新規オピオイド製剤の創製と臨床開発 ( 新規 μ/δオピオイド二量体化受容体特異的アゴニストの開発 薬剤耐性を起こさないオピオイド製剤の独自手法による新薬開発 シーズ展開 ) 研究代表者 : 先端医療開発センター支持療法開発分野 分野長 上園保仁 共同研究者 : 研究所がん患者病態生理研究分野 研究

新規オピオイド製剤の創製と臨床開発 ( 新規 μ/δオピオイド二量体化受容体特異的アゴニストの開発 薬剤耐性を起こさないオピオイド製剤の独自手法による新薬開発 シーズ展開 ) 研究代表者 : 先端医療開発センター支持療法開発分野 分野長 上園保仁 共同研究者 : 研究所がん患者病態生理研究分野 研究員 宮野加奈子 北里大学薬学部生命薬化学研究室 教授 藤井秀明 1/14

医療用麻薬とオピオイド受容体 現在 日本で使用できる医療用麻薬はモルヒネ フェンタニル オキシコドン メサドン タペンタドールであり 鎮痛耐性および副作用出現の際に他の医療用麻薬に切り替えるオピオイド スイッチングが推奨されている 医療用麻薬はGPCRであるμ δ κオピオイド受容体 (MOR DOR KOR) のサブタイプのうち 主にMORを介して鎮痛作用を発揮する 現在のオピオイド製剤は長期使用では副作用 耐性が必発であり 耐性や副作用を起こしにくい医療用麻薬が求められている 各種医療用麻薬ごとに副作用の発生が異なる モルヒネ ( がん緩和ケアに関するマニュアル厚生労働省 日本医師会 ) 医療用麻薬 ( モルヒネ等 ) は MOR DOR KOR にも作用し 鎮痛を引き起こすことがわかってきた ひとつのオピオイド製剤がさまざまな細胞内シグナルを引き起こす フェンタニル タペンタドール オキシコドン メサドン オピオイド スイッチング 2/14

単量体 GPCR を刺激しても細胞内シグナルは多彩である - 各リガンドごとに細胞内シグナルが異なる Biased Ligand (a) G-protein-dependent signalling G-protein-independent signalling Desensitization Endocytosis (b) Ligand 1 Ligand 2 Ligand 3 G-protein-dependent signalling Endocytosis G-protein-dependent signalling G-protein-independent signalling Endocytosis TRENDS in Pharmacological Sciences 3/14 Biased Ligand 説に加え 異なる GPCR が二量体となる二量体化 GPCR が創薬ターゲットとして注目される

二量体化 GPCR が新たに引き起こす細胞反応 - 細胞は二量体化 GPCR を通してさらに細かく調節される - 細胞反応 リガンド認識の特異性 受容体が量体化する事により獲得された特性 リガンド結合親和性の変化 二量体化受容体のみに結合する新たなリガンドの存在 受容体活性化シグナルトランスダショントラフィッキング ( 細胞内受容体リサイクリング ) 互いの結合部位にリガンドが結合することによる細胞シグナル活性化の違い 二量体化受容体のみが特異的に活性化される新たなシグナル機構 細胞膜への多様な受容体発現様式 異なる受容体インターナリゼーション / リサイクリング機構 Current Opinion in Pharmacology 21, 1:53-58. Lohse MJ Dimerization in GPCR morbility and Signalingより引用改変 4/14

新規受容体作動活性測定法 CellKey systemの原理 底部に電極を取り付けた専用プレートを使用し その上に細胞を培養して電極間の 電気抵抗 impedance を測定する この impedance は以下の影響を受け 共役するG蛋白質により異なるimpedanceの変化が検出される ①細胞間相互作用 ②細胞接着性 ③細胞形態 ④細胞容積 ラベルフリーアッセイ 簡便 ハイスループット 薬物処置の自動化 96 well plate assay リアルタイムで測定可能 Impedance (ΔZ) 15 1 5-5 5 14 T7-DOR細胞 injection 5 1 Time (s) [ SNC8 ] 1 um 1 nm 1 nm 1 nm 1 pm 1 pm vehicle 15 2 Plate Plate Well Well Electrode Electrode Electrode Electrode CellKey 96-well microplate microplate CellKey 96-well Fig. 5. Principles of the CellKey system 6 vehicleに対する各 濃度における imepdance変化の 割合を定量 Electrode Electrode 濃度曲線 5 % of vehicle 新規GPCR作動活性測定法 CellKey system 4 3 2 1 EC5 44 nm -14-12 -1-8 -6-4 Log [ SNC8 ] (M) -2

