別 添 ( 別 紙 1) 食 肉 製 品 鯨 肉 製 品 及 び 魚 肉 ねり 製 品 の 試 験 法 第 1 検 体 の 採 取 運 搬 及 び 試 料 の 調 製 1 食 肉 製 品 鯨 肉 製 品 及 び 魚 肉 ねり 製 品 (1) 1 検 体 当 たり 約 100 gを 採 取 する 検

食 安 発 0729 第 5 号 平 成 27 年 7 月 29 日 各 検 疫 所 長 殿 医 薬 食 品 局 食 品 安 全 部 長 ( 公 印 省 略 ) 食 品 添 加 物 等 の 規 格 基 準 に 定 めるサルモネラ 属 菌 及 び 黄 色 ブドウ 球 菌 の 試 験 法 の 改 正 について 食 品 添 加 物 等 の 規 格 基 準 ( 昭 和 34 年 厚 生 省 告 示 第 370 号 以 下 告 示 と いう )に 定 めるサルモネラ 属 菌 及 び 黄 色 ブドウ 球 菌 の 試 験 法 について 国 際 整 合 性 を 図 る 観 点 から 国 立 医 薬 品 食 品 衛 生 研 究 所 における 試 験 法 検 討 の 結 果 今 般 その 試 験 法 が 報 告 されたところである ついては 食 品 衛 生 法 施 行 規 則 及 び 食 品 添 加 物 等 の 規 格 基 準 の 一 部 改 正 について ( 平 成 5 年 3 月 17 日 付 け 衛 乳 第 54 号 以 下 平 成 5 年 通 知 とい う ) 及 び 食 品 衛 生 法 施 行 規 則 及 び 食 品 添 加 物 等 の 規 格 基 準 の 一 部 改 正 に ついて ( 平 成 10 年 11 月 25 日 付 け 生 衛 発 第 1674 号 以 下 平 成 10 年 通 知 という )を 下 記 のとおり 改 正 することとしたので 関 係 者 への 周 知 方 よろし くお 願 いする なお 本 通 知 は 平 成 28 年 1 月 29 日 から 適 用 することとし それまでの 間 なお 従 前 の 例 によることができる 旨 申 し 添 える 記 1 平 成 5 年 通 知 のうち 別 紙 1を 別 添 のとおり 改 める 2 平 成 10 年 通 知 のうち 第 2の2の(2)のア 中 別 紙 に 示 す 試 験 法 により を 平 成 5 年 3 月 17 日 付 け 衛 乳 第 54 号 に 示 す 試 験 法 により に 改 め 別 紙 を 削 除 する

別 添 ( 別 紙 1) 食 肉 製 品 鯨 肉 製 品 及 び 魚 肉 ねり 製 品 の 試 験 法 第 1 検 体 の 採 取 運 搬 及 び 試 料 の 調 製 1 食 肉 製 品 鯨 肉 製 品 及 び 魚 肉 ねり 製 品 (1) 1 検 体 当 たり 約 100 gを 採 取 する 検 体 は 原 則 として 容 器 包 装 のまま 採 取 す る ただし ハム 等 のように 1 包 装 単 位 が1 kg 以 上 に 及 ぶものは 切 断 して 採 取 する この 場 合 滅 菌 した 器 具 及 び 容 器 を 用 い 汚 染 の 起 こらぬよう 検 体 を 採 取 すること また 切 断 面 で 微 生 物 が 増 殖 したり 包 装 内 面 を 伝 わって 断 面 部 から 微 生 物 が 内 部 に 侵 入 しないように 保 管 法 にも 注 意 すること (2) 採 取 した 検 体 の 運 搬 は 保 冷 容 器 を 用 い 氷 等 で4 以 下 に 検 体 を 保 ち 速 や かに 検 査 に 供 することができるよう 運 搬 すること なお 冷 凍 状 態 のものは ドラ イアイス 等 で 凍 結 しつつ 運 搬 すること (3) 微 生 物 試 験 に 供 する 試 料 の 調 製 は 製 品 (スライスハム 等 細 切 された 製 品 を 除 く )の 切 断 すべき 表 面 をアルコール 綿 でよくふいた 後 滅 菌 した 器 具 を 用 いて 無 菌 的 に 切 断 し その 断 面 の 中 央 部 から 25 gを 無 菌 的 に 採 り 試 料 とする 試 料 に 滅 菌 ペプトン 加 生 理 食 塩 水 225 mlを 加 えて 細 砕 し 試 料 液 とする スライスハム 等 細 切 された 製 品 にあっては 滅 菌 した 器 具 を 用 いて 25 g を 無 菌 的 に 切 断 して 採 り 試 料 とする 試 料 に 滅 菌 ペプトン 加 生 理 食 塩 水 225 mlを 加 えて 細 砕 し 試 料 液 とする ただし 食 肉 製 品 に 係 る 試 験 のうち サルモネラ 属 菌 については 別 添 1 黄 色 ブ ドウ 球 菌 については 別 添 2によること 2 砂 糖 でん 粉 及 び 香 辛 料 検 体 の 採 取 に 当 たっては 検 査 対 象 を 十 分 にかき 混 ぜた 後 砂 糖 又 はでん 粉 にあっ ては 100 g 以 上 香 辛 料 にあっては 10 g 以 上 を 無 菌 的 に 滅 菌 採 取 ビンに 採 る 検 体 は よくかき 混 ぜた 後 無 菌 的 に5 gを 滅 菌 試 料 ビンに 採 取 し 滅 菌 ペプトン 加 生 理 食 塩 水 を 加 えて 100 mlとし 密 栓 してよく 振 り 混 ぜる その 液 約 20 mlを 無 菌 的 に 滅 菌 中 試 験 管 (18 mm 180 mm)に 採 り 沸 騰 水 浴 中 に 入 れ 10 分 間 加 熱 した 後 急 冷 して 試 料 液 とする 第 2 試 薬 及 び 培 地 1 微 生 物 試 験 に 用 いる 試 薬 及 び 培 地 試 薬 及 び 培 地 は 次 のとおりとする なお (2)から(6)については 市 販 品 を 用 いても 差 し 支 えない

ただし 食 肉 製 品 に 係 る 試 験 のうち サルモネラ 属 菌 については 別 添 1 黄 色 ブド ウ 球 菌 については 別 添 2によること (1) ペプトン 加 生 理 食 塩 水 ペプトン1.0 g 及 び 塩 化 ナトリウム8.5 gを 精 製 水 1,000 mlに 溶 かし 滅 菌 する 最 終 ph は7.0±0.1でなければならない (2) ECはっ 酵 管 標 準 処 方 は 次 のとおりとする ペプトン 20.0 g 乳 糖 5.0 g 胆 汁 酸 塩 1.5 g リン 酸 水 素 カリウム4.0 g リン 酸 二 水 素 カリウム 1.5 g 及 び 食 塩 5.0 gを1,000 ml の 精 製 水 に 溶 かす これをはっ 酵 管 に 分 注 して 滅 菌 した 後 速 やかに 冷 却 する 最 終 ph は6.9±0.1でなければな らない (3) EMB 培 地 標 準 処 方 は 次 のとおりとする ペプトン 10.0 g リン 酸 水 素 カリウム 2.0 g 乳 糖 10.0 g エオシンY0.4 g メチレンブルー0.065 g 及 び 寒 天 15 gを 精 製 水 1,000 mlに 加 え 加 熱 溶 解 し 滅 菌 し 分 注 して 平 板 とする 最 終 phは7.0±0.1 でなければならない (4) 乳 糖 ブイヨンはっ 酵 管 標 準 処 方 は 次 のとおりとする 肉 エキス 3.0 g ペプトン5.0 g 乳 糖 5.0 g 及 びブロムチモールブルー0.024 g を 1,000 mlの 精 製 水 に 溶 かす これをはっ 酵 管 に 分 注 して 滅 菌 した 後 速 やかに 冷 却 する 最 終 ph は7.2±0.1 でなければならない (5) クロストリジウム 培 地 標 準 処 方 は 次 のとおりとする 混 合 ペプトン 15.0 g 大 豆 ペプトン7.5 g 酵 母 エキス 7.5 g 肉 エキス7.5 g クエン 酸 鉄 アンモニウム1.0 g メタ 重 亜 硫 酸 ナトリウム1.0 g L システイン 塩 酸 塩 0.75 g 及 び 寒 天 30.0 gを 精 製 水 1,000 mlに 加 え 加 熱 溶 解 し 滅 菌 する 最 終 phは7.6±0.1でなければならない (6) 倍 濃 度 BGLBはっ 酵 管 標 準 処 方 は 次 のとおりとする

