QT LQT LQT1 KCNQ1 KCNQ1 I Ks K + KCNE1 I Ks GqPCRGq KCNQ1 GqPCR AT 1 R α 1 α 1 AR α 1 AR KCNQ1 GqPCR KCNQ1 KCNQ1 KCNQ1 HaloTag KCNQ1-Halo Halo KCNQ1-Halo KCNQ1 KCNQ1 GFP ph uorin KCNQ1 KCNQ1 KCNQ1 KCNQ1 KCNQ1-β 2 AR KCNQ1 12 KCNQ1- β 2 β 2 AR PCR KCNQ1- α 1 AR Fugene6 HEK293 KCNQ1- α 1 AR HEK 293 β 2 AR HEK 293 KCNQ1- β 2 AR KCNQ1- in vitro crna KCNQ1- KCNQ1-2 ph Halo KCNQ1-Halo HEK293 ph Halo KCNQ1-Halo pet22b ph KCNQ1- KCNQ1- KCNQ1 KCNQ1- KCNQ1-1 KCNQ1-
A B たが ネガティブな結果であった ネガティブな結果であった 以上のデータから 以上のデータから 現存する方法では 現存する方法では 現存する方法では目 的とする変化を検出できないものと考え 的とする変化を検出できないものと られた 電流 (µa) 2.0 1.5 1.0 (3)大腸菌の蛋白発現系を用いた検討 大腸菌の蛋白発現系を用いた検討 0.5 µ A 0.5 2s -60-40 -20 0 20 40 60 電位 位 (mv) 図 1. KCNQ1- の電流 の電流 A と電流 と電流 電圧関係 電圧関係 B (2)細胞を用いた 細胞を用いた 細胞を用いたイメージング イメージング ① KCNQ1 KCNQ1- を発現させた細胞において α1ar 刺激によ によるエンドサイトーシスで るエンドサイトーシスで の蛍光強度 の蛍光強度が低下するか するかどうかを検 どうかを検 討した 図 2B B に示すように 細胞膜上の 蛍光は減少しているが 細胞全体で見た 時に 時に 明らかに蛍光が暗くなることは 明らかに蛍光が暗くなることは 明らかに蛍光が暗くなることは観 察でき 察できなかった なかった 図 2A ①細胞外 細胞外の ph 環境 環境の変化に応じて の変化に応じて ペリプ ペリプ ラズムに発現している蛋白周囲の ph 環境 も変化すると考えられるため も と考えられるため と考えられるため 大腸菌ペリ プラズムに発現させた の蛍光を観察 した後 図 3A 3A ph を変化させ 蛍光強 を変化させ 蛍光強 度への影響を検討 度への影響を検討した 図 図 3B ph ph = 7.4 から ph から = 5. 5.5 に変化させたところ 明ら かな蛍光の減弱が観察された また 逆に ph = 8.5 8 に変化させた際には 蛍光の に変化させた際には 蛍光の増強 が観察された が観察された これらの結果はほぼ報告さ これらの結果は 報告さ れている の性質を反映している 反映している ベクターのみを発 現 A 現 ② β2ar- を発現させた細胞において 同 様の検討を行なったが ①とほぼ同様の 結果であった 結果であった 図 2C, D β 2AR は刺激に よってエンドサイトーシスを起こす代表 的な受容体であるため 今回の目的を達 成するために を使用することは難し いものと考えられた 本研究の目的を達成するためには 中性環 境と酸性環境における蛍光強度の差が よりも かなり かなり大きな 大きな GFP 変異体を 得ることが必要と考えられた そのため 大腸菌のペリプラズムに導入蛋白を発現 させる系を使用し 検討を行った を発 5 mm B ph 5.5 ph 7.0 ph 8.5 2 mm 図 3. A 大腸菌のペリプラズムにベクターのみ 左側 大腸菌のペリプラズムにベクターのみ 左側 および 右側 を発現させ 中性環境で蛍光を観察 右側 を発現させ 中性環境で蛍光を観察 B をペリプラズムに発現させた大腸菌において 細 胞外 ph を変化させた際の蛍光を観察 図 2.. A, B KCNQ1-- および α1aar を発現させた HEK 293 細胞においてフェニレフリン投与により受容体を活 性化し 性化し の蛍光を観察 の蛍光を観察 C, D β2ar- を発現させ た HEK293 細胞においてイソプロテレノール投与により 受容体を活性化し 受容体を活性化し の蛍光を観察 ③培養細胞を用いた検討の結果からすると 培養細胞を用いた検討の結果からすると 