技術論文 乳癌における Dual Color in situ Hybridization 法に よる HER 遺伝子増幅の検出 FISH 法との比較 田中 京子 ) 武田麻衣子 ) 西川 武 ) 中井登紀子 ) 小関 久恵 ) 笠井 孝彦 ) ) 奈良県立医科大学附属病院病院病理部 6-85 ) 奈良県立医科大学病理診断学講座 ) 産業医科大学第 病理学教室 要 森田 剛平 ) 大林 千穂 ) 奈良県橿原市四条町 8 旨 乳癌における HER 検査での DISH 法の有用性を検討したので報告する HER immunohistochemistry IHC 法にてス コア +であった浸潤性乳癌 7 例を用い FISH 法および DISH 法での HER 遺伝子増幅の有無を検討した HER DISH 法の判定は 名で行いその判定者間での結果も比較した DISH 法の測定者間での比較では 測定値では 例 7% で 測定者間でばらつきがみられたが 判定結果の相違はいずれの症例も確認されなかった FISH 法および DISH 法での 判定結果の比較では 例 78% では一致していたが 6 例 % で乖離が見られた FISH 法と DISH 法の測定値は 有意な相関がみられた キーワード 乳癌 DISH FISH HER 遺伝子増幅 乳癌における HER 遺伝子増幅やタンパク質過剰 に て 浸 潤 性 乳 管 癌 と 診 断 さ れ HER immuno- 発現は 予後因子となるばかりでなく 分子標的治 histochemistry 以下 IHC 法 にて スコア +と判定 療薬の標的となっている された 7 症例の手術材料を用いた ), ) 乳癌における Dual Color in situ hybridization 法は 7 番染色体に存在す 検査方法 る HER 遺伝子とセントメアにハイブリダイズした 対 象 例 に つ い て HER Fluorescence in situ プローブに標識されているハプテンを パーオキシ hybridization 以 下 FISH 法 と Dual Color in situ ダーゼ系と アルカリフォスファターゼ系の二種類 hybridization 以下 DISH 法 との比較検討を行った の酵素を標識した抗ハプテン抗体を用いて 黒色 標本は %中性ホルマリンにて 原則 時間か HER 遺伝子 と赤色 第 7 番染色体セントロメ ら 時間 最長 8 時間固定され パラフィン包埋 ア のシグナルとしてそれぞれ検出させる方法で 後 薄切切片を作成した IHC 法は 自動免疫染色 そのシグナルは光学顕微鏡下で観察が可能である 装置 Ventana BenchMark XT Roche を用いた IHC 今回 乳癌において Dual Color ISH HER を用い 法の一次抗体は I-VIEW パスウエー HER B5 ) た HER 検査の有用性を検討したので報告する キット Roche を用い 二次抗体から発色までは I-VIEW DAD ユニバーサルキット Roche を使用 I 対象及び方法 し マニュアル Table に沿って自動染色した FISH 法は パスビジョン HER DNA プローブキッ 対象 年 6 月から 年 6 月までの期間で 当院 ト Abbott を使用し 染色を行った DISH 法は IHC 法と同様の自動免疫染色装置を用いた 試薬は 平成 5 年 月 7 日受付 平成 6 年 月 6 日受理 5 57
Table IHC 自動染色プロトコール ①熱処理 一次抗体の抗原賦活処理として 熱処理 ②インヒビターを 滴 約 μl 加え 分間反応 ③インヒビターを洗浄後 一次抗体を 滴 約 μl 加え 分間反応 ④一次抗体を洗浄後 ビオチン標識 Ig を 滴 約 μl 加え 8 分間反応 ⑤ビオチン標識 Ig を洗浄後 アビジン-HRP 滴 約 μl 加え 8 分間反応 ⑥アビジン-HRP を洗浄後 DAB 試薬と HO 試薬を 滴ずつ 約 μl 加え 8 分間反応 ⑦DAB 試薬と HO 試薬を洗浄後 COPPER 試薬を 滴 約 μl 加え 分間反応 ⑧COPPER を洗浄 ⑨対比染色 核染色および色出し Table DISH 自動染色プロトコール ①熱処理 一次抗体の抗原賦活処理として 熱処理 ②HER DNA カクテルプローブ 滴 約 μl 滴下し 6 時間反応 ③HER DNA カクテルプローブを洗浄後 抗 DNP 抗体 滴 約 μl 滴下し 分間反応 ④抗 DNP 抗体を洗浄後 HRP 標識抗体 滴 約 μl 滴下し 6 分間反応 ⑤HER 標識抗体を洗浄後 発色試薬 A 滴 約 μl に発色試薬 B と発色試薬 C 滴ずつ 約 μl 滴下し 分間反応 ⑥発色液 ABC 洗浄後 抗 DIG 抗体 滴 約 μl 滴下し 分間反応 ⑦抗 DIG 抗体洗浄後 AP 標識抗体 滴 約 μl 滴下し 分間反応 ⑧AP 標識抗体洗浄後 PH エンハンサー試薬 滴 約 μl に Naphthol 試薬 滴 約 μl と Fast Red 試薬 滴 約 μl 滴 下し 8 分間反応 ⑨対比染色 核染色および色出し ベ ン タ ナ イ ン フ ォ ー ム Dual ISH HER キ ッ ト 対する HER のシグナル総数の比率を算出して Roche を使用し マニュアル Table に沿って HER/CEP7 が.8 未満を陰性 negative. を超 自動染色した える場合を陽性 positive とし HER/CEP7 が.8 判定方法 以上で. 