CellKey system による受容体活性評価 MOR DOR KOR % of control(max-min) (ohms) 8 7 6 5 4 3 2 1 DAMGO morphine fentanyl oxycodone % of control (Max-Min) (ohms) 6 5 4 3 2 1 SNC8 morphine fentanyl oxycodone % of control (Max-Min) (ohms) 6 5 4 3 2 1 U5488H morphine fentanyl oxycodone -14-12 -1-8 -6-4 -2 Log[Agonist] (M) -14-12 -1-8 -6-4 -2 Log[Agonist] (M) -14-12 -1-8 -6-4 -2 Log[Agonist](M) Bottom Top LogEC5 DAMGO 119.8 425.9-8.482 morphine 126.2 539.4-7.346 fentanyl 139.9 529.2-8.822 oxycodone 124.6 524.3-6.914 Bottom Top LogEC5 SNC8 134.5 499.8-7.354 morphine 95.18 268.2-5.951 fentanyl 9.31 237.5-6.748 oxycodone 6.11 ~ 11775 ~ 4.921 Bottom Top LogEC5 U5488H 115.5 531.8-7.962 morphine 68.47 329.1-6.37 fentanyl 76.2 242.6-5.76 oxycodone 75.26 142.1-5.224 OR 選択的アゴニスト :DAMGO dor 選択的アゴニスト :SNC8 kor 選択的アゴニスト :(-)-U5488H 6/14

μ/δ 二量体化受容体が新たな創薬ターゲットとして注目されている μor δor 単量体とは別のシグナルを介する μ/δ 二量体受容体は オピオイド ( モルヒネ ) による耐性および便秘を引き起こしにくい (Gomes I, et al. Proc Natl Acad Sci, 213) μ/δ 二量体特異的リガンドの開発が求められている 7/14

本研究に着目した経緯 Proc Natl Aced Sci (213) の報告 1. 構築した μ/δ スクリーニング系で Molecular Libraries Probe Production Centers Networks の有する 335,461 種をスクリーニングした結果 μ/δ specific agonist CYM511 が見出された 2. CYM511 は細胞アッセイ系において μor δor( 単量体 ) の両者に親和性を示し かつ μ/δor に 2 2.2 倍程度の高親和性を示した 3. CYM511 はモルヒネと同等の鎮痛特性を有していた (in vivo モデル動物 ) 4. モルヒネ連投により作製したモルヒネ耐性マウスに CYM511 を投与すると モルヒネの効かない耐性マウスでも鎮痛効果を示した 5. μ/δ-biased ligand CYM511 はモルヒネ等と異なり 副作用を起こしにくい 新しいタイプの鎮痛薬である by Gomes I, et al. Identification of a μ-δ opioid receptor heteromer-biased agonist with antinociceptive activity. Proc Natl Acad Sci USA, 11: 1272-7, 213. 8/14

μ/δ ヘテロダイマー安定発現細胞株の作製 作製方法 Halo T7 MOR DOR 下記ベクターをHEK293 細胞にco-transfectionし G418で薬剤セレクションを行い作製した HaloTag 融合 MOR 発現ベクター + T7-tag 融合 DOR 発現ベクター 発現確認方法 1) HaloTag Ligand Tag 抗体を用いた蛍光画像による細胞膜上の発現確認 2) CellKey system を用いた各受容体の機能性確認 9/14