ペプトン 10.0 g 乳 糖 10.0 g 牛 胆 汁 末 20.0 g 及 びブリリアントグリーン0.0133 g に 精 製 水 を 加 えて500 ml とし 加 温 溶 解 し はっ 酵 管 に 約 10 mlずつ 分 注 した 後 滅 菌 する 最 終 phは7.2±0.1でなければならない 2 亜 硝 酸 根 の 試 験 に 用 いる 試 薬 試 薬 は 次 のとおりとする (1) スルファニルアミド: 特 級 (2) スルファニルアミド 液 :スルファニルアミド0.5 gを 塩 酸 (1 10)100 mlに 加 温 しながら 溶 かす (3) ナフチルエチレンジアミン 溶 液 :N 1 ナフチルエチレンジアミン 二 塩 酸 塩 0.12 gを 水 100 mlに 溶 かす (4) N 1 ナフチルエチレンジアミン 二 塩 酸 塩 : 特 級 第 3 試 験 法 1 微 生 物 (1) 非 加 熱 食 肉 製 品 及 び 特 定 加 熱 食 肉 製 品 のE.coliの 試 験 法 1 試 料 液 1 ml ずつを 接 種 したECはっ 酵 管 を5 本 試 料 液 の10 倍 希 釈 液 1 ml ずつを 接 種 したECはっ 酵 管 を5 本 用 意 し 44.5 ±0.2 の 温 度 で24 時 間 ± 2 時 間 培 養 した 後 ガス 発 生 を 認 めないものはE.coli 陰 性 とする 2 ガス 発 生 を 認 めた 場 合 は 直 ちに1 白 金 耳 量 をEMB 培 地 に 塗 抹 培 養 して 独 立 した 集 落 を 形 成 させる 35.0 ±1.0 で 24 時 間 ±2 時 間 培 養 後 EMB 培 ちょう 地 から 大 腸 菌 群 の 定 型 的 集 落 を 釣 菌 して 乳 糖 ブイヨンはっ 酵 管 及 び 寒 天 斜 面 培 地 に 移 植 する その 乳 糖 ブイヨンはっ 酵 管 で 当 該 集 落 を48 時 間 培 養 してガス 発 生 を 確 認 した かん ものと 相 対 する 寒 天 斜 面 培 地 上 の 菌 について 鏡 検 し グラム 陰 性 無 芽 胞 桿 菌 を 認 めた 場 合 はE.coli 陽 性 とし その 他 の 場 合 はE.coli 陰 性 とする 3 試 料 液 について 陽 性 を 示 すものが3 以 下 であればE.coliがその1 gにつき10 以 下 試 験 液 の10 倍 希 釈 液 について 陽 性 を 示 すものが3 以 下 であれば E.coli が その1 gにつき100 以 下 とする (2) 加 熱 食 肉 製 品 及 び 乾 燥 食 肉 製 品 の E.coliの 試 験 法

1 試 料 液 1 ml それぞれについて5 本 のECはっ 酵 管 に 接 種 し 44.5 ±0.2 の 温 度 で24 時 間 ±2 時 間 培 養 した 後 ガス 発 生 を 認 めないものはE.coli 陰 性 とする 2 ガス 発 生 を 認 めた 場 合 は 直 ちに1 白 金 耳 量 をEMB 培 地 に 塗 抹 培 養 して 独 立 した 集 落 を 形 成 させる 35.0 ±1.0 で 24 時 間 ±2 時 間 培 養 後 EMB 培 ちょう 地 から 大 腸 菌 群 の 定 型 的 集 落 を 釣 菌 して 乳 糖 ブイヨンはっ 酵 管 及 び 寒 天 斜 面 培 地 に 移 植 する その 乳 糖 ブイヨンはっ 酵 管 で 当 該 集 落 を48 時 間 培 養 してガス 発 生 を 確 認 した かん ものと 相 対 する 寒 天 斜 面 培 地 上 の 菌 について 鏡 検 し グラム 陰 性 無 芽 胞 桿 菌 を 認 めた 場 合 はE.coli 陽 性 とし その 他 の 場 合 はE.coli 陰 性 とする (3) サルモネラ 属 菌 試 験 法 別 添 1の 方 法 によること (4) 黄 色 ブドウ 球 菌 試 験 法 別 添 2の 方 法 によること (5) クロストリジウム 属 菌 試 験 法 試 料 液 10 ml 及 び 試 料 液 の10 倍 希 釈 液 10 mlずつをそれぞれについて2 枚 の 滅 菌 パウチ(ラミネートフィルム 製 市 販 品 あり )に 正 確 に 採 り あらかじめ 加 温 し て 溶 かし 45 ~50 の 温 度 に 保 持 したクロストリジウム 培 地 約 15 mlをこれに 加 え よく 混 合 し 熱 シールした 後 冷 却 凝 固 させる 培 地 が 凝 固 した 後 35.0 ±1.0 で24 時 間 ±2 時 間 培 養 する この 場 合 検 体 の 希 釈 に 用 いた 滅 菌 ペプト ン 加 生 理 食 塩 水 10 mlを 培 地 に 混 合 し 以 下 試 料 の 場 合 と 同 様 に 操 作 して 培 養 した ものを 対 照 とし パウチ 滅 菌 生 理 ペプトン 加 食 塩 水 及 び 培 地 が 無 菌 であったこと 並 びに 操 作 が 完 全 であったことを 確 かめなければならない 菌 数 の 算 定 は 黒 色 の 集 落 につき 食 品 添 加 物 等 の 規 格 基 準 中 第 1 食 品 の 部 D 各 条 の 項 の 〇 氷 雪 の1 氷 雪 の 成 分 規 格 の(2)の⒉のaからgまでに 準 じて 行 い クロストリジウム 属 菌 の 菌 数 とする (6) 大 腸 菌 群 試 験 法 1 3 本 の 倍 濃 度 BGLBはっ 酵 管 に 試 料 液 10 ml ずつをそれぞれに 接 種 し 35.0 ±1.0 の 温 度 で48 時 間 ±3 時 間 培 養 した 後 ガス 発 生 を 認 めないも のは 大 腸 菌 群 陰 性 とする 2 ガス 発 生 を 認 めた 場 合 は 直 ちに1 白 金 耳 量 をEMB 培 地 に 塗 抹 培 養 して 独 立 した 集 落 を 形 成 させる 35.0 ±1.0 で 24 時 間 ±2 時 間 培 養 後 EMB 培

ちょう 地 から 大 腸 菌 群 の 定 型 的 集 落 を 釣 菌 して 乳 糖 ブイヨンはっ 酵 管 及 び 寒 天 斜 面 培 地 に 移 植 する その 乳 糖 ブイヨンはっ 酵 管 で 当 該 集 落 を48 時 間 ±3 時 間 培 養 し てガス 発 生 を 確 認 したものと 相 対 する 寒 天 斜 面 培 地 上 の 菌 について 鏡 検 し グラ か ん ム 陰 性 無 芽 胞 桿 菌 を 認 めた 場 合 は 大 腸 菌 群 陽 性 とし その 他 の 場 合 は 大 腸 菌 群 陰 性 とする (7) 芽 胞 数 の 試 験 法 試 料 液 の 10 倍 希 釈 液 及 び100 倍 希 釈 液 を 作 成 する 試 料 液 試 料 液 の10 倍 希 釈 液 及 び100 倍 希 釈 液 のそれぞれについて 滅 菌 ペトリ 皿 を2 枚 用 意 し 滅 菌 ピペットを 用 いて 対 応 する 滅 菌 ペトリ 皿 に 当 該 試 料 液 1mLずつ を 正 確 に 採 り あらかじめ 加 温 して 溶 かし45 ~50 の 温 度 に 保 持 した 標 準 寒 天 培 地 ( 食 品 添 加 物 の 規 格 基 準 中 第 1 食 品 の 部 D 各 条 の 〇 氷 雪 の1 氷 雪 の 成 分 規 格 の 目 の(2)の⒉ 細 菌 数 ( 生 菌 数 )の 測 定 法 に 規 定 する 標 準 寒 天 培 養 基 を いう ) 約 15 mlをこれに 加 え 静 かによく 混 合 し 冷 却 凝 固 させる 培 地 が 凝 固 した 後 倒 置 して 35.0 ±1.0 で48 時 間 ±3 時 間 培 養 する この 場 合 検 体 の 希 釈 に 用 いた 滅 菌 ペプトン 加 生 理 食 塩 水 1 mlに 培 地 を 混 合 し 以 下 試 料 の 場 合 と 同 様 に 操 作 して 培 養 したものを 対 照 とし ペトリ 皿 滅 菌 ペプトン 加 生 理 食 塩 水 及 び 培 地 が 無 菌 であったこと 並 びに 操 作 が 完 全 であったことを 確 かめなければなら ない 芽 胞 数 の 算 定 は 食 品 添 加 物 等 の 規 格 基 準 中 第 1 食 品 の 部 D 各 条 の 項 の 〇 氷 菓 の1 氷 菓 の 成 分 規 格 の 目 の(3)の⒉ 細 菌 数 ( 生 菌 数 )の 測 定 法 に 規 定 する 細 菌 数 の 算 定 により 行 う 2 亜 硝 酸 根 (1) 試 料 液 の 調 製 試 料 約 10 gを 正 確 に 量 り 約 80 の 水 80 ml 及 び0.5N 水 酸 化 ナトリウム 溶 液 10 mlを 加 え ホモジナイズした 後 容 量 200 mlのフラスコに 移 す 容 器 は 温 水 10 ml ずつで5 回 洗 浄 し 洗 液 はフラスコに 加 える これに 硫 酸 亜 鉛 溶 液 (3 25)10 ml を 加 えてよく 振 り 混 ぜた 後 ときどき 振 り 混 ぜながら 80 の 水 浴 中 で20 分 間 加 温 する 次 に 冷 水 中 で 室 温 まで 冷 却 した 後 0.5N 水 酸 化 ナトリウム 溶 液 でpH 9.5 に 調 整 し 水 を 加 えて 正 確 に200 mlとする 内 容 をよく 混 和 し 冷 蔵 庫 中 に 約 30 分 間 放 置 した 後 乾 燥 ろ 紙 を 用 いて 共 栓 フラスコへろ 過 する 最 初 のろ 液 約 20 ml を 捨 て 澄 明 なろ 液 を 試 料 液 とする (2) 空 試 料 液 の 調 製

