課 題 番 号 LS101 先 端 研 究 助 成 基 金 助 成 金 ( 最 先 端 次 世 代 研 究 開 発 支 援 プログラム) 実 施 状 況 報 告 書 ( 平 成 25 年 度 ) 本 様 式 の 内 容 は 一 般 に 公 表 されます 研 究 課 題 名 研 究 機 関 部 局 職 名 氏 名 In vivo 構 造 プロテオミクスの 創 生 と 展 開 首 都 大 学 東 京 理 工 学 研 究 科 教 授 伊 藤 隆 1. 当 該 年 度 の 研 究 目 的 蛋 白 質 の 構 造 機 能 相 関 の 正 確 な 記 述 には, 生 細 胞 中 の 蛋 白 質 動 態 の 詳 細 な 解 析 が 不 可 欠 である. 生 細 胞 内 蛋 白 質 の 解 析 手 段 としての in-cell NMR を 発 展 させることによって, 生 体 分 子 に 普 遍 的 に 適 用 可 能 な 技 術 に 成 熟 させ, 様 々な 蛋 白 質 への 多 角 的 網 羅 的 解 析 を 可 能 にすることが 本 研 究 の 目 的 である. H25 年 度 は 計 画 の 最 終 年 度 であり,これまで 開 発 してきた 要 素 技 術 の 高 度 化 最 適 化 を 収 束 させつつ, 今 後 の 応 用 研 究 への 展 開 を 模 索 することを 目 的 とした. 特 に, 世 界 初 となる 真 核 細 胞 内 蛋 白 質 の 立 体 構 造 決 定 と,ランタノイド 結 合 プローブを 用 いた 新 しい 構 造 解 析 法 の 確 立 も 目 指 した.また, 細 胞 内 環 境 が IDP の 動 的 平 衡 に 与 える 影 響 の 詳 細 な 解 析 や, 蛋 白 質 間 相 互 作 用 の 観 測 法 の 開 発 も 行 うこととした. 2. 研 究 の 実 施 状 況 本 研 究 では (i) 細 胞 内 蛋 白 質 の 立 体 構 造,(ii) IDP の 細 胞 内 構 造,(iii) 分 子 クラウディングの 蛋 白 質 安 定 性 への 影 響,(iv) 蛋 白 質 蛋 白 質,および 蛋 白 質 基 質 相 互 作 用,の 4 テーマについて 研 究 を 行 った. H25 年 度 は,(i)では 世 界 初 となる 真 核 細 胞 内 蛋 白 質 の 立 体 構 造 決 定 に 挑 戦 した.これまで 開 発 してきた 要 素 技 術 ( 安 定 同 位 体 標 識 技 術,NMR 試 料 管 への 培 地 供 給 システム, 迅 速 な NMR 測 定 法, 新 しいデータ 処 理 法,ベイズ 推 定 を 図 1. 真 核 細 胞 中 の 蛋 白 質 としては 世 界 初 の,Sf9 細 用 いた 立 体 構 造 解 析 法 )を 結 集 した 結 果,まだ 精 密 化 が 必 要 ではあるが,sf9 胞 中 の GB1 の 立 体 構 造. 内 の GB1 蛋 白 質 の 精 密 な 立 体 構 造 の 算 出 に 成 功 した( 図 1).また,DOTA 骨 格 を 持 つ 新 規 ランタノイド 結 合 分 子 プローブの 合 成 にも 成 功 した( 図 2).このプローブを 用 い ることで, 細 胞 内 の 還 元 的 な 環 境 下 で 常 磁 性 効 果 による 長 距 離 の 立 体 構 造 情 報 の 取 得 が 可 能 になり,これまで 不 可 能 だった 細 胞 内 濃 度 の 低 い 蛋 白 質 の 立 体 構 造 解 析 に 図 2.In-cell NMR 道 を 開 いた.(ii)では,ショウジョウバエ drkn SH3 ドメイン( 試 験 管 内 でフォールド 状 態 のための 新 しい DOTA-M8 化 合 物 と 変 性 状 態 の 平 衡 であり, 細 胞 内 環 境 で 変 性 状 態 のスペクトルに 変 化 )について, 試 験 管 内,クラウディング 剤 存 在 下, 大 腸 菌 HeLa 細 胞 中 で 解 析 を 行 い, 細 胞 内 環 境 が 構 造 の 平 衡 に 与 え る 影 響 を 詳 細 に 分 析 した.(iii)では,sf9 の 系 および HeLa 細 胞 の 系 を 用 いて, 真 核 細 胞 内 蛋 白 質 の 蛋 白 質 主 鎖 のダイナミクス 解 析 に 挑 戦 した.(iv)では,Ras およびこれと 相 互 作 用 する RGL-RBD 等 を 用 い, 電 気 穿 孔 法 と 膜 透 過 ペプチドの 2 種 の 蛋 白 質 導 入 による 蛋 白 質 間 相 互 作 用 解 析 の 系 の 確 立 を 行 った. 1