否定的であったが 否定的であったが ツメガエル卵母細胞 ツメガエル卵母細胞 に KCNQ1- を発現させ 細胞表面 を発現させ 細胞表面の 蛍光強度を α1ar 刺激前後で観察した 結果として 結果として 蛍光の明らかな減弱は認め 蛍光の明らかな減弱は認め られなかった ④また AcidiFluor ORANGE 市販の ph 感受 性 Halo リガンド を使用して エンドサ イトーシスを検出できるかどうか検討し ② これまで ① これまで ①で検討した で検討したような性質を有 ような性質を有 する との融合体を用いても 目的とす との融合体を用いても 目的とす る KCNQ1 のエンドサイトーシスを検出で きなかった そのため きなかった そのため ph ph 感受性がより 高い変異体が必要である 高い変異体が必要であるが が 残念ながら 残念ながら 研究期間内にそのような変異体を 得るこ 研究期間内にそのような変異体を得 とはできなかった とは なかった 本研究は 挑戦的萌芽研究として 刺激伝導 本研究は 挑戦的萌芽研究として 刺激伝導 系が維持された状態のランゲンドルフ灌流 心臓を用いて 器官レベルで KCNQ1 の発現 量変化を検出する系を確立することを目的 として計画した 我々が明らかにしてきた受 我々が明らかにしてきた 容体刺激による KCNQ1 のエンドサイトーシ スが生理的 病態生理的意義を有することを 明らかにするためには 培養細胞だけではな く 器官レベルの検討 く 器官レベルの検討が必要である が必要である で期待する結果が得られなかった場合に
GFP ph GFP 6 Obara Y, Nagasawa R, Nemoto W, Pellegrino MJ, Takahashi M, Habecker BA, Stork PJ, Ichiyanagi O, Ito H, Tomita Y, Ishii K, Nakahata N. ERK5 induces ankrd1 for catecholamine biosynthesis and homeostasis in adrenal medullary cells. Cell Signal. 2016 Mar;28(3):177-89. Honda T, Obara Y, Yamauchi A, Couvillon AD, Mason JJ, Ishii K, Nakahata N. Phosphorylation of ERK5 on Thr732 is associated with ERK5 nuclear localization and ERK5-dependent transcription. Wu M, Obara Y, Norota I, Nagasawa Y, Ishii K. Insulin suppresses I Ks (KCNQ1/ KCNE1) currents, which require β-subunit KCNE1. Pflügers Archiv - Eur J Physiol. 2014; 466: 937-946. Susuki H, Kanemaru K, Ishii K, Ohkura M, Ohkubo Y, Iino M. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat. Commun. 2014; 5: 4153. Ishii K, Wu M, Obara Y. Is PIP2 involved in the insulin effect? Channels. 2014; 8: 391-392. 29 Ca v 1.2 67 2016 9 30 PIP 2 93 2016 3 24 Kv1.5 Kir2.1 89 2016 3 10 Cl - 89 2016 3 9 Cav1.2 66 2015 9 18 Nasu F Ishii K Azelnidipine reduces cell-surface expression of Cav1.2 channel 30 32 2015 7 30 Cav1.2 88 2015 3 18 Cav1.2 24 2014125 Cav1.2 65 2014 9 26 Internalization of KCNQ1 by activation of the 1 adrenergic receptor. 31 2014 7 25 α 1 KCNQ1 87 2014 3 20
Q1/E1 PIP 2 87 2014 3 20