五十嵐研雑誌会 No. 1081 2010.12.17 D2 千葉洋子 TCA cycle は回転回転しているか? Tricarboxylic acid (TCA) 回路は 1940 年 Hans Adolf Krebs により発表された (Krebs HA, 19401; Krebs HA, 19402) ハトの胸筋を用いた生化学試験により発見された本回路は 3 つのドメインにわたり存在し 解糖 糖新生 アミノ酸合成などの生合成経路やエネルギー獲得経路を結び付ける炭素代謝の中心的な ハブ である TCA 回路は 教科書的な 酸化方向とは逆方向 すなわち還元方向にも進むことが緑色硫黄細菌で提唱され おなじみの Hydrogenobacter は還元的 TCA 回路を用いて独立栄養的に増殖する 加えて 一部の生物の TCA 回路は不完全であったり 両方向に流れていたりすることが明らかになってきた 本雑誌会では 13 C 化合物を用いたトレーサー実験等から明らかになってきた いくつかの微生物の TCA 経路 について 最新の論文を紹介したいと思う Branched tricarboxylic acid metabolism in Plasmodium falciparum. Olszewski, K.L., Mather, M.W., Morrisey, J.M., Garcia, B.A., Vaidya, A.B., Rabinowitz, J.D., Llinas, M. 2010 Nature. 466:774-778 研究背景と目的 Plasmodium falciparum について P. falciparum はヒトのマラリアの原因である原虫で ある 本原虫のミトコンドリアのゲノムサイズはこれ までに知られているものの中で最小であり 機能を減 らす方向に進化してきたと考えられている 本原虫の生活環の中に ヒトの赤血球内で増殖する 赤血球期がある ( 右図 4) 赤血球期のマラリア原虫は ほぼすべてのエネルギーを解糖系を用いた発酵により 得ており TCA 回路 電子伝達系は主要な ATP 供給源 ではないと考えられている また アミノ酸の de novo 生合成等を行わないので TCA 回路中間産物を生合成 に必要とすることもない しかし 本原虫は TCA 回 路に必要な酵素遺伝子をすべて揃えており 赤血球期 出典京都薬科大学創薬科学系薬品化学分野 HP (http:// www.kyoto-phu.ac.jp/labo/yakuhin/malariaresearch.htm) に転写している Citrate synthase orthologue, aconitase, isocitrate dehydrogenase(pfidh) はミトコン ドリアに局在することが明らかになっており succinate dehydrogenase および 2-oxoglutarate (2-OG) dehydrogenase もミトコンドリアに存在することが示唆されている しかし 解糖系と TCA 回路をつな ぐ pyruvate dehydrogenase (PDH) 複合体はミトコンドリアではなく apicoplast という非光合成色素体 様小器官に局在する したがって 本 PDH はグルコース由来の pyruvate から acetyl-coa を生成して 1
TCA 回路に供給するという教科書的な役割ではなく acetyl-coa を脂肪酸の伸長に供給する役割のみを有しているのではないかと考えられてきた そこで本研究は P. falciparum の TCA 回路の流れおよび acetyl-coa の行方について知見を得るため 以下の実験を行った 実験方法多くの生物において TCA 回路への主な炭素供給源はグルコースに加えて Asp, Asn(oxaloacetate; OAA として流入 ) Glu, Gln(2-OG として流入 ) である そのため すべての C および N を安定同位体でラベルした U- 13 C-glucose, U- 13 C- 15 N-Asp または U- 13 C- 15 注 1) N-Gln を添加した培地を用いて宿主に感染させた赤血球期の P. falciparum を培養し 細胞内の代謝産物のラベルパターンを分析した 有機酸の分析には liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) 脂肪酸の分析には gas chromatography-ms (GC-MS) を用いた 注 1) 細胞培養に一般に使われる RPMI Medium 1640 20 種類のアミノ酸 (20mg/ L =0.15 mm Asp, 300 mg/ L =2.05 mm Glu) およびグルコース (2000 mg/ L =11.11 mm) ビタミン 無機塩が含まれる 結果 1 TCA 代謝産物の流れ U- 13 C-glucose を添加して培養した場合 解糖系の中間産物は全て直ちにラベルされたが 有機酸は限られたもののみがラベルされた (Fig. 1-1a) このうち +3 13 C-malate および +3 13 C-fumarate (+3 は 3 つの炭素がラベルされたことを示す ) は +3 phosphoenolpyruvate (PEP) に CO2 が付加して生じたと考えられる (Fig.1-2a) また 2-OG および succinate