肝クッパ 細胞を簡便 大量に 回収できる新規培養方法 農研機構動物衛生研究所病態研究領域上席研究員山中典子 2016 National Agriculture and Food Research Organization. 農研機構 は国立研究開発法人農業 食品産業技術総合研究機構のコミュニケーションネームです
本技術開発の背景 (1) 肝臓マクロファージ ( クッパー細胞 ) 肝非実質細胞内皮細胞 クッパー細胞 星細胞 類洞 ( 毛細血管 ) 肝実質細胞 2
本技術開発の背景 (2) クッパ 細胞の機能 貪食 細菌等の異物を貪食 処理 貪食した異物の情報を抗原提示 陳旧化した赤血球など 自己細胞の貪食を行うこともある 自己免疫疾患との関連も サイトカイン等の生理活性物質の分泌 (TNFα TGF-β IL-1α IL-1β IL-6 IL-10 IL-12 など 増殖因子も ) 炎症作用の調節 ( 亢進 抑制 ) 肝繊維化 毒性メディエーター機能 ( 薬物の作用でサイトカインを分泌 肝実質細胞等に毒性作用をあらわす ) 3
従来技術とその問題点 コラゲナーゼ灌流細胞分散 低速遠心 肝非実質細胞 細胞の流れ クッパー細胞 肝臓 肝実質細胞 遠心力エルトリエーション遠心 従来法の問題点 (1) 特殊な遠心分離装置 ( エルトリエーター ) が必要 (2) 熟練した技術と複雑な工程が必要 (3) 一回の分離操作で得られる細胞数が少ない (4) 分離の度に多くの動物を犠牲にせねばならない 4
新技術の特徴 従来技術との比較 肝細胞の混合培養系混合培養系を利用利用してクッパー細胞を単離するする手法 (1) 特殊な装置を使わない (2) 簡易な技術と単純な工程 (3) 分離操作を繰り返すことができる 5
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細胞の回収性 平均細胞数 / T-75 フラスコ (x 10 5 ) 40 30 20 10 0 培養試験 No. 1 No. 2 No. 3 0 10 20 30 40 培養日数 T-75 フラスコから繰り返して得られるクッパー細胞数 Kitani et. al. (2010) J. Immun. Methods.360:47-55 7
免役染色による細胞の性質の判定 ED-1 ED-3 OX-41 Iba-1 ED-1(Day 4) Scale bar: 100 µm クッパー細胞はラットマクロファージ特異的抗体により強く免疫染色された 細胞同士が融合し 多核体を形成した Kitani et. al. (2010) J. Immun. Methods.360:47-55 8
貪食能 Blue: DAPI Green: FITC beads No bead 1 hr 2 hr 4hr 61.6% 83.6% 93.8% クッパー細胞は FITC 標識ラテックスビーズを活発に貪食した Kitani et. al. (2010) J. Immun. Methods.360:47-55 9
サイトカインに対する増殖応答能 Absorbance at 440nm 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1.0 0.8 Rat GM-CSF 0 3.1 6.3 12.5 25.0 Mouse GM-CSF 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1.0 0.8 Bovine GM-CSF 0 3.1 6.3 12.5 25.0 Human GM-CSF 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0 0 3.1 6.3 12.5 25.0 0 0 3.1 6.3 12.5 25.0 ng/ml ng/ml (WST-1 試薬による細胞増殖アッセイ ) Kitani et. al. (2010) J. Immun. Methods.360:47-55 10
ウシの場合 ウシ肝実質細胞の初代培養 位相差観察 Day 2 < Day 2 > CK18 CK19 CD68 CD172a Day 4 < Day 15 > Day 8 Day 16 Scale bar: 100 µm ウシ肝細胞の初代培養系においても クッパー細胞が活発に増殖した CK18 CK19 CD68 CD172a 振とう 付 とう 付着法による クッパー細胞 クッパー細胞の 細胞の選択的分離 11
ディッシュへの接着による回収と回収性 ペトリディッシュへの付着非接着細胞を洗浄 除去 10 min Cell yield per flask ( ( 10 5 ) 30 20 10 T75 フラスコあたりの収量 0 0 10 20 30 40 50 Culture days Experiment No. 1 No. 2 No. 3 2 days 同じフラスコから繰り返して回収可能 (2 3 週間 ) Scale bar: 100 µm 12
ウシ肝由来クッパー細胞の免疫染色と貪食能 None CD68 None 1 h 85.3% CD172a 1 h 2 h 93.5% Iba-1 2 h Iba-1(D8) 4 h 4 h Blue = DAPI 94.0% Green = FITC Red = CD172a Scale bar: 100 µm Scale bar: 50 µm Kitani et. al. (2011) Vet. Immun. Immunopath.140:341-345 13
増殖応答能とサイトカイン産生能 Absorbance at 440 nm ウシ rgm-csf に対する増殖応答能 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 3 6 12 25 Concentration of bovine rgm GM-CSF (ng/ml)( (WST-1 試薬による ) LPS 刺激に対するサイトカイン産生応答能 Relative ratio to GAPDH 70 60 50 40 30 20 10 0 IL-1α IL-1β TNFα IL-6 No stimulation LPS (1 µg/ml) IL-10 IL-12p40 (Q-PCR による ) Kitani et. al. (2011) Vet. Immun.. Immunopath.140:341 140:341-345 345 14
ラットにおける本手法の詳細はビデオジャーナルにて公開中 Journal of Visualized Experiments (JoVE JoVE) (51:2011/5/24) 15
想定される研究分野 得られるクッパー細胞はマクロファージとしての 機能を維持している 貪食作用およびサイトカイン等の生理活性物質の分泌が関連する病態解明やそれによる診断法 治療法の開発 家畜の生産病の病態 ヒトの肝炎や肝繊維化 肝硬変などの病態 創傷治癒 ( 肉芽組織の修復 ) 炎症 ( 亢進 抑制 ) 毒性研究 ( 肝実質細胞との相互作用 ) 16
想定される商業用途 現時点で 細胞プレート サイトカイン試薬 さらに研究を進めれば 診断キットの開発 治療薬の生産 毒性試験キットの開発 17
企業への期待 培養の規模の拡大 培養作業の自動化 ( ロボット化 ) によりサイトカイン生産等に応用可 病態 毒性解明の基礎研究のレベルでの共同研究ができれば 診断 治療等のさらに大きなマーケットも期待できる 18
本技術に関する知的財産権 発明の名称 登録番号 特許権者 発明者 : クッパ 細胞の効率的増殖方法およびその利用 : 特許 5720980 号 : 農研機構 農業生物資源研究所 : 山中典子 吉岡都 木谷裕 竹之内敬人 19
お問い合わせ先 ( 必須 ) 農研機構動物衛生研究所 病態研究領域上席研究員 山中典子 TEL FAX E-mail 0298-383-7823 0298-383-7825 yamamaya@affrc.go.jp 20