Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2.0

研 究 用 Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2.0 説 明 書 v201509da

Random Primer DNA ラベリングキットは ハイブリダイゼーションに 用 いる DNA を [α- 32 P] [ 3 H] dctp を 用 いてラベルし DNA プローブを 作 製 するためのキットです A. P. Feinberg と B. Vogelstein の 方 法 1 ) 2 ) に 改 良 を 加 えたもので 簡 単 な 操 作 で 高 比 放 射 活 性 の DNA プローブが 得 られます また 本 キットでは 遺 伝 子 工 学 的 に 3' 5' exonuclease 活 性 の 欠 失 した Exofree Klenow Fragment 3) と 9 mer の Random Primer を 用 いています このために 1 10 9 dpm/μg の 高 比 活 性 プローブを 短 時 間 (10 分 以 内 )で 得 ることができます I. キットの 内 容 (30 回 分 ) 1. Random Primer(9 mer) 60 μl 2. 10 Buffer 75 μl 3. dntp Mixture 75 μl 各 0.2 mm dgtp datp dttp 4. Exo-free Klenow Fragment(2 U/μl) 30 μl 5. Control DNA 10 μl λ-dna Hind III Fragment(25 ng/μl) キット 以 外 に 必 要 な 試 薬 蒸 留 水 TE Buffer(10 mm Tris-HCl(pH8.0) 1 mm EDTA) 標 識 dctp 水 溶 液 こ の キ ッ ト は PerkinElmer 社 Code No. NEG513H の[α- 32 P]dCTP (111 TBq/mmol 370 MBq/ml) 水 溶 液 の 使 用 を 標 準 として 組 み 立 て られていますが [ 3 H]dCTP も 使 用 できます II. 保 存 - 20 III. 原 理 ハイブリダイゼーション 法 により DNA 中 に 存 在 する 特 異 的 配 列 を 検 出 する 際 には 非 常 に 高 い 比 放 射 活 性 を 持 つ DNA をプローブとして 用 います この DNA プローブ 作 製 の 為 に 用 いられる DNA 標 識 法 としては 従 来 はニックトランス レーション 法 が 用 いられていましたが このニックトランスレーション 法 には 次 のよう な 欠 点 があることが 知 られています 1. 放 射 性 物 質 の 取 り 込 み 率 が 比 較 的 低 い 2. 長 時 間 の 反 応 を 行 うと DNA ポリメラーゼ I のエキソヌクレアーゼ 活 性 により 既 に 取 り 込 まれた 放 射 性 物 質 が 遊 離 し 取 り 込 み 率 が 低 下 する 3. 鋳 型 となる DNA が 高 純 度 であることが 必 要 である 4. 反 応 後 に 未 反 応 の 放 射 性 dntp を 除 去 する 必 要 がある 1983 年 に A. P. Feinberg と B. Vogelstein により 発 表 されたランダムプライマーと Exofree Klenow Fragment を 用 いて DNA の 標 識 を 行 う 方 法 は これらの 欠 点 をもたない DNA 標 識 法 です( 表 1) その 原 理 を 図 1. に 示 しました 本 キットでは 鋳 型 DNA を 熱 変 性 に より 一 本 鎖 DNA とし この 一 本 鎖 DNA に 対 し 9 mer のランダムプライマーをアニール させた 後 Exo-free Klenow Fragment を 用 いて 相 補 鎖 合 成 を 行 います この 時 [α- 32 P] [ 3 H] などの 標 識 化 合 物 を 用 いると 合 成 される 相 補 鎖 が 標 識 されます この 相 補 鎖 は 熱 変 性 により 一 本 鎖 とし ハイブリダイゼーションプローブとして 用 いることができます タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 2

