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Folia Pharmacol. Jpn. 146 実 験 技 術 G 小 坂 田 文 隆 1, 2, 3, 4) 要 約 : G G 1. はじめに Sydney Brenner C. elegans, Sebastian Seung Winfried Denk, Santiago Ramón y Cajal paired recording - - N Torrey Pines Rd, La Jolla, CA, USA - - - E-mail: fosakada@ps.nagoya-u.ac.jp Title: From the connectome to brain function: rabies virus tools for elucidating structure and function of neural circuits Author: Fumitaka Osakada

実 験 技 術 Jeff Lichtman MRI herpes simplex virus type HSV- pseudorabies virus PRV PRV rabies virus RABV wheat germ agglutinin WGA 2. 脳 の 構 造 から 機 能 へ A 3. 狂 犬 病 ウイルスの 構 造 と 機 能 nm nm G Glycoprotein M Matrix N Nucleocapsid P Phosphoprotein L Large, RNA N P M G L A RNA N RNP ribonucleoprotein RNA N N RNA RNP RNP RNase L P RNA RNA polymerase RNA G G ph M RNP

図 1 G 欠 損 狂 犬 病 ウイルスの 神 経 回 路 トレーシング 法 A: 野 生 型 の 狂 犬 病 ウイルス(RABV)は, 軸 索 終 末 から 逆 行 性 に 感 染 し,シナプスを 介 してウイルス 感 染 を 繰 り 返 す.B:G 欠 損 狂 犬 病 ウイ ルス(RABVΔG)は, 軸 索 終 末 から 一 次 感 染 するが,その 後 の 二 次 感 染 を 起 こさない.C: 哺 乳 類 動 物 に, 鳥 ウイルスのエンベロープ EnvA の 受 容 体 である TVA を 標 的 細 胞 に 遺 伝 子 導 入 を 行 う.D:C の 後 に,EnvA-RABVΔG を 注 入 すると,TVA 発 現 細 胞 に 特 異 的 に 感 染 が 成 立 する. 周 辺 の 哺 乳 類 細 胞 には TVA は 発 現 しないので,EnvA-RABVΔG は 感 染 しない.E: 哺 乳 類 動 物 に, 鳥 ウイルスのエンベロープ EnvA の 受 容 体 である TVA および 狂 犬 病 ウイルスの 糖 タンパク 質 である RABV-G を 標 的 細 胞 に 導 入 する.F:E の 後 に,EnvA-RABVΔG を 注 入 すると,TVA 発 現 細 胞 にのみに 感 染 が 成 立 し, 感 染 細 胞 内 で RABV-G が 補 完 されることにより, 新 たに 形 成 された RABVΔG が 標 的 細 胞 に 単 シナプス 結 合 する 入 力 細 胞 に 感 染 する. 二 次 感 染 細 胞 には RABV-G が 存 在 しないため,さらなるウイルスの 伝 播 は 起 こらない. RNA RNP mrna RNP RNA polymerase L P A A mrna N P L RNP RNP RNA RNA N RNP RNP M G RNP mrna RNA

実 験 技 術 図 2 G 欠 損 狂 犬 病 ウイルスのゲノムベクター A:RABV のゲノムは N,P,M,G,L の 5 つの 遺 伝 子 を 持 つ.RABVΔG は 糖 タンパク 質 G の 代 わりに 外 来 遺 伝 子 を 発 現 する.B:RABVΔG のゲノムベクターである psadδg-f3 は Multi-Cloning Site(MCS)を 2 つ 持 ち, 外 来 遺 伝 子 を 1 つあるいは 2 つ 発 現 することができる. 4. G 欠 損 狂 犬 病 ウイルスによる 神 経 回 路 トレー シング RABV-G, RABV-G G RABVΔG BA RABVΔG RABV-G RABV-G RABV-G G pseudotyping pseudotyping EnvA RABVΔG pseudotyping EnvA TVA EnvA RABVΔG EnvA- RABVΔG TVA C D TVA EnvA/TVA EnvB TVB EnvB/TVB G EnvA/TVA EnvB/TVB RABVΔG E F RABVΔG,

図 3 G 欠 損 狂 犬 病 ウイルスの 作 製 方 法 ステップ 1 では,RABVΔG のゲノムベクター(pSADΔG-F3)に 導 入 したい 遺 伝 子 を 組 み 込 む.ステップ 2 では,cDNA から RABVΔG を 再 構 成 する.pSADΔG-X,pcDNA-B19N,pcDNA-B19P,pcDNA-B19L,pcDNA-B19G を B7GG に 遺 伝 子 導 入 し, 上 清 を 回 収 する.ステッ プ 3 では,RABVΔG を B7GG 細 胞 にて 増 殖 させる. 上 清 を 凍 結 保 存 すれば, 必 要 に 応 じて 凍 結 した 上 清 から RABVΔG を 増 殖 させることがで き, 毎 回 DNA から 再 構 成 する 必 要 はない.ステップ 4 では,BHK-EnvA 細 胞 を 用 いて RABVΔG を EnvA で pseudotyping を 行 い,EnvA- RABVΔG を 作 製 する.EnvB/TVB システムを 用 いる 際 には,BHK-EnvB 細 胞 を 用 いて EnvB で pseudotyping を 行 う.ステップ 5 では, 超 遠 心 を 2 回 行 うことによりウイルスを 濃 縮 する.ステップ 6 では,RABVΔG は HEK293 細 胞 を 用 いて,EnvA-RABVΔG は HEK-TVA 細 胞 お よび HEK293 細 胞 を 用 いて,EnvB-RABVΔG は HEK-TVB 細 胞 および HEK293 細 胞 を 用 いて 力 価 を 測 定 する. 5. G 欠 損 狂 犬 病 ウイルスの 作 製 法 RABVΔG cdna EnvA EnvB pseudotyping 1)G 欠 損 狂 犬 病 ウイルスの 再 構 成 と 増 殖 DNA RABVΔG G psadδg-f Addgene B psadδg-f T promoter RNA RABVΔG G RABVΔG BHK T RNA polymerase RABV-G B GG B GG X psadδg-x pcdna-bn pcdna-bp pcdna-bl pcdna- BG Addgene