がラベルされなかったことから ラベルされた malate と fumarate はミトコンドリアの TCA 回路ではなく 細胞質で生成したことが示唆される さらに アセチル基がラベルされた acetyl-coa も生じたが そのラベル化割合は非常に低かったことから pyruvate 以外にアセチル基への two-carbon unit の供給源があることが示唆された (Fig. 1-3a) なお ごくわずかながら検出された +2 および +5 13 C-citrate は アセチル基がラベルされた 13C-acetyl-CoA と非ラベルまたは +3 13 C-OAA から作られたと考えられる U- 13 C- 15 N-Asp を添加して培養した場合も 同様に +4 13 C malate および fumarate が検出された (Fig. 1-2b) これらの結果から グルコースや Asp 由来の代謝産物はミトコンドリアの TCA 回路に流れていない可能性が示された U- 13 C- 15 N-Gln を添加して培養した場合 TCA 回路の中間産物全てでラベル化が認められた (Fig. 1-1a) 一般的な酸化方向の TCA 回路から予想されるように (Fig. 1-1b) +5 13 C 2-OG および +4 13 C succinate, fumarate, malate が検出された 一方で citrate は +5 13 C 型のもののみが検出された これは 酸化方向の TCA 回路ではなく 還元的 TCA 回路により +5 13 C 2-OG に CO2 が付加して生じたと考えると説明がつく (Fig. 1-1c) 加えて +3 13 C fumarate と malate および +2 13 C-acetyl-CoA が検出されたことも 還元的 TCA 回路の存在で説明できる 2 acetyl-coa の行方本生物における還元的 TCA 回路の役割を調べるため 著者らは acetyl-coa のアセチル基の一般的かつ主な行き先である脂肪酸生合成系 タンパク質修飾系および低分子アセチル化について調べた U- 13 C-glucose または U- 13 C- 15 N-Gln を添加して培養した本原虫のから ラベル化された脂質は検出されなかった これは 赤血球期に脂肪酸の de novo 生合成は必要ないという知見と一致する 一方で 真核生物においてアセチル化される主なタンパク質であるヒストンの尾部は U- 13 C- 15 N-Gln 添加培養時のみ 56% もラベル化された (Fig. 1-3b) さらに マラリア発病に関連し 小胞体でアセチル化され 2
る nucleotide amino sugar である UDP-N-acetyl-glucosamine (UDP-GlcNAc) は U- 13 C-glucose 添加培養時のみラベル化された (Fig. 1-3c) したがって マラリア原虫が 2 つの独立した acetyl-coa 代謝経路を有していることは明白である と著者らは主張している 考察以上の 13 C トレーサー実験により ミトコンドリアの炭素代謝は分岐した構造を取っており それらの流れはどちらも malate に行きつくことが示唆された また malate が老廃物として赤血球外に排出されることも確認された (Fig. 1-4) そこで著者らは赤血球期のマラリア原虫の中心的炭素代謝経路について Fig. 1-5 に示すように新しいモデルを提唱した 提唱された代謝経路において ミトコンドリアにおけるカルボン酸への炭素供給源は Gln および Glu であり その炭素フラックスは 2 本の枝からなる 1 本目の枝は還元的 TCA 回路の一部であり 2 本目の枝は酸化的 TCA 回路の一部である Malate および fumarate はどちらの流れからも生じると考えられる この分岐した TCA 代謝はこれまでに提唱されているものと根本的に異なると著者らは主張している なぜなら これまでにも真核生物において TCA 回路の一部が還元的に反応することは知られていたが それらの系では同時に完全な酸化的 TCA 回路が機能しているのに対し 本 TCA 代謝は完全に分岐しているからである この分岐した TCA 経路は 宿主細胞の環境に特化するために代謝経路の柔軟性を失ったという進化的なトレードオフの結果であると考えられる ヒトの血流にはグルコースが恒常的かつ豊富に存在するので マラリア原虫は glucose をエネルギー源として利用する 一方で 血漿中に高濃度 ( 約 0.5 mm) 存在する Gln は C5 化合物 (Succinyl-CoA や C2 acetyl unit など ) の骨格としてすぐに使用可能である 著者らは 本代謝系は 中心的代謝経路が特別な環境のニッチに適応するため 著しい進化を遂げた明白な例だと締めくくっている 補足 : Isocitrate dehydrogenase (IDH) の触媒方向ヒトのミトコンドリアには 2 種類の isocitrate dehydrogenase (IDH) が存在する ひとつは NAD 依存型で酸化方向に働き もう一つの NADP 依存型が還元方向に働く マラリア原虫のゲノム上には NADP 依存型の IDH しかコードされておらず また本菌体内には NADPH が豊富に存在することから IDH は還元方向のみに働いていると考えられる