Clusters Passing Filterを 最 適 化 するには イルミナ 株 式 会 社 テクニカルアプリケーションサイエンティスト 田 中 敦 成 2012 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminadx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cbot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium, iselect, MiSeq, Nextera, Sentrix, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners.
Overview 1)%Cluster Passing Filter (%PF) の 定 義 2)%PFがシーケンスランにおいて 何 を 意 味 するのか 3)%PFをどのように 最 適 化 するか 2
%Clusters Passing Filter (%PF)とは? %Clusters Passing Filter (%PF)の 定 義 どのくらいの %PFが 得 られるのか %PFが 低 くなる 主 な 原 因 とその 診 断 方 法 %PFを 最 適 化 するには 3
%Clusters Passing Filter (%PF)とは? %Clusters Passing Filter (%PF)の 定 義 どのくらいの %PFが 得 られるのか %PFが 低 くなる 主 な 原 因 とその 診 断 方 法 %PFを 最 適 化 するには 4
%Clusters Passing Filter (%PF)とは? %PF = # clusters PF Density (k/mm 2 ) x100 Screenshot from SAV Summary tab 5
Quality Filter The Chastity Filter Chastity Filtering はクラスターの 純 度 を す 指 標 I A I B A C G T C I A I A I B Chastityの 計 算 式 6
Quality Filter The Chastity Filter Cluster signal 6 C Cのシグナルのみ Chastity = 1 純 度 が 高 いシグナル 0 0 0 A C G T 6/(6+0) = 1.0 Chastityの 計 算 式 7
Quality Filter The Chastity Filter Cluster signal 6 C 1.5 0 0 G A C G T 重 なるClusterからのシグナルを 拾 うが Chastityは0.8でありまだ 当 該 クラス ターのBase Callに 影 響 を 及 ぼさない 6/(6+1.5) = 0.8 Chastityの 計 算 式 8
Quality Filter The Chastity Filter Cluster signal 6 5 C G 0 0 A C G T 十 分 にクラスターが 重 なってしまうと クラスターのシグナルがどの 塩 基 由 来 で あるか 判 別 できない そこで25サイクルまでに 右 の 表 にあるよう にChastityの 値 が0.6 以 下 のサイクルが2つ 以 上 あった 場 合 Filterを 通 さない 6/(6+5) = 0.54 Chastityの 計 算 式 9
%Clusters Passing Filter (%PF)がシーケンスラン において 何 を 意 味 するのか? %PF = # cluster PF Density (k/mm 2 ) (x100)* o ラン 全 体 の 質 の1つの 指 標 となる o %PF 大 = データアウトプットが 増 加 10
11 どうすれば%Clusters Passing Filterを 知 ることができるか? Sequencing Analysis Viewer (SAV)
12 Summary Tab の 中 のどこに%Clusters Passing Filterがあるのか
Data By Laneのどこに Clusters Passing Filterがあるのか Box Plots Blue Green Raw Cluster Counts Clusters passing filter 13
%Clusters Passing Filter (%PF)の 定 義 どのくらいの %PFが 得 られるのか %PFが 低 くなる 主 な 原 因 とその 診 断 方 法 %PFを 最 適 化 するには 14
どのくらいの %Clusters Passing Filter が 得 られるのか PhiX コントロールDNAを 用 いて 推 奨 されているCluster Density 以 内 の クラスターを 作 成 した 場 合 % PF は80 以 上 15
%Clusters Passing Filter (%PF)の 定 義 どのくらいの %PFが 得 られるのか %PFが 低 くなる 主 な 原 因 とその 診 断 方 法 %PFを 最 適 化 するには 16
%Clusters Passing Filter に 影 響 を 与 える 要 因 - オーバークラスター - 塩 基 の 偏 り - Chemistry ( 装 置 もしくは 試 薬 の 問 題 ) 17