3. 研 究 発 表 等 雑 誌 論 文 計 5 件 ( 掲 載 済 み- 査 読 有 り) 計 5 件 1. Wang, W., Uzawa, T., Tochio, N., Hamatsu, J., Hirano, Y., Tada, S., Saneyoshi, H., Kigawa, T., Hayashi, N., Ito, Y., Taiji, M., Aigaki, T. & Ito, Y. "A fluorogenic peptide probe developed by in vitro selection using trna carrying a fluorogenic amino acid." Chem. Commun. 50, 2962-2964 (2014). 2. Mikami, S., Kanaba, T., Takizawa, N., Kobayashi, A., Maesaki, R., Fujiwara, T., Ito, Y. & Mishima, M. "Structural insights into the recruitment of SMRT by the corepressor SHARP under phosphorylative regulation." Structure 22, 35-46 (2014). 3. Hembram, D.S.S., Haremaki, T., Hamatsu, J., Inoue, J., Kamoshida, H., Ikeya, T., Mishima, M., Mikawa, T., Hayashi, N., Shirakawa, M. & Ito, Y. "An in-cell NMR study of monitoring stress-induced increase of cytosolic Ca 2+ concentration in HeLa cells." Biochem. Biophys. Res. Commun. 438, 653-659 (2013). 4. Kobayashi, A., Kanaba, T., Satoh, R., Fujiwara, T., Ito, Y., Sugiura, R. & Mishima, M. "Structure of the second RRM domain of Nrd1, a fission yeast MAPK target RNA binding protein, and implication for its RNA recognition and regulation. " Biochem. Biophys. Res. Commun. 437, 12-17 (2013). 5. Mikami, S., Kanaba, T., Ito, Y. & Mishima M. "NMR assignments of SPOC domain of the human transcriptional corepressor SHARP in complex with a C-terminal SMRT peptide." Biomol. NMR Assign. 7, 267-270 (2013). ( 掲 載 済 み- 査 読 無 し) ( 未 掲 載 ) 会 議 発 表 計 22 件 専 門 家 向 け 計 21 件 ( 末 尾 に* 印 のあるものは, 本 研 究 の 直 接 の 成 果 の 発 表.その 他 は 本 研 究 の 成 果 を 含 む 発 表.) 1. 小 林 彩 保, 佐 藤 亮 介, 藤 原 俊 伸, 伊 藤 隆, 杉 浦 麗 子, 三 島 正 規, RNA 結 合 蛋 白 質 Nrd1 の NMR 法 による 構 造 解 析, 第 13 回 日 本 蛋 白 質 科 学 会 年 会, 鳥 取, 平 成 25 年 6 月 12-14 日, 主 催 : 日 本 蛋 白 質 科 学 会 2. 