実 験 技 術 cdna RNA N P L RNP B GG B GG T RNA polymerase T promoter psadδg-f RNA pcdna- BN pcdna-bp pcdna-bl N P L N RNA RNP P L RNA RNA polymerase RNP RNA RNA N RNP RNA RNA polymerase mrna N P M L M B GG G RABVΔG B GG G RABVΔG RABV-G RABVΔG DNA B GG in vivo EnvA pseudotyping 2)G 欠 損 狂 犬 病 ウイルスの pseudotyping RABV-G RABVΔG VSV-G RABVΔG EnvA pseudotyping RABVΔG EnvA-RABVΔG TVA RABVΔG pseudotyping RABV-G RABVΔG EnvA pseudotyping EnvA BHK-EnvA BHK-EnvA RABV-G RABVΔG EnvA RABVΔG EnvA- RABVΔG RABV-G RABVΔG EnvA- RABVΔG RABVΔG TVA RABVΔGTVA RABVΔG BHK-EnvA PBS wash RABVΔG 3)G 欠 損 狂 犬 病 ウイルスの 濃 縮 および 力 価 測 定 RABVΔG EnvA-RABVΔG cm μl RABVΔG HEK EnvA-RABVΔG TVA HEK-TVA EnvA-RABVΔG HEK RABVΔG HEK EnvA-RABVΔG RABVΔG pseudotyping 6. 哺 乳 類 における in vivo への 適 用 RABVΔG in vivo, RABVΔG GFP

図 4 G 欠 損 狂 犬 病 ウイルスを 用 いた 神 経 回 路 解 析 A:RABVΔG トレーシング 法 を 用 いると, 特 定 の 神 経 細 胞 に 入 力 する 細 胞 群 を 同 定 し, 神 経 回 路 を 可 視 化 できる.B:RABVΔG トレーシン グ 法 と 二 光 子 顕 微 鏡 イメージングを 組 み 合 わせることで, 神 経 接 続 を 持 った 細 胞 群 の 神 経 活 動 を 評 価 できる. 例 えば, 大 脳 皮 質 視 覚 野 におい て,どの 角 度 の 線 分 に 強 く 反 応 するかを 調 べ, 神 経 回 路 を 構 成 する 全 て のニューロンの 反 応 特 性 を 明 らかにすることできる.C:RABVΔG ト レーシング 法 と optogenetics を 組 み 合 わせることで, 神 経 接 続 を 持 っ た 細 胞 に 摂 動 を 与 えることができる. 例 えば, 特 定 の 入 力 細 胞 の 神 経 活 動 を 特 定 のパターンで 活 性 化 あるいは 不 活 性 化 した 際 の,ポストシナプ ス 細 胞 の 応 答 などを 調 べることができる. ChR,, B RABV-G EnvA/TVA EnvB/TVB E FA parvalbumin PV PV Cre PV-Cre Cre TVA RABV-G AAV-DIO AAV EnvA-RABV ΔG-GFP EnvA-RABVΔG- GFP TVA PV RABV-G PV GFP Cre Cre TVA RABV-G TVB EnvB pseudotyped EnvB-RABVΔG TVB EnvB-RABVΔG, TVA RABV-G, RABVΔG B D FA RABVΔG GFP GFP B

実 験 技 術 RABVΔG GCaMP R-CaMP GCaMP RABVΔG-GCaMP AL V GCaMP Boptogenetics chemogenetics ON/OFF C RABVΔG channelrhodopsin archaerhodopsin allatostatin receptor PSAM/GlyR rtta Cre ER T CreER T FLPo RABVΔG RABVΔG optogenetics 7. 最 後 に optogenetics, RABVΔG 著 者 の 利 益 相 反 : 文 Callaway EM. Curr Opin Neurobiol. ;: -. Osakada F, et al. Nat Protoc. ; :-. Wickersham IR, et al. Neuron. ;: -. Osakada F, et al. Neuron. ;: -. Schnell MJ, et al. EMBO J. ;:-. Mebatsion T, et al. Cell. ;: -. Etessami R, et al. J Gen Virol. ;:-. Wickersham IR, et al. Nat Methods. ; :-. Nhan HL, et al. J Comp Neurol. ; :-. Wall NR, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. ; : -. Choi J, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. ; : -. Choi J, et al. J Comp Neurol. ; :-. Marshel JH, et al. Neuron. ;: -. Rancz EA, et al. Nat Neurosci. ;: -. Osakada F, et al. Biol Pharm Bull. ;: -.... 著 者 プロフィール 献