%Clusters Passing Filter に 影 響 を 与 える 要 因 - オーバークラスター - 塩 基 の 偏 り - Chemistry ( 装 置 もしくは 試 薬 の 問 題 ) 18
%Clusters Passing Filterが 低 くなる 主 な 原 因 と その 調 査 方 法 原 因 : オーバークラスター オーバークラスターの 診 断 方 法 1) Data by Lane 青 と 緑 のボックスプロットの 比 較 オーバークラスターしているフローセルのCluster densityは 実 際 よりも 低 い 数 値 となる 2) サムネイル 画 像 の 確 認 推 奨 最 大 cluster density/mm 2 MiSeq V2 試 薬 キット: 880-965k/mm 2 V3 試 薬 キット: 1200-1400k/mm 2 HiSeq2000 : 750-850k/mm 2 GAIIx: 700-800k/mm 2 19
%Clusters Passing Filterが 低 くなる 主 な 原 因 と その 調 査 方 法 原 因 : オーバークラスター 推 奨 最 大 cluster density/mm 2 MiSeq V2 試 薬 キット: 880-965k/mm 2 V3 試 薬 キット: 1200-1400k/mm 2 Box Plots Blue Gree n Raw Cluster Counts Cluster s Passin g filter C G クラスター 数 は 正 確 に 計 算 されているようだが 極 端 にPFが 低 い これはオーバークラスターを 示 唆 している 20
%Clusters Passing Filterが 低 くなる 主 な 原 因 と その 調 査 方 法 原 因 : オーバークラスター オーバークラスターの 診 断 方 法 1) Data by Lane 青 と 緑 のボックスプロットの 比 較 オーバークラスターしているフローセルのCluster densityは 実 際 よりも 低 い 数 値 となる 2) サムネイル 画 像 の 確 認 推 奨 最 大 cluster density/mm 2 MiSeq V2 試 薬 キット: 880-965k/mm 2 V3 試 薬 キット: 1200-1400k/mm 2 HiSeq2000 : 750-850k/mm 2 GAIIx: 700-800k/mm 2 21
Sequencing Analysis Viewer (SAV) 22
%Clusters Passing Filterが 低 くなる 主 な 原 因 と その 調 査 方 法 原 因 : オーバークラスター (650-750k/mm 2 MiSeq) 23
%Clusters Passing Filterが 低 くなる 主 な 原 因 と その 調 査 方 法 原 因 : オーバークラスター (700-800k/mm 2 MiSeq) 24
%Clusters Passing Filterが 低 くなる 主 な 原 因 と その 調 査 方 法 原 因 : オーバークラスター (>1.2M/mm 2 - MiSeq) 25
%Clusters Passing Filterが 低 くなる 主 な 原 因 と その 調 査 方 法 原 因 : オーバークラスター クラスターが 飽 和 している 状 態 26
%Clusters Passing Filter に 影 響 を 与 える 要 因 - オーバークラスター - 塩 基 の 偏 り - Chemistry ( 装 置 もしくは 試 薬 の 問 題 ) 27
%Clusters Passing Filterが 低 くなる 主 な 原 因 と その 調 査 方 法 原 因 : 塩 基 の 偏 り 塩 基 の 偏 りの 診 断 方 法 : サンプルの 偏 りについての 事 前 情 報 (カスタムバーコード アンプリコン 等 ) SAV: Data By Cycle (% base) AAGCTCAGGCT AAGCTCAGGCT AAGCTCAGGCT AAGCTCAGGCT AAGCTCAGGCT AAGCTCAGGCT AAGCTCAGGCT AAGCTCAGGCT AAGCTCAGGCT 28
%Clusters Passing Filterが 低 くなる 主 な 原 因 と その 調 査 方 法 塩 基 のバランスが 良 い 例 : PhiX 29
%Clusters Passing Filterが 低 くなる 主 な 原 因 と その 調 査 方 法 塩 基 に 偏 りがある 30
%Clusters Passing Filterが 低 くなる 主 な 原 因 と その 調 査 方 法 塩 基 に 偏 りがある なぜ 塩 基 の 偏 りがあると 問 題 なのか: - 近 接 したクラスターについて 考 えてみる High diversity Low diversity - 近 接 した 別 のクラスターから 発 せられるシグナルが 同 じ 蛍 光 のために 近 接 したクラスターを 別 のクラスターとして 区 別 することが 困 難 になってしまう 31
%Clusters Passing Filter に 影 響 を 与 える 要 因 - オーバークラスター - 塩 基 の 偏 り - Chemistry ( 装 置 もしくは 試 薬 の 問 題 ) 32