金 場 哲 平, 秋 吉 克 昂, 前 崎 綾 子, 宮 崎 健 介, 伊 藤 隆, 三 島 正 規, NMR を 用 いた 溶 液 中 のマルチドメ インタンパク 質 PKC の 構 造 解 析 の 試 み, 第 13 回 日 本 蛋 白 質 科 学 会 年 会 鳥 取, 平 成 25 年 6 月 12-14 日, 主 催 : 日 本 蛋 白 質 科 学 会 3. Ito, Y. Cellular (in vivo) structural biology by NMR, Seminar at School of Cancer Sciences, University of Birmingham,バーミンガム( 英 国 ), 平 成 25 年 7 月 30 日, 主 催 :University of Birmingham* 4. Tanaka, T., Hamatsu, J., Seiwa, E., Ikeya, T., Masaki, M. & Ito, Y., Structural analysis of proteins inside living sf9 cells by in-cell NMR spectroscopy, 5th Asia-Pacific NMR Symposium,ブリスベー ン(オーストラリア), 平 成 25 年 10 月 27-31 日 * 5. 角 越 和 也, 池 谷 鉄 兵, 伊 藤 隆, 清 水 謙 多 郎, 圧 縮 センシングを 用 いた NMR スペクトルの 復 元 法, 第 51 回 日 本 生 物 物 理 学 会 年 会, 京 都, 平 成 25 年 10 月 28-30 日, 主 催 : 日 本 生 物 物 理 学 会 * 6. 嶋 崎 真 那 人, 池 谷 鉄 兵, 三 島 正 規, 伊 藤 隆,Peter Güntert, NMR タンパク 質 立 体 構 造 決 定 のため の 新 規 構 造 最 適 化 法 の 開 発, 第 51 回 日 本 生 物 物 理 学 会 年 会, 京 都, 平 成 25 年 10 月 28-30 日, 主 催 : 日 本 生 物 物 理 学 会 * 7. 小 林 彩 保, 佐 藤 亮 介, 藤 原 俊 伸, 杉 浦 麗 子, 伊 藤 隆, 三 島 正 規, 分 裂 酵 母 由 来 の MAP キナーゼに よりリン 酸 化 される RNA 結 合 タンパク 質 Nrd1 の 構 造 解 析, 第 51 回 日 本 生 物 物 理 学 会 年 会, 京 都, 平 成 25 年 10 月 28-30 日, 主 催 : 日 本 生 物 物 理 学 会 8. Ito, Y., In situ observation of protein structure and dynamics by in-cell NMR, Workshop on Modeling Biomolecular Systems in Cellular Environments, 京 都, 平 成 25 年 11 月 1 日 * 9. 鴨 志 田 一, 晴 柀 貴 洋, 濱 津 順 平, 井 上 仁, 池 谷 鉄 兵, 三 島 正 規, 白 川 昌 宏, 伊 藤 隆, In-cell NMR を 用 いた,HeLa 細 胞 内 のストレス 応 答 による Ca 2 + 濃 度 変 化 のモニタリング, 第 52 回 NMR 討 論 会, 金 沢, 平 成 25 年 11 月 12-14 日, 主 催 : 日 本 核 磁 気 共 鳴 学 会 * 10. 田 中 孝, 浜 津 順 平, 清 和 恵 美 子, 池 谷 鉄 兵, 三 島 正 規, 伊 藤 隆, Sf9 細 胞 の in-cell NMR における アミノ 酸 選 択 的 安 定 同 位 体 標 識, 第 52 回 NMR 討 論 会, 金 沢, 平 成 25 年 11 月 12-14 日, 主 催 : 日 本 2
核 磁 気 共 鳴 学 会 * 11. 嶋 崎 真 那 人, 池 谷 鉄 兵, 三 島 正 規, 伊 藤 隆,Peter Güntert, NMR 蛋 白 質 立 体 構 造 決 定 のための 新 規 構 造 最 適 化 法 の 開 発, 第 52 回 NMR 討 論 会, 金 沢, 平 成 25 年 11 月 12-14 日, 主 催 : 日 本 核 磁 気 共 鳴 学 会 * 12. 小 林 彩 保, 佐 藤 亮 介, 藤 原 俊 伸, 伊 藤 隆, 杉 浦 麗 子, 三 島 正 規, MAP キナーゼによりリン 酸 化 される RNA 結 合 タンパク 質 Nrd1 の 構 造 解 析, 第 52 回 NMR 討 論 会, 金 沢, 平 成 25 年 11 月 12-14 日, 主 催 : 日 本 核 磁 気 共 鳴 学 会 13. 