水 10 mlを 容 量 200 mlのフラスコに 採 り (1) 試 料 液 の 調 製 と 同 様 に 操 作 し 空 試 料 液 とする (3) 検 量 線 用 標 準 液 の 調 製 亜 硝 酸 ナトリウム 0.150 g を 正 確 に 量 り 1,000 ml のメスフラスコに 入 れ 水 を 加 えて 溶 かして 正 確 に 1,000 mlとし 標 準 原 液 とする 標 準 原 液 10 ml を 正 確 に 量 り 100 mlのメスフラスコに 入 れ 水 を 加 えて 正 確 に100 ml とし その2 ml を 正 確 に 量 り 水 を 加 えて 正 確 に100 mlとし 標 準 液 とする(この 液 1 mlは 亜 硝 酸 根 0.2 μg を 含 む ) 標 準 液 2.5 ml 5 ml 10 ml 15 ml 及 び20 mlをそれぞれ 正 確 に 量 り それぞれ 水 を 加 えて 正 確 に 20 mlとし それぞれを 検 量 線 用 標 準 液 と する(これらの 液 20 ml 中 には それぞれ 亜 硝 酸 根 0.5 μg 1μg 2μg 3μg 及 び4μgを 含 む ) (4) 測 定 法 1 測 定 条 件 分 光 光 度 計 を 用 い 波 長 540 nmの 吸 光 度 を 測 定 する 2 測 定 試 料 液 及 び 空 試 料 液 それぞれ 20 ml( 注 1)を 正 確 に 量 り それぞれ25 ml の メスフラスコに 入 れ それぞれにスルファニルアミド 液 1 ml 塩 酸 (1 2) 1 ml ナフチルエチレンジアミン 溶 液 1 ml 及 び 水 を 加 えてそれぞれ 正 確 に25 mlとし よく 振 り 混 ぜ 20 分 間 放 置 し( 注 2) 測 定 液 及 び 空 測 定 液 とする 水 20 mlを 用 いて 同 様 に 操 作 したものを 対 照 として540 nmにおける 測 定 液 及 び 空 測 定 液 の 吸 光 度 を 測 定 し E A E B とする 試 料 液 が 着 色 しているときは 試 料 液 20 mlを 正 確 に 量 り 塩 酸 (1 2)1 ml 及 び 水 を 加 えて 正 確 に25 mlとし たものを 水 を 対 照 として 吸 光 度 を 測 定 し E C とする 吸 光 度 差 E A -E B 又 は 試 料 液 が 着 色 した 場 合 は 吸 光 度 差 E A -(E B +E C ) を 求 め ΔEとする( 注 3) 3 検 量 線 検 量 線 用 標 準 液 20 mlずつをそれぞれ 正 確 に 量 り それぞれ25 mlのメスフラ スコに 入 れ 2 測 定 における 試 料 液 と 同 様 に 操 作 し それぞれの 吸 光 度 差 ΔE S 1 ΔE S2 ΔE S5 を 求 め 検 量 線 を 作 成 する 4 定 量 測 定 液 の 吸 光 度 差 ΔEと 検 量 線 から 試 料 液 中 の 亜 硝 酸 根 含 有 量 (μg/tube) を 求 め 次 式 によって 検 体 中 の 亜 硝 酸 根 含 量 (g/kg)を 計 算 する

亜 硝 酸 根 含 量 (g/kg) =C (200/20) (1/W) (1/1,000) =C/(100 W) C: 試 料 液 中 の 亜 硝 酸 根 含 量 (μg/tube) W: 試 料 の 採 取 量 (g) - ( 注 1) NO 2 濃 度 の 高 い 場 合 は 検 量 範 囲 (0.02 μg/ml~0.2 μg/ml)に 入 るよう 試 料 液 を 希 釈 する ( 注 2) 呈 色 は 反 応 時 間 10 分 間 から2 時 間 程 度 まで 安 定 であるので 約 20 分 間 放 置 してよい ( 注 3) 試 料 中 にアスコルビン 酸 等 の 還 元 物 質 が 含 まれている 場 合 は 定 量 妨 害 と なり 亜 硝 酸 の 測 定 値 は 低 くなる その 場 合 試 料 量 の 10 g を5 g 又 は 2 gに 減 らすか 試 料 液 の 20 mlを10 ml 又 は5 mlに 減 らすことによ り その 測 定 値 の 低 下 を 幾 分 か 防 止 することができる 3 ph (1) 食 肉 製 品 次 の1 又 は2の 方 法 により 行 うこと 1 直 接 法 ニードル 型 電 極 を 検 体 に 直 接 挿 入 するか 又 はスリーブ 型 電 極 を 直 接 検 体 切 断 面 に 当 ててpHを 測 定 する 測 定 部 分 は いずれの 電 極 を 用 いた 場 合 も 検 体 表 面 から5 mm 以 上 の 内 側 とし 最 低 3か 所 を 測 定 して その 平 均 値 を 検 体 のpH とす る 2 水 抽 出 法 検 体 表 面 から5 mm 以 上 の 内 側 の 部 分 を 採 取 し 試 料 とする 試 料 に 食 肉 の 場 合 は 試 料 に 対 して9 倍 量 以 内 製 品 の 場 合 は 試 料 と2~3 倍 量 以 内 の 精 製 水 を 加 え 均 質 化 し 得 られた 上 澄 液 について phを 測 定 し 検 体 の phとする (2) 魚 肉 ねり 製 品 製 品 の 一 部 を 採 取 し 試 料 とし 試 料 に その10 倍 量 の 精 製 水 を 加 え 細 砕 し ph を 測 定 し 検 体 の ph とする 4 水 分 活 性

次 の(1) 又 は(2)の 方 法 により 行 うこと ただし (2)により 行 うことができるの は アルコール 等 揮 発 性 物 質 の 影 響 を 受 けない 場 合 に 限 る なお 飽 和 溶 液 の 選 定 に 当 たっては 測 定 しようとする( 適 否 の 判 定 基 準 となる) 水 分 活 性 を 中 心 に 上 下 同 間 隔 を 持 つ 試 薬 を 用 いるよう 留 意 すること また 飽 和 溶 液 の 作 製 に 当 たっては 25 における 溶 解 度 を 予 め 把 握 しておくこと 水 分 活 性 の 測 定 値 は 小 数 点 以 下 2 桁 までとし 3 桁 以 下 は 切 捨 とすること (1) 容 器 包 装 を 取 り 除 き 検 体 表 面 から5 mm 以 上 内 側 の 部 分 を 速 やかに 細 切 する か 表 層 部 分 が 除 去 しにくい 検 体 にあってはそのまま 輪 切 りにして 試 料 とする 試 料 は 水 分 活 性 測 定 装 置 の 検 出 器 内 空 間 容 積 の3% 以 上 の 容 積 となるよう 適 当 量 を 採 取 し アルミ 箔 皿 又 は 開 放 型 平 皿 に 乗 せ 直 ちに 検 出 器 に 入 れて 上 蓋 を 閉 めて 密 閉 し 25 ±2 の 条 件 下 に 置 く 10 分 間 隔 で 数 値 を 読 み その 間 に 数 値 の 変 動 が 認 められない 時 点 が 検 出 器 内 の 水 蒸 気 圧 が 平 衡 状 態 になったと 見 なし その 時 の 数 値 を 検 体 の 水 分 活 性 とする なお 水 分 活 性 測 定 装 置 には 電 気 抵 抗 式 (Change in electrical conductivity of immobilized salt soln)による 機 器 を 用 い 測 定 する 前 に 既 知 飽 和 溶 液 を 用 いて 校 正 すること (2) 容 器 包 装 を 取 り 除 き 無 作 為 に10 g ~20 g を 採 り これを 検 体 とする 検 体 を 速 やかに 細 切 し これより 約 1 gをとり ( 又 は 検 体 を 内 径 25 mm のコル クポーラーで 抜 き 取 った 後 約 1 gになるようにスライスし ) 予 め 精 秤 したアルミ 箔 ( 内 径 25 mm)に 入 れて 精 秤 する これを 試 料 とする 測 定 しようとする 水 分 活 性 より 高 い 値 をもつ 飽 和 溶 液 A 及 び 測 定 しようとする 水 分 活 性 より 低 い 値 をもつ 飽 和 溶 液 Bを 準 備 する 試 料 は 速 やかにコンウエイユニット( 以 下 ユニット という )の 内 室 に 入 れ 外 室 にはA Bを 別 々のユニットに3 ml~4 mlを 入 れた 後 ユニットのすり 合 わ せ 部 分 にワセリンを 塗 り 蓋 をする クリップして 気 密 を 保 つようにして25 ± 2 で2 時 間 ±0.5 時 間 静 置 する 2 時 間 ±0.5 時 間 静 置 後 試 料 の 重 量 を 精 秤 し 予 め 測 定 した 重 量 との 増 減 を 求 め 次 式 により 試 料 の 水 分 活 性 を 算 出 する 水 分 活 性 =(bx-ay)/(x-y) a: 飽 和 溶 液 Aの 水 分 活 性 の 値 b: 飽 和 溶 液 Bの 水 分 活 性 の 値 x:aを 使 用 した 際 の 試 料 の 重 量 増 加 量