ATP-dependent citrate lyase (ACL) の存在について一般的に acetyl-coa OAA と citrate 間の反応は 酸化 (=citrate 生成 ) 方向は citrate synthase (CS) が 還元 (=acetyl-coa OAA 生成 ) 方向は ATP citrate lyase (ACL) が触媒することが知られている 本菌のゲノム上には ACL 遺伝子が存在しないが CS らしき遺伝子は存在する また 赤血球中には宿主由来の ACL が十分に存在する したがって 本原虫の citrate を acetyl-coa に開裂する反応は 宿主の ACL または CS らしき遺伝子にコードされているタンパク質によって触媒されている可能性が考えられる しかし マラリア原虫から ACL や CS 活性は検出できず citrate の解裂が起こる場所やその触媒酵素は現在のところ不明である 3
Carbon flow of heliobacteria is related more to clostridia than to the green sulfur bacteria. Tang, K.H., Feng, X., Zhuang, W.Q., Alvarez-Cohen, L., Blankenship, R.E., Tang, Y.J. 2010 J. Biol. Chem.285:35104-35112 背景 目的本研究で用いられている Heliobacterium modesticaldum は 培養可能なグラム陽性菌の中で唯一光合成を行う絶対嫌気性菌である 暗条件でも増殖可能だが 有機酸や糖を用いた光合成従属栄養条件でよく増殖する (Kimble LK et al, 1995; Tang KH et al, 2010) これまでに本菌は ATP citrate lyase (ACL) および citrate synthase (CS) を欠損させた不完全な還元的 TCA 回路を有することが 全ゲノム解析および生化学的試験の結果から示唆されてきた (Fig. 2-1) しかし もしそうであれば CO2 が不可欠であるはずであるが 本菌の増殖は CO2 を添加しても促進されない 一方 13 C トレーサー実験の結果から 本菌では酸化的 TCA 回路も機能していることも示唆されているが そうであるならば pyruvate 等を初発物質とする酸化的 TCA 回路が ACL や CS なしにそれが機能する理由が分からない そこで 本研究は本菌の TCA 回路の流れを明らかにすることを目的とした 結果 1 Fluoroacetate (FAc) を用いた増殖実験 FAc は毒物であり 一般的な酸化的 TCA 回路で代謝されると (-)-erythro-(2r,3r)-2-f-citrate (2-FC) となって aconitase を阻害し 本回路を停止させる (Fig. 2-2) しかし 本菌を 20 mm FAc 添加培地 ( ベースとして 20 mm pyruvate が入っている ) で培養したところ 増殖速度および炭素代謝遺伝子の転写レベルは FAc 非添加のコントロールとほとんど差がなかった (Fig. 2-3) したがって 本菌では (-)-erythro-(2r,3r)- 2-FC が生じないことが示唆された 2 安定同位体によるトレーサー実験本菌を [1-13 C]pyruvate を用いて培養し タンパク質中のアミノ酸のラベル化パターンを GC-MS を用いて測定した その結果 Asp は主に 2 つの炭素がラベルされ Glu は主に 1 つの炭素がラベルされた (Table 2-1) もし Fig. 2-1 に示す不完全な還元的 TCA 回路のみが機能しているのならば Asp よりも Glu のラベル化割合が高くなるはずである したがって 酸化的 TCA 回路が機能しているのではないかと考えられた これは [3-13 C]pyruvate を用いて培養したときの Asp と Glu のラベル化パターンとも矛盾しない 3 Citrate synthase 活性の検出 [1-13 C]pyruvate 培養時に 50% 以上の Asp と 60% 以上の Glu の側鎖のカルボキシル基がラベル化されたことから 著者らは本菌において一般的な (Si)-CS ではなくて (Re)-CS が働いているのではないかと考えた (Fig. 2-4) 2 つの CS はどちらも OAA と acetyl-coa から citrate を生成するが acetyl-coa のアセチル基を OAA のどこに付加するかが異なる また (Re)-CS は酸素感受性および金属 (Mn 2+, Mg 2+ or Co 2+ ) 依存性を示すが 既知の (Si)-CS ではこれらの性質が知られていない これまで著者らは大気 金属非添加条件で CS 活性を測定し 活性がないとしていた そこで嫌気 Mn 2+ 添加条件で活性測定を行ったところ CS 活性が認められた 4 Anaplrotic-CO2 固定経路詳細は割愛するが アミノ酸のラベル化パターンから本菌の pyruvate:ferredoxin oxidoreductase 4