染色結果 HEK293 T7抗体 HaloTag AF488 Ligand marge 1 14 T7-DOR発現 HEK293 T7-DOR HaloTag-MOR 発現HEK293 #28 T7-DOR HaloTag-MOR 発現HEK293 #32

CellKey system を用いた各受容体の機能性確認 < 用いた細胞 > HEK293 細胞 negative control HaloTag 融合 MOR 安定発現 HEK293 細胞 MOR 単独発現細胞 T7-tag 融合 DOR 安定発現 HEK293 細胞 DOR 単独発現細胞 HaloTag 融合 MOR+T7-tag 融合 DOR 安定発現 HEK293 細胞 #32 MOR, DOR 共発現細胞 % of control(max-min)(ohms) 8 6 4 2 vehicle DAMGO 1nM SNC8 1nM SNC8 1nM 1Halo-MOR/T7-DOR (#32) HEK293 Halo-MOR T7--DOR #32 MOR と DOR が共発現している安定発現細胞を作製 11/14

% of control(max-min)(ohms) 12 1 8 6 4 2 CellKey system を用いた CYM511 の MOR 及び DOR に対する活性 FLAG-MOR FLAG-MOR -12-1 -8-6 -4 Log[Agonist](M) DAMGO DAMGO SNC8 SNC8 ML335 CYM511 LogEC LogEC5-7.88 5-7.88-7.33-6.46-6.46 DAMGO SNC8 CYM511 ML335 % of control(max-min)(ohms) 7 6 5 4 3 2 1 実験日 :214-1-17-1(MOR) 3(DOR) Halo-DOR -12-1 -8-6 -4 Log[Agonist](M) DAMGO DAMGO SNC8 SNC8 ML335 CYM511 LogEC LogEC5-5.929 5-5.929-8.135-6.15-6.15 DAMGO SNC8 CYM511 ML335 (nm) に換算すると MOR DAMGO SNC8 CYM511 ML335 EC5(nM) 5 13.2 92.6 392.5 (nm) に換算すると DOR DAMGO DAMGO SNC8 SNC8 CYM511 ML335 ECEC5(nM) 1178 1178 7.3 7.3 77.8 77.8 SNC8... DORに選択的な作動薬 DAMGO... SNC8 程の受容体選択性はないが MORに選択的な作動薬 CYM511...MOR DOR 両者間でのEC 5 は同等 E max は各受容体選択的作動薬と同等 12/14 MOR DOR に反応する

Halo-MOR/T7-DOR 発現細胞を用いた CellKey TM assay T7-DOR+HaloTag-MOR 発現 HEK293 #32 Halo-MOR/T7-DOR #32 8 6 4 2 DAMGO SNC8 ML335 CYM511 CYM511 は μ/δ μ δ 受容体 アゴニストである -14-12 -1-8 -6-4 Log[Agonist](M) DAMGO DAMGOSNC8 SNC8 CYM511 ML335 Bottom Bottom 92.98 92.98 86.45 86.45 49.23 Top Top 516.6 516.6 63.4 63.4 58.2 58.2 LogEC5-7.61-7.642-5.885 LogEC 5-7.61-7.642-5.885 CYM511 は μ/δ に高い親和性を 有するわけではない 13/14

私たちが同定した SYK775 の開発において魅力となる点 および Advantage となるポイント SYK775 は 14/14 1. μ/δ 二量体 specific であり μ δ 単量体および κ 単量体には no-effect である 2. Sci. Finder で構造検索するもヒット 全く新しい化合物 3. Sci. Finder で Patent 検索するもヒット 物質特許取得の可能性あり 4. 創薬ネットワーク (AMED) への提案として魅力的な案件 5. 疼痛関連製薬企業と別案件で 同アッセイ系を用いた新型オピオイド鎮痛剤の共同開発を平成 29 年度より行っている したがって創薬ネットワークを介さずとも同社への直接導出も可能か? μ-δor δor μor κor 化合物 μ-δor 活性順位 % of ML335 % of SNC8 % of DAMGO % of U-5488 SYK775 51.35 -.5-8.75-4.73282467