y:bを 使 用 した 際 の 試 料 の 重 量 減 少 量

( 別 添 1)サルモネラ 属 菌 試 験 法 1. 試 験 法 の 概 要 試 験 試 料 25 g をストマッキング 袋 等 に 無 菌 的 にとりわけ 緩 衝 ペプトン 水 (BPW) 225 ml を 加 え ストマッカー 等 で 均 質 化 し 培 養 する その 培 養 液 の 一 部 を RV (Rappaport-Vassiliadis) 培 地 と TT(Tetrathionate) 培 地 で 選 択 増 菌 培 養 後 2 種 類 の 分 離 寒 天 培 地 ( 硫 化 水 素 産 生 性 で 検 出 する 培 地 と 硫 化 水 素 産 生 性 に 関 係 なくサルモネ ラ 属 菌 を 検 出 する 培 地 それぞれ1 種 類 )に 塗 抹 後 培 養 し 疑 わしい 集 落 の 形 成 を 観 察 する サルモネラ 属 菌 と 疑 われる 集 落 3 個 を TSI(Triple Sugar Iron) 寒 天 培 地 及 び LIM(Lysine Indole Motility) 培 地 に 接 種 し 生 化 学 的 性 状 の 確 認 を 行 う さらに 抗 O 血 清 による 凝 集 反 応 により O 抗 原 の 血 清 型 別 を 実 施 してサルモネラ 属 菌 と 確 定 する 2. 使 用 器 具 装 置 (1) 滅 菌 ハサミ (2) 滅 菌 ピンセット (3)ストマッカー (4)ストマッキング 袋 (5) 三 角 フラスコ (6) 自 動 秤 量 分 注 装 置 又 は 秤 量 器 (7)pH 計 (8) 滅 菌 ピペット マイクロピペット 及 び 滅 菌 チップ (9)メスシリンダー (10) 小 試 験 管 (11) 中 試 験 管 (12) 試 験 管 立 て (13) 白 金 耳 (14) 高 圧 蒸 気 滅 菌 器 ( 滅 菌 のインジケーター) (15) 乾 熱 滅 菌 器 ( 滅 菌 のインジケーター) (16) 恒 温 槽 恒 温 水 槽 (37 ±1 及 び42.0 ±0.5 の 仕 様 ) (17) 滅 菌 シャーレ( 直 径 90 mm~100 mm) 3. 培 地 試 薬 及 び 抗 血 清 (1) 前 増 菌 用 培 地 緩 衝 ペプトン 水 (BPW) : 加 温 溶 解 後 121 で 15 分 間 滅 菌 する (2) 選 択 増 菌 用 培 地 RV(Rappaport-Vassiliadis) 培 地 : 加 温 溶 解 後 10 mlずつ 中 試 験 管 に 分 注 し 115

で15 分 間 滅 菌 する 作 製 後 は 冷 蔵 庫 で 数 週 間 保 存 可 能 である TT(Tetrathionate) 培 地 : 沸 騰 まで 加 温 混 和 後 45 以 下 に 冷 却 する ヨウ 素 溶 液 20 mlを 培 地 1 Lに 加 え よく 攪 拌 する さらに 攪 拌 しながら 10 mlずつ 滅 菌 中 試 験 管 に 分 注 する TT 基 礎 培 地 は 作 製 後 冷 蔵 庫 で 保 存 可 能 であるが ヨウ 素 溶 液 添 加 後 には 作 製 当 日 に 使 用 すること (3) 分 離 寒 天 培 地 硫 化 水 素 の 産 生 により 判 定 する 培 地 :MLCB DHL 又 はXLDから1 種 類 使 用 説 明 書 に 従 って 作 製 する 硫 化 水 素 産 生 又 は 非 産 生 によらずサルモネラ 属 菌 と 判 定 する 培 地 : BGS(ブリリ アントグリーン+スルファピリジン) CHS(クロモアガーサルモネラ) ESII(ESサ ルモネラ 寒 天 培 地 II) SM2から1 種 類 使 用 説 明 書 に 従 って 作 製 する (4) 確 認 用 培 地 TSI(Triple Sugar Iron) 寒 天 培 地 : 加 温 溶 解 後 小 試 験 管 に 分 注 121 で15 分 間 滅 菌 し 高 層 斜 面 とする LIM(Lysine Indole Motility) 培 地 : 加 温 溶 解 後 小 試 験 管 に 分 注 121 で15 分 間 滅 菌 し 高 層 に 固 める (5)O 群 別 確 認 血 清 サルモネラ 免 疫 血 清 O 多 価 O1 多 価 及 びO 群 血 清 (6) 生 化 学 的 性 状 確 認 培 地 試 薬 等 シモンズクエン 酸 ナトリウム 培 地 : 加 温 溶 解 後 小 試 験 管 に 分 注 し 121 で15 分 間 滅 菌 し 斜 面 とする VP 半 流 動 培 地 : 加 温 溶 解 後 小 試 験 管 に 分 注 し 121 で15 分 間 滅 菌 し 高 層 に 固 める インドール 試 薬 VP 用 試 薬 チトクロームオキシダーゼ 試 験 用 ろ 紙 ONPGディスク マロン 酸 塩 培 地 : 加 温 溶 解 後 小 試 験 管 に 分 注 し 121 で15 分 間 滅 菌 する 4. 試 験 手 順 (1) 検 体 の 調 整 1 1 検 体 当 たり 約 100 g を 採 取 する 検 体 は 原 則 として 容 器 包 装 のまま 採 取 す る ただし ハム 等 のように 1 包 装 単 位 が1 kg 以 上 に 及 ぶものは 切 断 して 採 取 する この 場 合 滅 菌 した 器 具 及 び 容 器 を 用 い 汚 染 の 起 こらぬよう 検 体 を 採 取 すること また 切 断 面 で 微 生 物 が 増 殖 したり 包 装 内 面 を 伝 わって 断 面 部 か ら 微 生 物 が 内 部 に 侵 入 しないように 保 管 法 にも 注 意 すること

2 採 取 した 検 体 の 運 搬 は 保 冷 容 器 を 用 い 氷 等 で4 以 下 に 検 体 を 保 ち 速 や かに 検 査 に 供 することができるよう 運 搬 すること なお 冷 凍 状 態 のものは ド ライアイス 等 で 凍 結 しつつ 運 搬 すること 3 微 生 物 試 験 に 供 する 試 料 の 調 製 は 製 品 (スライスハム 等 細 切 された 製 品 を 除 く )の 切 断 すべき 表 面 をアルコール 綿 でよくふいた 後 滅 菌 した 器 具 を 用 いて 無 菌 的 に 切 断 し その 断 面 の 中 央 部 から25 gを 無 菌 的 に 採 り 試 料 とする スライスハム 等 細 切 された 製 品 にあっては 滅 菌 した 器 具 を 用 いて25 gを 無 菌 的 に 切 断 して 採 り 試 料 とする (2) 前 増 菌 培 養 1 BPW を 約 37 に 温 めておく 2 試 料 25 gにbpw 225 mlを 加 え 1 分 間 ストマッカー 処 理 する 3 37 で22 時 間 ±2 時 間 前 増 菌 培 養 する (3) 選 択 増 菌 培 養 1 RV 培 地 及 び TT 培 地 を 約 42 に 温 めておく 2 BPW で 前 培 養 した 培 養 液 0.1 ml を RV 培 地 10 mlに 接 種 する 3 BPW で 前 培 養 した 培 養 液 1 mlをtt 培 地 10 ml に 接 種 する 4 接 種 した RV 及 び TT 培 地 を42 で22 時 間 ±2 時 間 培 養 する (4) 選 択 分 離 培 養 1 培 養 後 の RV 及 びTT 培 地 をよく 攪 拌 する 2 1 白 金 耳 量 を 以 下 の(ア) 硫 化 水 素 の 産 生 により 判 定 する 分 離 用 寒 天 培 地 及 び (イ) 硫 化 水 素 産 生 非 産 生 によらずサルモネラ 属 菌 と 判 定 する 分 離 用 寒 天 培 地 のグループからそれぞれ1 種 類 を 選 び 画 線 塗 抹 する (ア) 硫 化 水 素 の 産 生 により 判 定 する 分 離 用 寒 天 培 地 (1 種 類 選 択 ) MLCB DHL XLD (イ) 硫 化 水 素 産 生 非 産 生 によらずサルモネラ 属 菌 と 判 定 する 分 離 用 寒 天 培 地 (1 種 類 選 択 ) BGS (ブリリアントグリーン+スルファピリジン) CHS(クロモアガーサルモネラ) ESII (ES サルモネラ 寒 天 培 地 II) SM2 (chromid Salmonella Agar) 3 接 種 した 培 地 を 37 で22 時 間 ±2 時 間 培 養 する 注 :サルモネラ 属 菌 を 釣 菌 する 際 集 落 の 色 については 硫 化 水 素 により 判 定 す る 培 地 では 黒 色 集 落 をサルモネラ 属 菌 と 推 定 とする また 硫 化 水 素 産 生 非 産 生 によらずサルモネラ 属 菌 と 判 定 する 培 地 のうち BGSでは 無 色 透 明 ( 培 地 色