(PFOR)は非常に可逆的かつ活発 活発に働いていることが分かった また Asp は主 主に酸化的 TCA 回路で はなく PEP への炭酸付加により により生ずることが示唆された 考察 以上の結果から H. modesticaldum では不完全な還元的 TCA 回路に加えて部分的 部分的に酸化的 TCA 回 路も機能しているこが示唆された された(Fig. 2-5) 加えて 本酸化的 TCA 回路は本菌 本菌の主な炭素フラックス であり 2-OG の生成に寄与していることが していることが示唆された この酸化的 TCA 回路で で CO2 が生じるために 本菌の増殖は CO2 の添加により促進 促進されないと考えられる 加えて ① ③の結果から本菌 本菌の増殖が FAc によって阻害されないのは 本菌 本菌の CS が(Si)-CS では な い か ら で あ る こ と が 示 唆 さ れ た Aconitse を 阻 害 す る の は 2-FC の 4 つ の 異 性 体 の う ち (-)-erythro-2-fc のみであり (+)--erythro-2-fc 生成型の(Re)-CS のみを有する する Desulfovibrio vulgaris Hildenborough の増殖は FAc の添加 添加により阻害されない(Fig. 2-3c) したがって H. modesticaldum も (Re)-CS を有すると考えられる 5
Both forward and reverse TCA cycles operate in green sulfur bacteria. Tang, K.H., Blankenship, R.E. 2010 J. Biol. Chem. 285:35848-35854 背景 背景 目的 hlorobaculum tepidum は酸素非発生型の光合成 光合成を行う絶対嫌気性細菌 本研究で扱う緑色硫黄細菌 Chlorobaculum である Fig. 3-1A に示すように本菌 本菌は RTCA 回路を用いて CO2 を固定する 光合成による増殖時 光合成 acetate や pyruvate 等の有機酸を培地に添加 添加することで本菌の増殖は促進されるが これら有機酸のみでは増殖 これら できない すなわち CO2 も必要な な混合栄養である 本研究では なぜ有機酸が が本菌の増殖を促進する のか また なぜこれら有機酸の同化時 同化時に CO2 が必要なのかを明らかにすることを ことを目的とした 結果 の比較 ① 独立栄養増殖と混合栄養増殖の 嫌気 Low intensity light 照射 0.34% ~40mM HCO3- 添加条件での独立栄養培養時 独立栄養培養時をコントロー ルとし これに 10 mm の acetate または pyruvate を添加した混合栄養増殖時との違 違いを確認した そ の結果 それぞれ最終菌体量がそれぞれ がそれぞれ 50 20% 増加した(Fig. 3-2A) また 独立栄養培養 独立栄養培養と比べて 混合栄養培養では炭素代謝に関 関わるほとんどの遺 伝子の転写レベルが 2 4 倍上昇 倍上昇した ② 有機酸が同化されていることの されていることの確認 13C ラベルした acetate または pyruvate を添加し て培養した菌体からバクテリオクロロフィル からバクテリオクロロフィル c [BChl c; 8 分子の 2-OG (=α-kg) KG)といくつかの acetyl-coa か ら 作 ら れ る ] を 抽 出 し て MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/ Ionization)-TOF TOF (Time of Flight) Flight)を用いて測定し た [13C] puruvate 添加時より[[13C] acetaete 添加 時の方が BChl c 中には多くの くの 13C が取り込まれ ていた(Table 3-1) ③ FAc 添加時の増殖生理 無機培地に 1 mm の FAc を加 加えた場合および 20 ｍm pyruvate と 2 mm の FAc を を加えたところ 本 菌は増殖しなかった (Fig. 3-2C)) 一方で acetate 存在下では 2 mm FAc を加えても えても十分な増殖を示し FIGURE 33-2. Effect of FAc on the growth of C. tepidum. 0.34% (40 mm) HCO3 is included in all of the growth media. The growth curve (A) The cell growth (recorded as A625) during growth conditions with various concentration concen of acetate, pyruvate, and FAc is shown (C). F, fluoro. た(Fig. 3-2c) ④ TCA 回路の方向決定に寄与すると すると考えられる ACL CS について acetyl-coa OAA と citrate 間 間の反応は 一般的に還元的 TCA 回路では ACL が 酸化的 TCA 回路 では CS が担っている C. tepidum のゲノム上には ACL 遺伝子(aclAB) に加えて えて CS 遺伝子(gltA)が 6