金 場 哲 平, 矢 巻 菜 央, 秋 吉 克 昂, 前 崎 綾 子, 宮 崎 健 介, 伊 藤 隆, 三 島 正 規, マルチドメインタンパク 質 Protein kinase C の 構 造 解 析 の 試 み, 第 52 回 NMR 討 論 会, 金 沢, 平 成 25 年 11 月 12-14 日, 主 催 : 日 本 核 磁 気 共 鳴 学 会 14. 飯 沼 純 弥, 小 林 彩 保, 金 場 哲 平, 伊 藤 隆, 三 島 正 規, リン 酸 化 された SHARP/SMRT キメラの 構 造 解 析, 第 52 回 NMR 討 論 会, 金 沢, 平 成 25 年 11 月 12-14 日, 主 催 : 日 本 核 磁 気 共 鳴 学 会 15. 池 谷 鉄 兵, 伊 藤 隆, NMR による 蛋 白 質 分 子 立 体 構 造 解 析 の 高 精 度 化 および 細 胞 内 計 測 を 目 指 した CS とベイズ 法 適 用 の 試 み, 新 学 術 領 域 4 班 合 同 ミニワークショップ, 京 都, 平 成 25 年 11 月 17 日, 主 催 : 新 学 術 領 域 研 究 スパースモデリングの 深 化 と 高 次 元 データ 駆 動 科 学 の 創 生 16. 伊 藤 隆, Future perspectives on eukaryotic in-cell NMR, 第 36 回 分 子 生 物 学 会 年 会 (ワーク ショップを 企 画 ), 神 戸, 平 成 25 年 12 月 5 日, 主 催 : 日 本 分 子 生 物 学 会 * 17. 池 谷 鉄 兵, 伊 藤 隆, In-cell NMR 法 を 用 いた 生 きた 細 胞 内 での 天 然 変 性 蛋 白 質 の 立 体 構 造 とダイナ ミクス, 新 学 術 領 域 研 究 天 然 変 性 タンパク 質 の 分 子 認 識 機 構 と 機 能 発 現 第 3 回 公 開 シンポジウム, 福 岡, 平 成 26 年 2 月 27-28 日, 主 催 : 新 学 術 領 域 研 究 天 然 変 性 タンパク 質 の 分 子 認 識 機 構 と 機 能 発 現 * 18. 伊 藤 隆, 大 腸 菌 および 昆 虫 細 胞 を 用 いた in-cell NMR 試 料 調 製,In-cell NMR 講 習 会 2014( 講 習 会 を 主 催 ), 横 浜, 平 成 26 年 3 月 18 日 * 19. 伊 藤 隆, 迅 速 な NMR 測 定 及 び 処 理,In-cell NMR 講 習 会 2014( 講 習 会 を 主 催 ), 横 浜, 平 成 26 年 3 月 19 日 * 20. 伊 藤 隆, Azara ME & QME での 処 理,In-cell NMR 講 習 会 2014( 講 習 会 を 主 催 ), 横 浜, 平 成 26 年 3 月 19 日 * 21. 彦 根 佑 哉, 平 井 剛, 袖 岡 幹 子, 伊 藤 隆, In-cell NMR を 志 向 した DOTA-M8 リガンドの 合 成 研 究, 名 古 屋, 平 成 26 年 3 月 28 日, 主 催 : 日 本 化 学 会 * 図 書 一 般 向 け 計 1 件 1. 伊 藤 隆, 生 きた 細 胞 の 中 の 蛋 白 質 の 立 体 構 造 やフレキシビリティーを その 場 観 察 する!, 首 都 大 学 東 京 オープンユニバーシティー PRI シリーズ, 東 京,H26 年 2 月 14 日 産 業 財 産 権 出 願 取 得 状 況 ( 取 得 済 み) ( 出 願 中 ) Webページ (URL) 首 都 大 学 東 京 大 学 院 理 工 学 研 究 科 分 子 物 質 化 学 専 攻, 有 機 構 造 生 物 化 学 研 究 室, 伊 藤 グループ ホー ムページ,http://www.comp.tmu.ac.jp/osbc/Group_Ito/index.html 国 民 との 科 学 技 術 対 話 の 実 施 状 況 1. 第 36 回 日 本 分 子 生 物 学 会 年 会 ワークショップ Cellular structural biology by in situ magnetic resonance spectroscopy, 平 成 25 年 12 月 5 日, 神 戸 ポートアイランド, 専 門 家 対 象, 約 60 名 参 加. 菅 瀬 謙 治 博 士 (サントリー)と 共 同 で 主 催. 