は 赤 色 ) CHS では 藤 色 並 びに ESII 及 びSM2ではピンク 色 の 集 落 がサルモネラ 属 菌 と 推 定 される 定 型 集 落 である 分 離 用 寒 天 培 地 上 でのサルモネラ 属 菌 集 落 の 色 についてはあらかじめ 既 知 のサルモネラ 属 菌 株 を 用 いて 検 証 しておくこと (5) 確 認 培 養 1 各 分 離 用 寒 天 培 地 に 形 成 された 定 型 集 落 ( 各 培 地 の 上 記 注 意 を 参 照 )を3 個 ず つ 釣 菌 して TSI 寒 天 培 地 とLIM 培 地 に 接 種 する 2 TSI 寒 天 培 地 には 白 金 線 で 高 層 に 穿 刺 し 斜 面 に 塗 抹 する 3 LIM 培 地 は 高 層 に 穿 刺 する 4 接 種 した 培 地 は 37 で 22 時 間 ±2 時 間 培 養 する 5 培 養 後 以 下 の 結 果 が 得 られたものは 定 型 的 サルモネラ 属 菌 と 判 断 する (ア)TSI 寒 天 培 地 : 高 層 部 黄 変 黒 変 ガス 産 生 ( 高 層 部 における 気 泡 又 は 亀 裂 の 発 生 ) 及 び 斜 面 部 が 鮮 やかに 赤 変 したもの (イ)LIM 培 地 : 培 地 全 体 が 紫 変 (リジン 陽 性 ) 運 動 性 陽 性 となることを 確 認 後 インドール 試 薬 の 重 層 によりインドール 反 応 を 検 討 する サルモネラ 属 菌 は インドール 反 応 陰 性 である( 色 の 変 化 は 無 い) インドール 反 応 陽 性 の 場 合 は 数 分 以 内 に 重 層 試 薬 の 赤 変 を 示 す 6 定 型 的 なサルモネラ 属 菌 と 判 断 された 菌 株 は (6) に 示 す O 抗 原 の 血 清 学 的 試 験 を 行 い サルモネラ 属 菌 であることの 確 定 及 びO 抗 原 群 について 決 定 する 7 サルモネラ 属 菌 には 硫 化 水 素 非 産 生 性 運 動 性 の 弱 いもの リジン 陰 性 とい った 非 定 型 的 性 状 を 示 すものがあり また 市 販 の O 血 清 に 凝 集 の 弱 い O 群 型 別 不 能 のサルモネラ 属 菌 も 知 られている 1から6の 操 作 により 定 型 的 サルモネ ラ 属 菌 の 判 断 は 可 能 であると 考 えるが 定 型 的 性 状 を 示 さない 場 合 は(7)に 示 す 生 化 学 的 性 状 試 験 を 実 施 し サルモネラ 属 菌 の 確 認 をする (6)O 血 清 群 別 サルモネラ 属 菌 と 疑 われ 釣 菌 された 菌 株 について サルモネラ 免 疫 血 清 を 用 い たスライド 凝 集 法 による O 血 清 群 別 試 験 を TSI 寒 天 培 地 斜 面 上 から 菌 を 採 取 して 実 施 する 1 O 多 価 血 清 及 び O1 多 価 血 清 を 用 いて 凝 集 試 験 を 行 い 凝 集 が 見 られた O 群 血 清 を 用 いて 当 該 菌 の O 群 を 決 定 する 2 サルモネラ 属 菌 の 定 型 的 な 生 化 学 的 性 状 を 示 したにもかかわらず いずれの 血 清 にも 凝 集 が 認 められないときは O 群 型 別 不 能 とし (6)に 示 す 生 化 学 的 性 状 試 験 を 実 施 する (7) 生 化 学 的 性 状 非 定 型 的 サルモネラ 属 菌 が 疑 われる 場 合 に(ア)から(オ)までに 示 した 生 化 学 的 性 状 試 験 を 実 施 する 市 販 の 同 定 用 キットの 使 用 も 可 能 である (ア)オキシダーゼ 試 験 :チトクロームオキシダーゼ 試 験 用 ろ 紙 に 菌 を 塗 布 して

1 分 間 以 内 に 深 青 色 になれば 陽 性 とする (イ)クエン 酸 利 用 能 試 験 :シモンズクエン 酸 ナトリウム 培 地 に 菌 を 塗 抹 後 37 で22 時 間 ±2 時 間 培 養 する 培 地 が 深 青 色 になれば 陽 性 とする (ウ)VP 試 験 :VP 半 流 動 培 地 に 菌 を 穿 刺 し 37 で22 時 間 ±2 時 間 培 養 後 VP 用 試 薬 A 及 び Bを 滴 下 する 陽 性 の 時 は 数 分 後 に 試 薬 が 赤 色 となる 1 時 間 後 も 赤 色 とならなければ 陰 性 とする (エ)ONPG 試 験 :ONPGディスク1 枚 を 小 試 験 管 にとり 滅 菌 精 製 水 1 ml を 加 え る 新 鮮 培 養 菌 を1 白 金 耳 接 種 し 混 和 後 37 で18 時 間 ~24 時 間 培 養 し 液 色 で 判 定 する( 早 いものは1 時 間 ~2 時 間 で 判 定 可 能 ) 液 色 が 黄 色 と なったものを 陽 性 とする 液 色 が 変 化 しないものは 陰 性 である (オ)マロン 酸 利 用 能 試 験 :マロン 酸 塩 培 地 に 新 鮮 培 養 菌 を 白 金 線 で 接 種 し 37 で 24 時 間 ~48 時 間 培 養 して 判 定 する 液 色 が 明 らかに 青 色 となったものを 陽 性 とし 緑 色 に 留 まるものを 陰 性 と 判 定 する 注 :サルモネラ 属 菌 はオキシダーゼ 陰 性 クエン 酸 利 用 能 陽 性 VP 陰 性 ONPG 陰 性 である マロン 酸 利 用 能 では ほとんどのサルモネラ 属 菌 は 陰 性 であるが subspecies salamae,arizonae 及 び diarizonae では 陽 性 であるので 注 意 を 要 する 非 定 型 的 サルモネラ 属 菌 が 疑 われ 生 化 学 的 性 状 試 験 を 実 施 してもなお 判 断 が 難 しい 場 合 は 国 立 医 薬 品 食 品 衛 生 研 究 所 又 は 国 立 感 染 症 研 究 所 に 照 会 すること (8) 記 載 1 サルモネラ 属 菌 陽 性 の 際 は 陽 性 /25 gとし O 群 又 はO 群 型 別 不 能 まで 記 載 する 2 非 定 型 的 サルモネラ 属 菌 の 際 も 同 様 に O 群 まで 記 載 するとともに どの 性 状 が 異 なっていたかを 記 入 する

5.フローチャート サルモネラ 属 菌 試 験 法 試 料 25 g BPW 225 ml 培 養 37 で22 時 間 ±2 時 間 0.1 ml 1.0 ml RV 10 ml TT 10 ml 培 養 42 で22 時 間 ±2 時 間 H 2 S 産 生 により 判 定 する 培 地 H 2 S 産 生 によら ず 判 定 する 培 地 H 2 S 産 生 により 判 定 する 培 地 H 2 S 産 生 によら ず 判 定 する 培 地 MLCB DHL XLD BGS CHS ESII SM2 MLCB DHL XLD BGS CHS ESII SM2 培 養 37 で22 時 間 ±2 時 間 定 型 集 落 を 各 培 地 から3 個 ずつ 釣 菌 して TSIとLIMに 接 種 培 養 37 で22 時 間 ±2 時 間 サルモネラ 診 断 用 血 清 でO 抗 原 の 群 別 結 果 判 定 : 凝 集 が 認 められたものを 陽 性 と 判 定 ただし 非 定 型 的 なサルモネラ 属 菌 が 疑 われる 場 合 には 生 化 学 的 性 状 試 験 を 実 施 すること

6. 培 地 組 成 ( 参 考 例 ) 及 び 作 製 方 法 (1) 緩 衝 ペプトン 水 (Buffered peptone water: BPW) 組 成 :1,000 ml 当 たり カゼイン 酵 素 分 解 産 物 10.0 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g リン 酸 二 水 素 カリウム 1.5 g リン 酸 水 素 二 ナトリウム (12 水 和 物 ) 9.0 g 精 製 水 1,000 ml オートクレーブ 滅 菌 121 15 分 間 ph 7.0±0.2 リン 酸 塩 は 無 水 物 や 複 数 の 水 和 物 が 存 在 するため 異 なった 水 和 物 等 を 用 いる 場 合 はその 分 子 量 に 合 わせて 必 ず 重 量 補 正 を 行 うこと (2)ラパポート-バシリアディス 液 体 培 地 (Rappaport-Vassiliadis: RV) 組 成 :1,000 ml 当 たり ソイペプトン 5.0 g 塩 化 ナトリウム 8.0 g リン 酸 二 水 素 カリウム (KH 2 PO 4 ) 1.4 g リン 酸 水 素 二 カリウム(K 2 HPO 4 ) 0.2 g 塩 化 マグネシウム 六 水 和 物 (MgCl 2 6H 2 O) 40.0 g マラカイトグリーン 0.04 g 精 製 水 1,000 ml オートクレーブ 115 15 分 間 ph 5.2±0.2 (3)テトラチオネート 液 体 培 地 (Tetrathionate USA: TT) 組 成 :1,000 ml 当 たり カゼイン 酵 素 分 解 産 物 2.5 g 肉 酵 素 分 解 産 物 2.5 g 胆 汁 酸 塩 1.0 g 炭 酸 カルシウム 10.0 g チオ 硫 酸 ナトリウム 30.0 g 精 製 水 1,000 ml ph 8.0±0.2 沸 騰 するまで 混 和 加 熱 する この 基 礎 培 地 は4 で 数 週 間 保 存 可 能 である この 溶 液 を 45 以 下 に 冷 却 後 1,000 mlに 対 して 下 記 に 示 すヨウ 素 溶 液 20 ml を 添 加 した 後 混 和 する よく 混 和 しながら 10 ml ずつ 滅 菌 した 試 験 管 に 分 注