表 1 ニックトランスレーション 法 ランダムプライマー DNA ラベリング 法 反 応 時 間 および 反 応 モニター 長 時 間 の 反 応 により 取 り 込 み 率 が 低 下 する このため 反 応 モニターを 行 い 取 り 込 み 率 を 測 定 する 必 要 がある 短 時 間 で 高 比 活 性 プローブが 得 られる また 長 時 間 の 反 応 を 行 っても 取 り 込 み 率 は 低 下 しない プローブの 比 活 性 10 8 dpm/μg 10 9 dpm/μg 鋳 型 DNA 中 の 不 純 物 の 影 響 アガロース 等 の 混 入 によって 反 応 が 阻 害 される アガロース 等 の 混 入 によって ほとんど 阻 害 されない 鋳 型 DNA 1 μg 程 度 25 ng 反 応 後 の 処 理 ゲル 濾 過 による 未 反 応 dntp の 除 去 が 必 要 反 応 液 から 未 反 応 dntp の 除 去 をすることなくハイブリダ イゼーションに 用 いることが できる プローブ 作 製 の 鋳 型 となる DNA 断 片 熱 変 性 95 で 3 分 間 加 熱 後 急 冷 することにより 鋳 型 DNA を 一 本 鎖 とする ランダムプライマー(9 mer) dntp + [α- 32 P] dctp + Exo-free Klenow 酵 素 ( 標 識 dctp) 熱 変 性 標 識 DNA 鎖 95 で 3 分 間 加 熱 後 急 冷 することにより 合 成 された 相 補 鎖 ( 標 識 DNA 鎖 )を 一 本 鎖 DNA として 鋳 型 DNA より 解 離 さ せる 鋳 型 DNA 標 識 DNA(DNA プローブ) ハイブリダイゼーションに 用 いる 図 1.ランダムプライマー DNA ラベリングの 原 理 タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 3

IV. 操 作 1. マイクロチューブ(エッペンドルフ 型 ポリプロピレン 製 )に 次 の 反 応 液 を 調 製 する 95 で 3 分 間 加 熱 した 後 氷 中 で 急 冷 し 5 分 間 放 置 する 鋳 型 DNA *1 Random Primer 蒸 留 水 (または TE Buffer) 10 ng ~ 1 μg 2 μl up to 14 μl 2. 10 Buffer dntp Mixture を 各 2.5 μl 標 識 dctp *2 (1.85 MBq 50 μci)を 5 μl 加 える 3.Exo-free Klenow Fragment 1 μl を 加 え 37 で 10 分 間 *3 保 温 する 4. 65 で 5 分 間 加 熱 し 酵 素 を 失 活 させる (または EDTA を 最 終 濃 度 が 30 mm になる ように 加 える ) 5. 95 で 3 分 間 加 熱 した 後 氷 中 で 急 冷 する 6. そのまま 適 量 をハイブリダイゼーションプローブ 液 として 用 いる 必 要 ならば NucleoSpin Gel and PCR Clean-up( 製 品 コード 740609.10/.50/.250) ゲ ル 濾 過 あるいはエタノール 沈 殿 で 未 反 応 の 標 識 dctp を 除 去 して 下 さい * 1: 鋳 型 DNA の 長 さは 300 bp 以 上 が 適 しています 300 bp 以 下 のフラグメントのラ ベリングには 末 端 を 標 識 する MEGALABEL ( 製 品 コード 6070)の 使 用 をお 勧 めします このキットでは アガロースを 除 かずに 低 融 点 アガロースゲル 中 の DNA を 反 応 に 使 用 することも 可 能 です (この 場 合 の アガロースには PrimeGel Agarose LMT 1-20K GAT( 製 品 コード 5806A)や PrimeGel Agarose LMT PCR-Sieve GAT( 製 品 コード 5815A)が 適 しています ) 手 順 は 次 の 通 り 行 ってください (1)アガロースゲル 電 気 泳 動 を 行 い 目 的 とする 断 片 を 含 むアガロースゲル 片 を 切 り 出 す (2)ゲル 片 の 重 量 の 3 倍 量 の 蒸 留 水 を 加 える (3)65 でアガロースを 溶 解 させる (4)DNA 25 ng 分 の 溶 液 を そのまま 鋳 型 DNA として 反 応 に 用 いる * 2:このキットは [α- 32 P] dctp(111 TBq/mmol 370 MBq/ml)を 用 いて 標 識 するよう に 組 み 立 てられていますが [ 3 H] 標 識 の dctp も 同 様 に 使 用 できます 比 活 性 の 異 なる [α- 32 P] dctp あるいは [ 3 H] dctp を 使 用 する 場 合 は 反 応 溶 液 中 の dctp の 濃 度 が 変 化 しないように 標 識 dctp の 量 を 調 節 してください また 放 射 性 datp を 用 いて 標 識 を 行 う 時 には dntp 混 合 液 として dgtp dctp dttp 各 0.2 mm の 溶 液 を 用 いてください タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 4