未満の場合は 境界域 equivocal とした HER 遺伝子増幅やタンパク過剰発現の評価方法 FISH 法の計測値は 目視判定法と CV 法で相関係 は American Society of Clinical Oncology ASCO / 数 r =.79 と良い相関を得ていた Figure ので College of American Pathologists CAP HER 検査ガ 以下の DISH 法との比較には CV 法での測定結果を イドラインに準拠した IHC 法 FISH 法 DISH 用い検討した DISH 法の測定値は 名 A B 法に使用する切片は 連続切片で同一部位を計測 C D 細胞検査士を含む で目視判定を行い その した 判定者間での結果を比較するとともに DISH 法で ) FISH 法の判定は IHC 法で染色強度を観察し 測 定部位をマーキングし浸潤部分を特定し 個の乳 の 名の計測値の平均値で得られた結果を FISH 法 CV 法 で得られた結果と比較した 癌 細 胞 で の HER 7 番 染 色 体 セ ン ト ロ メ ア DISH 法での測定者間の再現性については 変動 CEP7 のシグナル数を 蛍光顕微鏡 BIOREVO 係数 標準偏差/平均値 % を求め 比較 BZ-9 KEYENCE を用いた従来の目視計測 お 検討を行った FISH 法および DISH 法での解析評価 よび自動解析装置 CytoVision Leica を用いた自動 での一致率および相関の検討には Pearson の検定を 計測 以下 CV 法 を行った 総数の比 HER/CEP7 用いた を求め.8 未満を陰性 negative. を超える場 合を陽性 positive HER/CEP7 が.8 以上で. II 結 果 未満の場合は 境界域 equivocal とした ) DISH 法の判定は FISH 法で特定した同箇所にお それぞれの症例の FISH 法および DISH 法の計測お いて HER は黒色のシグナルとして CEP7 は赤 よび判定結果を Table に示す 色のシグナルとして染色されるため 各々の核にお DISH 法の測定者間での比較 けるシグナル数を計測し CEP7 のシグナル総数に 58 5 名 A B C D の測定者間での結果の相違
FISH-CV method n = 7 r =.79 y = -.97 +.7x p<..5.5.5.5 5 FISH-ocular observation method Figure Scatter diagram of HER gene/cep7 signal ratios by ocular observation method and CV method There was a considerably correlation between the two. FISH, fluorescence in situ Hybridization. を比較した 判定結果の相違はいずれの症例も確認 おいて予後因子であり トラスツズマブによる分子 されなかった 7 症例のうち 例 7% では 標的治療薬の特異的ターゲットである ), ) そのた 変動係数は %を超え 測定者間でのバラツキがみ め 治療に先立ち乳癌組織での HER 遺伝子増幅や られた タンパク過剰発現の状況を確認することは必要不可 FISH 法と DISH 法の比較 欠であり その検査 判定方法が治療方針を大きく FISH 法および DISH 法での判定結果の比較では 左右する FISH 法は HER 遺伝子増幅の検出のひ 例 78% では一致していたが 6 例 % Case とつで 現在最も広く使われている方法である し No. 7 8 で乖離していた Table かし 染色手順が煩雑で 機械での自動染色が汎 FISH 法で陽性であった 症例のうち 症例 Case 用されていない 観察には蛍光顕微鏡が必要で No. 6 が DISH 法でも陽性であったが もう 症 蛍光顕微鏡下で病理組織像との対比が困難である 例 Case No. は陰性と判定された Table 測定者間における再現性が低い すぐに色素 Figure また FISH 法で陰性であった 症例の が退色するため 反復して観察することや長期保存 うち DISH 法では陽性と判定された症例が 症例 が不可能である などの問題点が指摘されている 5) % Case No. Figure 境界域と判定された 一方 DISH 法は 異なるハプテンが標識された HER 症例が 症例 % Case No. あった