する ヨウ 素 溶 液 を 添 加 した 後 は 直 ちに 使 用 する ヨウ 素 溶 液 組 成 ヨウ 素 6.0 g ヨウ 化 カリウム 5.0 g 精 製 水 20 ml 硫 化 水 素 産 生 により 判 定 する 分 離 寒 天 平 板 培 地 (4)MLCB 組 成 :1,000 ml 当 たり 酵 母 エキス 5.0 g ペプトン 10.0 g ハートエキス 末 2.0 g 塩 化 ナトリウム 4.0 g マンニット 3.0 g L-リジン 塩 酸 塩 5.0 g チオ 硫 酸 ナトリウム 4.0 g クエン 酸 鉄 アンモニウム 1.0 g ブリリアントグリーン 0.0125 g クリスタルバイオレット 0.01 g 寒 天 15.0 g 精 製 水 1,000 ml ph 6.8±0.2 加 温 溶 解 後 シャーレに 約 20 mlずつ 分 注 し 平 板 とする (5)DHL 組 成 :1,000 ml 当 たり 肉 エキス ペプトン 乳 糖 白 糖 デオキシコール 酸 ナトリウム チオ 硫 酸 ナトリウム クエン 酸 ナトリウム クエン 酸 鉄 アンモニウム 中 性 紅 寒 天 3.0 g 20.0 g 10.0 g 10.0 g 1.0 g 2.3 g 1.0 g 1.0 g 0.03 g 15.0 g

精 製 水 1,000 ml ph 7.4±0.2 加 温 溶 解 後 シャーレに 約 20 mlずつ 分 注 し 平 板 とする (6)XLD 組 成 :1,000 ml 当 たり 酵 母 エキス 3.0 g L-リジン 塩 酸 塩 5.0 g キシロース 3.75 g 乳 糖 7.5 g 白 糖 7.5 g デオキシコール 酸 ナトリウム 1.0 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g チオ 硫 酸 ナトリウム 6.8 g クエン 酸 第 二 鉄 アンモニウム 0.8 g フェノールレッド 0.08 g 寒 天 12.5 g 精 製 水 1,000 ml ph 7.4±0.2 加 温 溶 解 後 シャーレに 約 20 ml ずつ 分 注 し 平 板 とする 硫 化 水 素 産 生 によらずサルモネラ 属 菌 を 判 定 する 分 離 寒 天 平 板 培 地 (7)BGS BGA(ブリリアントグリーン 寒 天 培 地 ) 組 成 :1,000 ml 当 たり プロテオース ペプトン 10.0 g 酵 母 エキス 3.0 g 乳 糖 10.0 g 白 糖 10.0 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g フェノールレッド 0.08 g ブリリアントグリーン 0.0125 g 寒 天 12.0 g 精 製 水 1,000 ml ph 6.9±0.2 上 記 BGAをオートクレーブ 滅 菌 121 で15 分 間 後 液 温 を 約 70 に 下 げ その 温 度 に 保 って 下 記 のスルファピリジン 溶 液 を 添 加 し 混 和 する 培 地 の

温 度 が 60 以 下 の 場 合 では 結 晶 が 析 出 するので 注 意 する 混 和 後 溶 液 温 度 を 60 前 後 に 冷 却 し シャーレに 約 20 mlずつ 分 注 し 平 板 とする スルファピリジン 溶 液 の 作 製 方 法 ジメチルホルムアミド2 ml にスルファピリジン1 gを 加 えて 溶 解 する (8)CHS(クロモアガーサルモネラ) 組 成 :1,000 ml 当 たり ペプトン 5.0 g 酵 母 エキス 2.0 g 塩 化 ナトリウム 0.8 g その 他 塩 類 7.2 g 選 択 剤 と 色 素 混 合 物 4.9 g 寒 天 15.0 g 精 製 水 1,000 ml ph 7.6±0.2 加 温 溶 解 後 シャーレに 約 20 mlずつ 分 注 し 平 板 とする (9)ESII (ES サルモネラ 寒 天 培 地 II) 組 成 :1,000 ml 当 たり ペプトン 10.0 g 酵 母 エキス 1.0 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g リン 酸 水 素 二 ナトリウム 1.0 g チオ 硫 酸 ナトリウム 1.0 g デオキシコール 酸 ナトリウム 1.0 g マンニット 15.0 g 中 性 紅 0.03 g 合 成 酵 素 基 質 0.45 g ノボビオシン 0.02 g 寒 天 15.0 g 精 製 水 1,000 ml ph 7.4±0.2 オートクレーブ 滅 菌 121 で15 分 間 滅 菌 後 シャーレに 約 20 mlずつ 分 注 し 平 板 とする

(10)SM2 (chromid Salmonella Agar) 組 成 :1,000 ml 当 たり ペプトン 6.25 g トリス 0.16 g 乳 糖 6.0 g 胆 汁 酸 塩 1.5 g 発 色 基 質 混 合 物 0.03 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g 選 択 剤 混 合 物 0.03 g 寒 天 14.0 g 精 製 水 1,000 ml ph 7.3 組 成 は 上 記 のとおりだが 生 培 地 以 外 では 販 売 していない (11)TSI LIM インドール 試 薬 や 生 化 学 的 性 状 試 験 に 使 用 する 試 薬 についてはサルモ ネラ 属 菌 確 認 にのみ 用 いるものではないので 製 品 情 報 に 従 って 作 製 し 用 いるこ と

( 別 添 2) 黄 色 ブドウ 球 菌 試 験 法 1. 試 験 の 概 要 試 験 試 料 25 g を 秤 量 し 緩 衝 ペプトン 水 (BPW)225 ml を 加 えて 均 質 化 し BPW を 用 い 10 倍 階 段 希 釈 液 を 作 製 する その0.1 mlをそれぞれ2 枚 の 選 択 分 離 平 板 培 地 に 塗 抹 培 養 し 黄 色 ブドウ 球 菌 と 疑 われる 典 型 的 な 集 落 を 計 数 する 試 料 1 g 当 たりの 菌 数 を 選 択 分 離 培 地 上 の 集 落 数 と 希 釈 値 から 算 出 する 試 験 法 は 選 択 分 離 培 地 としてISO 6888-1にあるベアード パーカー(Baird-Parker) 寒 天 培 地 を 用 いる なお わが 国 で 従 来 から 広 く 行 われている3 % 卵 黄 加 マンニット 食 塩 寒 天 培 地 による 試 験 法 は 実 績 信 頼 性 の 上 から 否 定 されるものではなく 同 等 に 扱 われるべきものとし Baird-Parker 寒 天 培 地 の 代 替 培 地 として 用 いることができる 黄 色 ブドウ 球 菌 と 疑 われる 集 落 は 純 培 養 を 行 った 後 コアグラーゼ 試 験 等 で 性 状 を 確 認 し 同 定 する 本 試 験 法 は ISO 6888-1:1999と 妥 当 性 確 認 を 行 った 試 験 法 である 2. 使 用 機 器 装 置 (1) 乾 熱 滅 菌 器 オートクレーブ (2)ふらん 器 (37 ±1 ) (3) 寒 天 平 板 用 乾 燥 器 又 はふらん 器 (25 ~50 ) (4) 恒 温 水 槽 (37 ±1 ) (5)pH 計 (6) 秤 量 器 (7)メスシリンダー (8) 除 菌 フィルター(0.22 μm) (9)ストマッカー ストマッキング 袋 (10) 滅 菌 ハサミ ピンセット (11) 試 験 管 ( 小 中 ) 試 験 管 立 て (12) 三 角 フラスコ (13) 滅 菌 シャーレ( 直 径 90 mm~100 mm) (14) 白 金 耳 パスツールピペット (15) 滅 菌 ピペット(1 ml 2 ml 10 ml) (16) 滅 菌 コンラージ 棒 (スプレッダー) 3. 希 釈 液 培 地 及 び 試 薬 (1) 希 釈 液 緩 衝 ペプトン 水 Buffered peptone water (BPW) 市 販 のBPW を 使 用 する