レベルは aclab よりも 6 10 倍低かった また 本菌 本菌の CS はタンパクレベ 存在するが glta の転写レベルは ルでの存在が確認されており ACL が活性化する条件で非活性化されることが示唆 示唆されている 実際 独立栄養培養および混合栄養培養 混合栄養培養した菌体すべてから ACL 活性はされたが CS CS 活性は検出されなか った 考察 ③の結果から 本菌の独立栄養 混合栄養増殖時の主な炭素フラックスはどちらも フラックスはどちらも還元的 TCA 回路で あることが示唆された しかし 以下 以下に示す理由により 部分的に酸化的 TCA 回路が機能している可能 回路 性もある と著者らは考察している している Fig. 3-3B に示すように もし[2-13C] acetate や[3-13C] pyruvate が還元的 TCA 回路のみで取り込まれるのであれば まれるのであれば 両者で Glu と acetyl-coa が同じようにラベル化さ が れるので BChl c のラベル化割合も も同じになるはずである しかし 実際のラベル化割合 化割合は[2-13C] acetate で 16 [3-13C] pyruvate で 10%と と異なった(TABLE 3-1) これは pyruvate はほぼ還元的 はほぼ TCA 回路 のみで同化されるのに対し acetate acetate は酸化的 TCA 回路でも同化されるため Glu Glu のラベル化割合が高 くなるからではないかと著者らは述 述べている(Fig. 3-4) この仮説は FAc による増殖阻害実験 増殖阻害実験の結果とも矛盾しないと著者らは主張している している すなわち 培 地に添加された pyruvate はほとんどすべて PEP 方向に流れるため FAc から生じた じた F-acetyl-CoA は競 合相手がいないので ACL(または または CS)の働きすぐに F-citrate となって aconitase を阻害する 一方で acetate を添加した場合には FAc よりも acetate の方が acetyl-coa synthase に触媒 触媒されやすいため注２ F-acetyl-CoA が生じにくく aconitase aconitase の阻害が起こりにくいのではないか と著者 著者らは述べている 注 2 著者らは FAc が acetyl-coa CoA synthase に対する acetate の競合阻害剤であり その触媒効率 触媒効率は[(kcat/ Km)acetate + (kcat/ Km) FAc]/ (kcat/ Km) FAc > 400 であることを示している これにより FAc は acetate 存在時に少しだけ F-acetyl-CoA に変換されることが示唆 示唆された ただし 本菌の酸化的 TCA 回路 回路は不完全で 2-OG で止まると考えられる なぜなら なぜなら 本菌は酸化的 TCA 回路に必要な pyruvate dehydrogenase および 2-OG dehydrogenase 遺伝子を有さないし CS 遺伝子 や succinata dehydrogenase 遺伝子は は光合成増殖時に down-regulate されているからである されているからである また 本菌が従属栄養生物と異なり なり 増殖するのに有機酸に加えて CO2 を必要 必要とするのは 本菌の炭 素代謝系を機能させるためには PFOR および PEPCK による CO2 付加反応が不可欠 不可欠だからだと考えら れる 7
感想これまで TCA 回路に対して ほとんどの生物では 教科書的な 酸化方向に回っていて 一部の生物では還元的方向に回転している という認識でいた しかし 今回の雑誌会に向けて勉強したところ 一部両方向に機能していたり 回転せずに分岐した流れになっていたりと 例外が多い ( むしろ 今までに記されていた 教科書的な TCA 回路を典型と考えること自体に問題がある可能性もある?) ことが分かった 1 報目の論文の著者らも考察で述べていが 既知の代謝マップにゲノム情報を乗せる形である生物の代謝を予測すると 誤った代謝系が予測される恐れがある ( 例えば 1 報目の例だと 還元方向に流れている 2-OG から malate までの反応は ACL/CS 以外可逆的なので ACL/CS が特定されていない本菌では 流れの方向を特定できない ) 代謝系の解明には ゲノム情報だけではなくトレーサー実験や生化学的解析による直接的な証拠が必要であることを再確認した 参考文献 Krebs, H.A 1. 1940 The citric acid cycle: A reply to the criticisms of F. L. Breusch and of J. Thomas. Biochem. J. 34:460-463 Krebs, H.A 2. 1940 The citric acid cycle and the Szent-Gyorgyi cycle in pigeon breast muscle. Biochem. J. 34:775-779 Kimble, L.K., Mandelco, L., Woese, C.R., Madigan, M. T. 1995 Heliobacterium modesticaldum, sp. nov., a thermophilic heliobacterium of hot springs and volcanic soils. Arch. Microbiol. 163:259-267 Tang, K.H., Yue, H., Blankenship, R.E. 2010 Energy metabolism of Heliobacterium modesticaldum during phototrophic and chemotrophic growth. BMC. Microbiol. 10:150 8