国 内 外 の 研 究 者 に,in-cell NMR および 関 連 分 野 における 最 新 の 研 究 成 果 を 紹 介 していただいた. 伊 藤 自 身 も 最 新 の 成 果 について 報 告 した. 2. 首 都 大 学 東 京 オープンユニバーシティー,PRI シリーズ, 生 きた 細 胞 の 中 の 蛋 白 質 の 立 体 構 造 やフレ キシビリティーを その 場 観 察 する!, 平 成 26 年 2 月 14 日, 首 都 大 学 東 京 飯 田 橋 キャンパス, 一 般 対 象, 約 20 名 参 加. 本 研 究 の 背 景 および 内 容 についてわかりやすく 説 明 した. 3. In-cell NMR トレーニングコース 2014, 平 成 26 年 3 月 18-19 日, 理 化 学 研 究 所 横 浜 研 究 所, 専 門 家 ( 企 業 の 研 究 者 含 む) 対 象, 約 40 名 参 加. 木 川 隆 則 博 士 ( 理 化 学 研 究 所 ), 白 川 昌 宏 教 授 ( 京 都 大 学 )と 共 同 で 主 催. 本 研 究 の 成 果 である in-cell NMR の 最 新 手 法 の 紹 介 3
と, 細 胞 や NMR 装 置 を 用 いた 実 演 演 習 を 行 った. 新 聞 一 般 雑 誌 等 掲 載 その 他 4. その 他 特 記 事 項 4
様 式 19 別 紙 2 課 題 番 号 LS101 実 施 状 況 報 告 書 ( 平 成 25 年 度 ) 助 成 金 の 執 行 状 況 本 様 式 の 内 容 は 一 般 に 公 表 されます 1. 助 成 金 の 受 領 状 況 ( 累 計 ) ( 単 位 : 円 ) 直 接 経 費 間 接 経 費 1 交 付 決 定 額 2 既 受 領 額 ( 前 年 度 迄 の 累 計 ) 3 当 該 年 度 受 領 額 4(=1-2- 3) 未 受 領 額 既 返 還 額 ( 前 年 度 迄 の 累 計 ) 108,000,000 72,700,000 35,300,000 0 0 32,400,000 21,810,000 10,590,000 0 0 140,400,000 94,510,000 45,890,000 0 0 2. 当 該 年 度 の 収 支 状 況 ( 単 位 : 円 ) 直 接 経 費 間 接 経 費 1 前 年 度 未 執 2 当 該 年 度 受 領 額 3 当 該 年 度 受 4(=1+2+ 取 利 息 等 額 3) 当 該 年 度 ( 未 収 利 息 を 除 収 入 く) 5 当 該 年 度 執 6(=4-5) 当 該 年 度 未 執 当 該 年 度 返 還 額 0 35,300,000 0 35,300,000 35,300,000 0 0 0 10,590,000 0 10,590,000 10,590,000 0 0 0 45,890,000 0 45,890,000 45,890,000 0 0 3. 当 該 年 度 の 執 内 訳 ( 単 位 : 円 ) 金 額 備 考 物 品 費 21,367,462 遠 心 機, 超 純 水 製 造 機, 安 定 同 位 体 標 識 試 薬 等 旅 費 737,120 研 究 成 果 発 表 旅 費 (NMR 討 論 会 ) 等 謝 金 人 件 費 等 9,253,186 博 士 研 究 員 + 技 術 員 人 件 費, 講 演 招 聘 謝 金 その 他 3,942,232 機 器 修 理,DNA+ペプチド 合 成 委 託 等 直 接 経 費 計 35,300,000 間 接 経 費 計 10,590,000 45,890,000 4. 当 該 年 度 の 主 な 購 入 物 品 (1 品 又 は1 組 若 しくは1 式 の 価 格 が50 万 円 以 上 のもの) 仕 様 型 性 能 単 価 金 額 物 品 名 数 量 等 ( 単 位 : 円 ) ( 単 位 : 円 ) トミー 精 工 高 速 冷 却 遠 心 機 Suprema21,アンク 一 式 ルローターNA400 含 む 超 純 水 製 造 装 置 一 式 ミリポア 社 Milli- Q Integral-3Sシス テム 納 入 年 月 日 設 置 研 究 機 関 名 1 2,129,400 2,129,400 2013/11/14 首 都 大 学 東 京 1 2,548,035 2,548,035 2014/1/8 首 都 大 学 東 京