(2)Baird-Parker 寒 天 培 地 1 基 礎 培 地 市 販 品 を 使 用 する 2 亜 テルル 酸 カリウム 溶 液 Potassium tellurite solution 自 家 調 製 又 は 市 販 品 3.5 % 溶 液 を 使 用 する 3 卵 黄 液 Egg yolk emulsion 自 家 調 製 20 % 溶 液 又 は 市 販 品 30 % 溶 液 を 使 用 する 4 培 地 調 製 基 礎 培 地 を 121 で 15 分 間 オートクレーブした 後 約 50 に 保 温 する 亜 テ ルル 酸 カリウム 溶 液 及 び 卵 黄 液 を 加 え 培 地 の 厚 さが4 mmより 厚 くなるように 滅 菌 シャーレに 分 注 する( 市 販 の 90 mm シャーレでは 約 20 ml 分 注 する ) 4 で24 時 間 まで 保 存 が 可 能 である 使 用 前 に 平 板 表 面 を 乾 燥 させる(25 ~50 培 地 表 面 の 水 滴 が 消 えるまで) (3)3 % 卵 黄 加 マンニット 食 塩 寒 天 培 地 1 基 礎 培 地 本 試 験 では 市 販 品 を 使 用 する 基 礎 培 地 量 は1,000 ml 分 を 900 mlに 調 整 する 2 培 地 調 製 基 礎 培 地 を 121 で 15 分 間 オートクレーブした 後 30 % 卵 黄 液 を 100 ml 加 えて 混 合 し 滅 菌 シャーレに 分 注 し 固 めた 後 乾 燥 して 用 いる 卵 黄 液 の 濃 度 が 異 なる 場 合 は 終 濃 度 が3 % となるよう 調 製 する (4) 非 選 択 平 板 培 地 本 試 験 では 市 販 のトリプトケースソイ 寒 天 (TSA) 培 地 を 用 いる (5)コアグラーゼ 試 験 用 ブレインハートインヒュージョンブイヨン(BHI) 市 販 品 を 用 いる (6)コアグラーゼ 試 験 用 ウサギ 血 漿 市 販 品 を 用 いる 4. 試 験 手 順 ( 図 1) (1) 検 体 の 調 製 1 1 検 体 当 たり 約 100 g を 採 取 する 検 体 は 原 則 として 容 器 包 装 のまま 採 取 す る ただし ハム 等 のように 1 包 装 単 位 が1 kg 以 上 に 及 ぶものは 切 断 して 採 取 する この 場 合 滅 菌 した 器 具 及 び 容 器 を 用 い 汚 染 の 起 こらぬよう 検 体 を 採 取 すること また 切 断 面 で 微 生 物 が 増 殖 したり 包 装 内 面 を 伝 わって 断 面 部 か ら 微 生 物 が 内 部 に 侵 入 しないように 保 管 法 にも 注 意 すること 2 採 取 した 検 体 の 運 搬 は 保 冷 容 器 を 用 い 氷 等 で4 以 下 に 検 体 を 保 ち 速 や かに 検 査 に 供 することができるよう 運 搬 すること なお 冷 凍 状 態 のものは ド

ライアイス 等 で 凍 結 しつつ 運 搬 すること 3 微 生 物 試 験 に 供 する 試 料 の 調 製 は 製 品 (スライスハム 等 細 切 された 製 品 を 除 く )の 切 断 すべき 表 面 をアルコール 綿 でよくふいた 後 滅 菌 した 器 具 を 用 いて 無 菌 的 に 切 断 し その 断 面 の 中 央 部 から25 gを 無 菌 的 に 採 り 試 料 とする スライスハム 等 細 切 された 製 品 にあっては 滅 菌 した 器 具 を 用 いて25 gを 無 菌 的 に 切 断 して 採 り 試 料 とする 4 試 料 をストマッカー 袋 に 入 れ BPW 225 ml を 加 え 1 分 間 ストマッキング 処 理 を 行 う 得 られた 懸 濁 液 を 10 倍 乳 剤 として 菌 分 離 に 用 いる 基 準 適 合 性 を 判 定 す る 場 合 は 10 倍 乳 剤 で 行 う なお 10 倍 乳 剤 の 10 倍 階 段 希 釈 液 (100 倍 1,000 倍 )を 作 製 し 計 数 を 行 うことにより 更 に 高 い 菌 数 を 測 定 することができる (2) 菌 選 択 分 離 試 験 1 Baird-Parker 寒 天 培 地 法 検 体 各 希 釈 につき 0.1 ml ずつ それぞれ2 枚 の Baird-Parker 寒 天 培 地 に 接 種 し コンラージ 棒 を 用 いてシャーレ 側 面 には 触 れないよう 塗 抹 する 15 分 間 乾 燥 させた 後 平 板 を 逆 さにして 培 養 する 37 で48 時 間 ±2 時 間 培 養 する 途 中 37 で22 時 間 ±2 時 間 にて 観 察 定 型 集 落 があればシャーレ 裏 面 にマークして おく 定 型 集 落 とは 周 囲 に 透 明 帯 が 存 在 する 黒 又 は 灰 色 で 光 沢 のある 隆 起 した 円 形 集 落 を 指 す 集 落 の 大 きさは 22 時 間 ±2 時 間 培 養 では 約 1 mm~ 1.5 mm 48 時 間 ±2 時 間 培 養 では 約 1.5 mm~2.5 mmである 培 養 22 時 間 ±2 時 間 以 降 では 透 明 帯 の 内 側 で 集 落 の 周 囲 に 直 に 白 濁 帯 が 観 察 される 非 定 型 集 落 は 透 明 帯 や 白 濁 帯 がきわめて 小 さいか 確 認 し 難 いもので 乳 製 品 エビ 類 内 臓 肉 の 試 験 では 注 意 が 必 要 である 2 3 % 卵 黄 加 マンニット 食 塩 寒 天 培 地 法 (Baird-Parker 寒 天 培 地 の 代 替 培 地 とし て 用 いることができる ) Baird-Parker 寒 天 培 地 法 と 同 様 検 体 各 希 釈 につき 0.1 ml ずつそれぞれ2 枚 の 平 板 に 接 種 塗 抹 し 37 で 48 時 間 ±2 時 間 培 養 する 途 中 37 で 22 時 間 ±2 時 間 にて 観 察 黄 色 ブドウ 球 菌 と 疑 われる 集 落 があればシャーレ 裏 面 にマ ークしておく 黄 色 ブドウ 球 菌 と 疑 われる 集 落 とは 黄 色 で 集 落 周 囲 に 卵 黄 反 応 による 白 濁 帯 がみられる 光 沢 のある 隆 起 した 直 径 約 1 mm~2 mm の 集 落 を 指 す 卵 黄 反 応 の 弱 い 集 落 についてもコアグラーゼ 試 験 で 確 認 する (3) 確 認 試 験 1 純 培 養 選 択 分 離 培 地 上 に 発 育 した 黄 色 ブドウ 球 菌 と 疑 われる 集 落 を1 平 板 につき2 個 ~5 個 釣 菌 し 非 選 択 性 のトリプトケースソイ 寒 天 (TSA) 培 地 に 塗 抹 純 培 養 を

行 う 37 で22 時 間 ±2 時 間 培 養 する 2 同 定 グラム 染 色 単 離 した 集 落 でグラム 染 色 を 実 施 する グラム 陽 性 の 球 菌 である コアグラーゼ 試 験 試 験 管 法 によるコアグラーゼ 試 験 ( 図 2)は 純 培 養 した 集 落 を 釣 菌 し 2 ml~3 ml のブレインハートインヒュージョンブイヨン(BHI)の 入 った 小 試 験 管 に 懸 濁 し 37 で22 時 間 ±2 時 間 培 養 する 同 時 に 懸 濁 液 の 一 部 を 非 選 択 平 板 培 地 に 培 養 し コアグラーゼ 再 試 験 用 および 菌 株 保 存 用 とする 次 に BHI 培 養 液 が 0.2 ml~0.3 ml 入 った 試 験 管 にウサギ 血 漿 0.5 ml を 加 え 軽 く 混 和 して 37 の 恒 温 水 槽 (ふらん 器 でも 代 替 可 能 である )で 22 時 間 ±2 時 間 まで 観 察 しながら 培 養 する 観 察 は 培 養 後 1 時 間 間 隔 で4 時 間 ~6 時 間 まで 血 漿 凝 固 の 有 無 を 調 べ 完 全 凝 固 ( 全 体 がゼリー 状 となる ) 又 は 部 分 凝 固 ( 一 部 がゼリー 状 となる ) した 時 点 で 陽 性 と 判 定 する なお 観 察 時 に 試 験 管 を 強 く 振 らないことに 注 意 すること 陰 性 のものは22 時 間 ±2 時 間 まで 培 養 して 判 定 する 疑 わしい 反 応 が 出 た 場 合 は 非 選 択 平 板 培 地 に 増 殖 させた 菌 を 用 いて 再 試 験 を 行 う Baird-Parker 寒 天 培 地 上 で 定 型 集 落 を 形 成 し グラム 陽 性 球 菌 で コアグ ラーゼ 陽 性 であれば 黄 色 ブドウ 球 菌 と 同 定 する 3 % 卵 黄 加 マンニット 食 塩 寒 天 培 地 についても 同 様 に 黄 色 ブドウ 球 菌 と 疑 われる 集 落 を 形 成 し グラム 陽 性 球 菌 で コアグラーゼ 陽 性 であれば 黄 色 ブドウ 球 菌 と 同 定 する 市 販 の 乾 燥 ウサギ 血 漿 用 いる 場 合 は 添 付 の 仕 様 書 に 従 ってコアグラー ゼ 試 験 を 行 っても 良 い ウサギ 血 漿 を 自 家 調 製 する 場 合 は 黄 色 ブドウ 球 菌 株 を 用 いて 凝 集 を 確 認 したものを 用 いること (4) 菌 数 測 定 平 板 上 に 形 成 された 集 落 数 から 希 釈 倍 数 を 考 慮 して 黄 色 ブドウ 球 菌 菌 数 を 算 出 する 基 準 適 合 性 は 10 倍 乳 剤 を 接 種 した2 枚 の 寒 天 平 板 上 に 得 られた 黄 色 ブド ウ 球 菌 の 全 集 落 数 により 判 定 する