ラベル化された炭素数 Figure 1-1: Glutamine drives reverse flux through the TCA cycle. a, Concentrations of different isotope-labelled carboxylic acids in extracts of P. falciparum-infected red blood cells. We cultured synchronized parasites in medium supplemented with either U- 13 C-glucose or U- 13 C- 15 N-glutamine 2 h before invasion, then extracted them every 8 hours after invasion for high-performance LC MS (HPLC MS) analysis. The plots to the right of the grey triangles zoom in on the profiles of the labelled metabolites. The +3 and +4 malate arises from the reductive and oxidative pathways, respectively, whereas +3 fumarate probably derives from interconversion of fumarate and malate by fumarate hydratase (PFI1340w). Error bars show the s.d. of n = 3 biological replicates. b, Schematic of the oxidative pathway from 2-oxoglutarate to malate. Red dots denote 13 C atoms arising from U- 13 C- 15 N-glutamine. GDP, guanosine diphosphate; GTP, guanosine triphosphate; P i, inorganic phosphate. c, Schematic of the reductive carboxylation pathway from 2- oxoglutarate to malate. Ac-R represents either acetyl-coa or acetate. 還元的 酸化的 (UDP-GlcNAc etc ) Figure 1-5: An integrated model for central carbon metabolism in P. falciparum. Arrows show the direction of net flux; multiple arrows depict pathways not shown in their entirety and are labelled as such. Metabolites in red are those found to flow out into the medium as waste products. Red arrows indicate the reductive pathway of TCA metabolism; blue arrows show the oxidative pathway. Asterisk (*), the specific enzyme responsible for the citrate cleavage step and its localization are unclear (see Supplementary Discussion). Double asterisk (**), there are two predicted enzymes capable of catalysing this reaction, the cytosolic malate dehydrogenase (PFF0895w) and the putative mitochondrial malate:quinone oxidoreductase (MAL6P1.258). Abbreviations: Gln, glutamine; Glu, glutamate; OG, 2-oxoglutarate; ICT, isocitrate; Cit, citrate; Ac-R, acetate/acetyl-coa; Ac-CoA, acetyl-coa; OA, oxaloacetate; Mal, malate; Suc, succinyl; Suc-CoA, succinyl-coa; Fum, fumarate; Glc, glucose; Asp, aspartate; PEP, phosphoenolpyruvate; Pyr, pyruvate; Lac, lactate.