* 3: 反 応 時 間 は 2 ~ 3 分 間 でも 十 分 高 い 比 活 性 をもつプローブが 得 られますが 10 ~ 20 分 間 程 度 の 反 応 で 最 も 比 活 性 の 高 いプローブが 得 られます( 図 2.) また オーバー ナイト 反 応 においても 取 り 込 み 率 の 低 下 はごくわずかです 2 比 活 性 ( 10 9 dpm/μg) 1 0 0 5 10 15 20 反 応 時 間 ( 分 ) 図 2. 反 応 時 間 と 得 られるプローブの 比 活 性 λ-hind III Fragment 25 ng をテンプレートに 用 いた V. 鋳 型 DNA 量 の 変 化 によるプローブ 比 活 性 の 変 化 鋳 型 DNA 量 (ng) 10 25 100 1,000 プローブの 比 活 性 (dpm/μg) 3.0 10 9 1.9 10 9 0.68 10 9 0.77 10 8 λ-dna Hind III Fragment を [α- 32 P] dctp(111 TBq/mmol 370 MBq/ml)1.85 MBq (50 μci)を 用 いてラベルした 場 合 タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 5

VI. 取 り 込 み 率 比 活 性 の 測 定 1. 反 応 液 の 少 量 を TE Buffer または 蒸 留 水 で 20 倍 希 釈 する 2. 希 釈 した 反 応 液 3 μl を DE 81 paper disc(whatman 社 製 )2 枚 にスポットして 風 乾 する 3. 2. の DE81 disc のうちの 1 枚 を 5% Na2HPO4 100 ml 程 度 で 5 分 間 ずつ 6 回 さらに 蒸 留 水 で 1 分 間 ずつ 2 回 エタノールで 2 回 洗 浄 し 風 乾 する 4. 2. の 未 洗 浄 の DE81 disc と 3. で 洗 浄 した DE81 disc のそれぞれを 液 体 シンチレーショ ンカウンターで 測 定 する 5. 次 の 式 により 取 り 込 み 率 プローブの 比 活 性 を 求 める 取 り 込 み 率 (%)= ( 洗 浄 した DE81 disc のカウント;cpm) 100 ( 未 洗 浄 の DE81 disc のカウント;cpm) プローブの 総 量 (ng)= 0.22 ( 取 り 込 み 率 ;%)+( 鋳 型 DNA 量 ;ng) プローブの 比 活 性 (dpm/μg)= 110 ( 取 り 込 み 率 ;%) 10 7 (プローブの 総 量 ;ng) VII. 参 考 文 献 1)A. P. Feinberg and B. Vogelstein. (1983) Anal Biochem. 132, 6-13. 2)A. P. Feinberg and B. Vogelstein. (1984) Anal Biochem. 137, 266-267. 3)J. M. Clark, C. M. Joyce, and G. P. Beardsley. (1987) J Mol Biol. 198, 123-127. VIII. 注 意 本 製 品 は 研 究 用 試 薬 です ヒト 動 物 への 医 療 臨 床 診 断 には 使 用 しないようご 注 意 ください また 食 品 化 粧 品 家 庭 用 品 等 として 使 用 しないでください タカラバイオの 承 認 を 得 ずに 製 品 の 再 販 譲 渡 再 販 譲 渡 のための 改 変 商 用 製 品 の 製 造 に 使 用 することは 禁 止 されています ライセンスに 関 する 情 報 は 弊 社 ウェブカタログをご 覧 ください MEGALABEL PrimeGel はタカラバイオ 株 式 会 社 の 商 標 です その 他 本 説 明 書 に 記 載 されている 会 社 名 および 商 品 名 などは 各 社 の 商 号 または 登 録 済 みもしくは 未 登 録 の 商 標 であり これらは 各 所 有 者 に 帰 属 します v201509da