%Clusters Passing Filterが 低 くなる 主 な 原 因 と その 調 査 方 法 Chemistry ( 装 置 もしくは 試 薬 の 問 題 ) 装 置 に 問 題 がある 場 合 の 診 断 方 法 : Data By Cycle plot in SAV Intensity plotで 完 全 に 数 値 が 下 がってしまう 流 路 の 確 認 33
%Clusters Passing Filterが 低 くなる 主 な 原 因 と その 調 査 方 法 Chemistry ( 装 置 もしくは 試 薬 の 問 題 ) 症 状 : Q scoresが 低 くなる %PFが 低 くなる 試 薬 に 問 題 がありそうなときは - 使 用 期 限 を 確 認 する - 調 製 方 法 を 確 認 する - 保 存 温 度 を 確 認 する 34
%Clusters Passing Filter (%PF)の 定 義 どのくらいの %PFが 得 られるのか %PFが 低 くなる 主 な 原 因 とその 診 断 方 法 %PFを 最 適 化 するには 35
%Clusters Passing Filterを 最 適 化 するには Cluster densityを 最 適 化 する 定 量 が 重 要!! -qpcr (*often the preferred method) - 両 端 に 適 切 なアダプターが 付 いたライブラリーの みが 増 幅 する - サンプルに 似 た 性 質 を 持 つスタンダードを 使 用 す る *ライブラリーサイズがブロードな 場 合 はqPCRで 正 確 に 定 量 することができません 36
ライブラリの 定 量 法 UV- 吸 光 度 測 定 (ex. Nanodrop) DNA RNA 本 鎖 本 鎖 の 区 別 なく 核 酸 を 特 異 的 に 検 出 タンパク 等 がコンタミすると 測 定 値 が 幅 に 上 昇 する (DNA 量 を 過 評 価 する 恐 れがある) サンプル 調 製 開 始 時 および 完 成 したライブラリの 定 量 には 使 わない 危 険 Bioanalyzer 2100 定 量 の 正 確 性 はサンプルの 希 釈 とハンドリングによって きく 左 右 する ライブラリの 定 性 評 価 のみへの 使 を 推 奨 危 険 重 鎖 DNA 特 異 的 な 蛍 光 定 量 法 (ex. Qubit or PicoGreen) 重 鎖 DNAだけを 特 異 的 に 検 出 重 鎖 DNAであれば アダプター 分 も 検 出 する 要 注 意 定 量 PCR (qpcr) 完 全 な 構 造 のライブラリのみを 特 異 的 に 定 量 可 能 検 出 定 量 精 度 が 常 に い 安 全 37
%Clusters Passing Filterを 最 適 化 するには 塩 基 の 偏 りを 減 らす ライブラリーへのPhiXのスパイク インを 行 う * 注 意 : De novoの 実 験 やPhiXゲノムと 相 同 性 が 高 いライブラリーにはご 使 用 いただけません PhiX はバクテリオファージ 多 様 性 がありランダムな 配 列 約 45% GC と 55% ATを 含 む スモールゲノム アライメントやエラーレートの 評 価 ができる 明 確 な 定 義 リファレンスゲノムがしっかりと 注 釈 付 けされている イルミナのPhiX コントロールライブラリーはすぐに 使 用 できる アダプターが 結 合 している 濃 度 は10nM ( 目 的 の 濃 度 に 希 釈 して 使 用 ) 38
%PFを 最 適 化 するには 塩 基 の 偏 りを 減 らす PhiX % どのくらいの PhiXが 必 要 か? 塩 基 の 偏 り 目 的 サンプルのリード 数 -アウトプットとデータの 質 のバランスが 重 要 - 経 験 的 に 決 める 必 要 がある! イルミナサポートウェビナー 2013/04/19 塩 基 に 偏 りのある 配 列 をMiSeqでシーケンスするには http://www.illuminakk.co.jp/events/webinar_japan.ilmn?ws=ss イルミナサポートウェビナー 2013/03/22 PhiXを 使 用 してRun Qualityを 改 善 する http://www.illuminakk.co.jp/events/webinar_japan.ilmn?ws=ss 39
%PFを 最 適 化 するには 流 路 の 状 態 を 最 適 にするには HiSeqのランを 始 める 前 に 確 認 すること: - メンテナンスウォッシュ 時 の 廃 液 量 - prime volume HiSeqのラン 後 に 確 認 すること: -25サイクル 目 に 算 出 される%PFとQ scores 試 薬 の 適 切 な 保 存 方 法 と 手 順 を 確 認 する 40
Summary %PFが 低 くなる 主 な 原 因 1) オーバークラスター 2) 塩 基 に 偏 りがある 3) Chemistry ( 装 置 もしくは 試 薬 ) %PFの 最 適 化 に 有 効 な 手 段 1) Cluster densityの 最 適 化 2) 塩 基 の 偏 りを 減 らす 3) 流 路 の 状 態 を 最 適 にする 41
42 Questions?