Figure 1-2: Cytosolic pathways generating malate and fumarate. a, Schematic of the pathway in which U-13C-glucose is metabolized to +3 13C-malate and +3 13Cfumarate in the parasite cytosol. PEP carboxylase (PEPC, PF14_0246) converts glycolytic PEP into oxaloacetate, which is then reduced to malate by the parasite s cytosolic malate dehydrogenase (MDH, PFF0895w) or transaminated to aspartate by the aspartate aminotransferase (AAT, PFB0200c). The aspartate carbon skeleton can then be converted to fumarate in the cytosol by the concerted reactions of adenylosuccinate synthase (ADSS, PF13_0287) and adenylosuccinate lyase (ADSL, PFB0295w) in the parasite s essential purine salvage pathway. Red dots denote carbon-13 atoms. Arrows show the direction of net flux; multiple arrows depict pathways that not shown in their entirety. b, Schematic of the pathway in which U-13C-15Naspartate is metabolized to +4 13C-malate and +4 13C-fumarate. 黒 : ラベルされていないもの濃灰 :CoAのリボース部位のみがラベルされているもの赤 : アセチル基がラベルされているもの白 : 糖部分はラベルされているがアセチル基はラベルされていないもの薄灰 :NはラベルされているがCはラベルされていないもの Figure 1-3:Acetyl groups deriving from glucose and glutamine are functionally distinct. a, Labelling of acetyl-coa in extracts of P. falciparum-infected red blood cells at t = 40 hours after invasion as determined by HPLC MS. b, Labelling of a singly acetylated peptide derived from the N-terminal tail of histone H4, determined by proteomic mass spectrometry. c, Labelling of UDP-GlcNAc at t = 40 hours after invasion. Black bars, unlabelled molecule; red bars, the molecule labelled at both carbons of the acetyl group, regardless of any other labelling; dark grey bars, acetyl- CoA labelled at all five carbons of the ribose moiety of CoA, but not the acetyl group; white bars, UDP-GlcNAc labelled at some combination of the glucose, ribose or pyrimidine ring, but not the acetyl group; light grey bars, UDP-GlcNAc labelled at 0 3 nitrogens, but at no carbons. Error bars show the s.d. of n = 3 biological replicates. Figure 1-4: Malate excretion by P. falciparuminfected red blood cell cultures. We grew and cultured parasites as described above, collected samples of the culture medium and analysed them by HPLC MS. The data are given as molar concentrations in the medium samples. The plot at the right, indicated by grey triangle, is a close up of the profiles of the labelled metabolites. All error bars show the s.d. of n = 3 biological replicates.
Asp Glu FIGURE 2-2. Reaction of F-acetyl-CoA and OAA catalyzed by (Re)- versus(si)-citrate synthase, and interactions of ( )-erythro-2-fc versus(+)-erythro-2-fc with aconitase. FIGURE 2-1. Previously proposed carbon flow in H. modesticaldumfrom genomic information and enzymatic activity assays. 一般的な CS 酸化的 TCA 回路を有する 酸素感受性 金属依存性をあり FIGURE 2-4. Reactions catalyzed by the (Re)-versus(Si)-citrate synthase, aconitase, and isocitrate dehydrogenase. 13 C labeling distributions in citrate, α-ketoglutarate, and glutamate using [1-13 C] pyruvate are shown. (Re)-CS を有する FIGURE 2-3. Effect of FAcfor the growth of R. denitrificans, H. modesticaldum, and D. vulgaris Hildenborough(DvH). A, growth curve of R. denitrificans grown on pyruvate, FAc, or pyruvate and FAc as the carbon source; B, growth curve of H. modesticaldum during photoheterotrophic growth on pyruvate with or without FAc; C, growth curve of DvH grown on lactate with or without FAc FIGURE 2-5. New view for carbon flow in H. modesticaldum. The proposed carbon flow is through the OTCA cycle (red) and the RTCA cycle (blue) with a stronger flux through the OTCA cycle (acetyl-coa α-kg, shown in bold). The proposed role of the putative (Re)-citrate synthase is shown.
PFOR PFOR FIGURE 3-1. Schematic representation of the RTCA cycle (A) and how FAcinhibition occurs in carbon flow via the OTCA cycle (B). FIGURE 3-4. The proposed carbon flux in C. tepidum. The proposed carbon flux during mixotrophic growth with pyruvate (A) and acetate (B) FIGURE 3-3.