み ( 検証 ) アミノ酸配列 新規 既知 Filter Chains ローカスのポジションをクリックし リードの確認 ( 検証 ) IGV(Integrative Genomic Viewer) 32
解析結果 解析結果 がん部に特異的な変異を検出 タブで表示内容を変更可能 33 サマリー ローカス ジェノタイプなど テーブルは右にスクロール 34
機能 アミノ酸配列の変化 タンパク構造への影響 35 European Global 1000 人ゲノム African 集団 dbsnp のアクセション番号 マイナーアリル頻度 36
分類 データベースの遺伝子関連情報 がん 生物学的プロセスなど 37 薬理 薬剤応答性 遺伝子型と表現型の関係 38
体細胞 アレルのカバレッジ アレルの割合 39 QC クオリティチェック 信頼度 40
絞り込み方法 絞り込み設定 アミノ酸配列 既知 未知 フィルター機能を利用 Filter Chains 絞り込まれた変異 精査して除いた変異 条件に合わない変異 フィルターのポイント 目的に応じて作成 アミノ酸配列 分類など クリックして新規作成 41 フィルター条件作成 1 2 4 3 3 作成例 1 アミノ酸配列の変化を伴う変異 ミスセンス ナンセンス 5 42
絞り込み例 1 全てアミノ酸配列が変化する変異 条件編集 変異数 674 から 156 個に絞り込まれた さらに絞り込み 43 フィルター条件編集 1 2 3 作成例 2 癌種の分類 (COSMIC) 腺腫 (Adenocarcinoma) 4 44
絞り込み例 2 右スクロールで詳細情報確認 癌種の分類 156 から 11 個に絞り込まれた 過去に報告済み ( 新規含まず ) 45 腺腫に関連する遺伝子情報 データベース 遺伝子の表現型情報 遺伝子の機能情報 46
COSMIC (Catalogue of somatic mutations in cancer) ハイパーリンク 実際に観察された体細胞変異 ALK:3182G>T http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/mutation/overview?id=1407666 47 OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man ) ハイパーリンク 変異による疾患に関する情報 融合遺伝子が含まれる http://www.omim.org/entry/105590 48
Gene Ontology http://amigo.geneontology.org/amigo/term/go:0042981 ハイパーリンク 生物学的プロセス ALK はアポトーシス制御関連 49 変異の詳細情報 クリック 個別ウィンドウ 全アノテーション情報を閲覧 各種データベースへのリンク 50
IGV を開く 1 3 起動 Locus をクリック Java を事前にインストール 2 51 IGV: Integrative Genomics Viewer 遺伝子名で検索可能 エリアを囲んで拡大 右クリックをして Show all bases 検証 塩基配列の確認 がん部 非がん部を直接比較 52
着目したい変異 2 1 Deleterious( 悪性 ) マーキング 精査した変異をチェック 意義のある変異を見失わない 53 精査 2 1 Benign( 良性 ) 取捨選択 重要な変異はフラグを立てる 不要な候補はリストから削除 54
絞り込み結果 最終候補 ( 例 ) 5 つに絞られた重要な変異 6 つの除外された候補 55 データダウンロード レポート作成 結果確認 Excel を PDF に変換 出力 絞り込まれたリストを Excel 化 全項目も可 56
絞り込み条件確定 1 2 検証作業完了 レポート作成段階へ 以降はフィルタ条件変更不可 57 レポート作成 2 4 1 選択 形式 リストから変異を選択 アノテーションから情報を選択 3 58
レポート公開 Ion 318 Chip 2 枚で 13GByte 解析完了 最終確認 ロック後はフィルタ条件固定 59 レポート PDF 化 2 1 4 3 ダウンロード ロック後に作成可能 サインの記入欄 60
解析結果の共有 2 1 メールアドレス入力 4 3 メール配信 ダウンロードリンク (VCF など ) データの閲覧 (ID 所有者のみ ) 61 ご不明な点がございましたら弊社テクニカルサポートまでお問い合わせください Technical Support Call 0120 477 392 jptech@thermofisher.com 営業時間 : 午前 9 時から午後 6 時まで The Chip is the Machine For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. 62