図 1 黄 色 ブドウ 球 菌 の 試 験 法 直 接 平 板 培 養 法 試 料 25 g 緩 衝 ペプトン 水 225 mlに 入 れストマッキング 処 理 (1 分 間 ) 10 倍 乳 剤 及 び 必 要 に 応 じてその 10 倍 階 段 希 釈 液 作 製 (100 倍 1,000 倍 ) 検 体 各 希 釈 につき 0.1 mlをそれぞれ2 枚 の 選 択 分 離 培 地 に 塗 抹 する 選 択 分 離 培 地 ( 菌 数 測 定 ) Baird-Parker 培 地 ( 卵 黄 加 マンニット 食 塩 寒 天 培 地 でも 代 替 可 能 ) 37 で48 時 間 ±2 時 間 培 養 疑 わしい 集 落 1 平 板 につき 集 落 2 個 ~5 個 を 釣 菌 純 培 養 非 選 択 平 板 培 地 (TSA 培 地 )に 塗 抹 37 で22 時 間 ±2 時 間 培 養 同 定 グラム 染 色 試 験 管 法 によるコアグラーゼ 試 験 ( 図 2) 菌 数 測 定 検 体 試 料 1 g 当 たりの 菌 数 を 選 択 分 離 培 地 上 の 集 落 数 と 希 釈 値 から 算 出 する

図 2 試 験 管 法 によるコアグラーゼ 試 験 疑 わしい 集 落 1 平 板 につき 集 落 2 個 ~5 個 を 釣 菌 純 培 養 非 選 択 平 板 培 地 (TSA)に 塗 抹 37 で22 時 間 ±2 時 間 純 培 養 した 集 落 を 釣 菌 2 ml~3 mlのbhi broth を 入 れた 小 試 験 管 に 懸 濁 37 で22 時 間 ±2 時 間 懸 濁 液 の1 白 金 耳 量 を 非 選 択 平 板 培 地 に 斜 面 又 は 画 線 培 養 (コアグラーゼ 再 試 験 用 及 び 菌 株 保 存 用 ) 培 養 後 の 菌 液 0.2 ml~0.3 mlをウサギ 血 漿 0.5 ml に 加 える 37 の 恒 温 水 槽 又 はふらん 器 で4 時 間 ~24 時 間 培 養 しながら 観 察 完 全 凝 固 部 分 凝 固 の 有 無 を 確 認 コアグラーゼ 陽 性 と 判 定 する

希 釈 液 培 地 及 び 試 薬 の 組 成 と 調 製 1. 希 釈 液 緩 衝 ペプトン 水 Buffered peptone water (BPW) 組 成 カゼイン 酵 素 分 解 産 物 10.0 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g リン 酸 二 水 素 カリウム 1.5 g リン 酸 水 素 二 ナトリウム (12 水 和 物 ) 9.0 g 精 製 水 1,000 ml オートクレーブ 滅 菌 121 15 分 間 ph 7.0±0.2 リン 酸 塩 は 無 水 物 や 複 数 の 水 和 物 が 存 在 するため 異 なった 水 和 物 等 を 用 い る 場 合 はその 分 子 量 に 合 わせて 必 ず 重 量 補 正 を 行 うこと 2.Baird-Parker 寒 天 培 地 (1) 基 礎 培 地 組 成 カゼイン 膵 消 化 物 (Tryptone) 10.0 g 酵 母 エキス 1.0 g 肉 エキス 5.0 g ピルビン 酸 ナトリウム 10.0 g L-グリシン 12.0 g 塩 化 リチウム 5.0 g 寒 天 (ゲル 強 度 により) 12 g ~ 22 g 精 製 水 1,000 ml ph 7.2±0.2 (2) 亜 テルル 酸 カリウム 溶 液 (1 %) Potassium tellurite solution 組 成 K 2 TeO 3 1.0 g 精 製 水 100 ml 溶 解 ( 微 加 熱 可 ) 後 0.22 μm フィルターにてろ 過 滅 菌 4 で1ヶ 月 ま で 保 存 が 可 能 である (3) 卵 黄 液 (20 %~30 %)Egg yolk emulsion 新 鮮 な 卵 で 卵 殻 に 傷 のないものを 選 び 洗 剤 でブラシ 洗 浄 する 流 水 で 水 洗 後

70 %エタノールに30 秒 間 浸 漬 後 に 風 乾 するか 又 はエタノールを 噴 霧 後 に 火 炎 滅 菌 する 無 菌 的 に 割 卵 して 卵 白 を 除 去 する この 場 合 市 販 のステンレス 製 の 黄 身 取 り 器 を 滅 菌 して 使 用 すると 容 易 である 卵 黄 を 滅 菌 した 広 口 びん( 希 釈 びん 等 )に 入 れ 例 えば 20 % 卵 黄 液 の 場 合 4 倍 量 の 無 菌 精 製 水 を 加 え 滅 菌 ガラス 棒 を 用 い てエマルジョンを 作 製 する 保 存 する 場 合 は4 で 保 存 し 3 日 以 内 に 使 用 する 注 : 基 礎 培 地 に 卵 黄 液 を 加 えて 混 合 すると 泡 立 つが 市 販 のステンレス 製 連 続 分 注 器 を 使 用 すれば 平 板 作 製 時 に 泡 を 消 す 必 要 がなくなる (4)スルファメサジン(スルファジミジン) 溶 液 (0.2 %) Sulfamezathine (Sulfamethazine, Sulfadimidine) プロテウス (Proteus spp.) による 汚 染 がある 時 にのみ 使 用 が 可 能 である 組 成 スルファメサジン 0.2 g 0.1M 水 酸 化 ナトリウム 10 ml 精 製 水 90 ml 溶 解 後 0.22 μmフィルターにてろ 過 滅 菌 し 4 で1ヶ 月 まで 保 存 が 可 能 で ある (5) 培 地 調 製 組 成 基 礎 培 地 100 ml 亜 テルル 酸 溶 液 ( 最 終 濃 度 0.01 %)1.0 ml 卵 黄 液 (20 %) 5.0 ml (スルファメサジン 溶 液 2.5 ml) 基 礎 培 地 を 121 で 15 分 間 オートクレーブした 後 約 50 に 保 温 する 亜 テル ル 酸 カリウム 溶 液 卵 黄 液 を 加 え 滅 菌 シャーレに 培 地 の 厚 さが4 mm より 厚 くなる ように 分 注 する( 市 販 の 90 mm シャーレを 使 う 場 合 は 約 20 ml 分 注 する ) 組 成 中 に 市 販 の 30% 卵 黄 液 を 使 用 する 時 は 滅 菌 精 製 水 を 用 いて 所 定 濃 度 になるよう 調 整 す る 保 存 する 場 合 は4 で1 日 までとする( 自 家 調 製 の 場 合 は 培 地 性 能 が 低 下 しな いことを 確 認 した 期 間 内 であればこの 限 りでない) 使 用 前 に 平 板 表 面 を 乾 燥 させる (25 ~50 培 地 表 面 の 水 滴 が 消 えるまで) 市 販 生 培 地 の 使 用 が 可 能 である ただし 市 販 の 生 培 地 については 使 用 期 限 を 越 えないように 冷 蔵 で 保 存 する 3.3 % 卵 黄 加 マンニット 食 塩 寒 天 培 地 (Baird-Parker 寒 天 培 地 の 代 替 として 使 用 可 能 )

(1) 基 礎 培 地 組 成 肉 エキス 1 g ペプトン 10 g 塩 化 ナトリウム 75 g マンニット 10 g 寒 天 15 g フェノールレッド(0.2 % 溶 液 ) 12 ml 精 製 水 850 ml ph 7.4±0.2 (2) 培 地 調 製 基 礎 培 地 を 121 で 15 分 間 オートクレーブした 後 20 % 卵 黄 液 を 150 ml 加 え て 混 合 し 滅 菌 シャーレに 分 注 し 固 めた 後 乾 燥 して 用 いる 市 販 の 30 % 卵 黄 液 を 用 いる 際 は 基 礎 培 地 量 を 900 ml とし 卵 黄 液 100 ml を 添 加 する 市 販 生 培 地 の 使 用 が 可 能 である 4. コアグラーゼ 試 験 用 ウサギ 血 漿 ウサギ 血 漿 は 市 販 の 乾 燥 ウサギ 血 漿 を 仕 様 書 のとおり 希 釈 して 用 いる 新 鮮 なウサギ 血 漿 を3 % 倍 量 の 滅 菌 精 製 水 を 用 いて 希 釈 したものを 用 いてもよいが 凝 固 防 止 剤 に クエン 酸 塩 を 用 いた 場 合 は EDTA を 0.1 % 加 えること 自 家 調 製 する 場 合 は 既 知 の 黄 色 ブドウ 球 菌 株 を 用 いて 凝 集 を 確 認 したものを 用 いる