FISH 法 遺伝子と第 7 番染色体セントロメアに対する ミッ で境界領域と判定された 症例 Case No. 7 クスプローブを同時に標的遺伝子にハイブリダイ 8 はいずれも DISH 法では陰性と判定された ゼーションさせ 標識されたハプテンを Silver in situ FISH 法および DISH 法の測定値の比較では 相関係 hybridization SISH 法 と Chromogenic in situ 数 r =.598 を も っ て 有 意 の 相 関 が み ら れ た Hybridization CISH 法により可視化させる方法で Figure そのシグナルは光学顕微鏡下で観察が可能である ため ) 病理組織との対比も容易で 反復して観察 III 考 察 することや長期保存ができる また 自動免疫染色 装置 Ventana BenchMark XT Roche を用い 自動 HER 遺伝子増幅やタンパク過剰発現は 乳癌に 的に染色することが可能である 55 59
Table Result of FISH and DISH test for each case FISH 法 DISH 法 Case No. HER/ HER/Chr7 Result* Chr7 A B C D Mean Result* SD CV (%).8..6.9..8..8.7.68.9.... 7.98.9.67.7.5.8.57.5 9.8.9.9.8.5... 9. 5.5.6..8.8.5. 9.65 6.5...9..5. 5.7 7.87 ±.6..76.69.56.8 8.5 8.7.8.6..5.5.9 8. 9..8..9..5.8 5.59.6..9...9.8 5.9.86 ±..8.6.7.5.5.8.7...57.6.. 9.57..7.7..98.6.8 7.68. +.5.9.6...8 6. 5.9..59.8.. 8.8 6.5.58.5.59.6.58..6 7..7....7 5.8 8.9 ±..8.5.9.8.7 6.8 9.6.6....8.8 6.9.5.8.5 5.5.9.75 +.9 6.6...89....8 6.6..77.7.9.7.8..6.5.9.99.76.. ±.8.9.75.5..7..7.7.5 5..59...5.6. 7. 6.5 + 6.5 7. 7.79 6. 6.8 +.77 9.75 7.5.65.8..9.. 7.6 FISH, fluorescence in situ Hybridization; DISH, dual color in situ hybridization; SD, standard deviation; CV, coefficient of variation. * : negative, +: positive, ±: equivocal Table Concordance of FISH and DISH HER amplification status based on ASCO/CAP criteria ) DISH FISH HER amplification HER equivocal HER not amplified Total HER amplification HER equivocal HER not amplified Total 7 FISH 法と DISH 法を比較検討した既報告では, 乖離率は.6~8% 5 )~ 9 ) と幅があるが, 今回の検討でも,7 症例中 6 症例で判定結果の乖離 ( 乖離率.%) がみられた. 乖離例の内訳は 例が FISH 陽性 /DISH 陰性, 例が FISH 境界域 /DISH 陰性, 例が FISH 陰性 /DISH 境界域, 例が FISH 陰性 /DISH 陽性であった. FISH 法と DISH 法で乖離のみられた原因について 考察する.DISH 法が FISH 法より過大評価になった症例については,DISH 法にて小さな銀の沈着が目立ち, 個々の不規則な小さな点を HER シグナルとして有意と評価するか, いわゆる 塵 であるのか判断が難しい症例がみられた. 特に,FISH 法と DISH 法の測定値に大きな差違がみられた Case No. では,DISH 法にて非特異的な 塵 をシグナルとしてカウントしてしまった可能性も考えられる. (6)56
a b Figure A case in which results from DISH and FISH were inconsistent (Case No. ) a: FISH results were indicative of a signal ratio of. and HER gene amplification (orange: HER, green: CEN7). b: DISH results were indicative of a signal ratio of. and HER gene non-amplification (black: HER, red: CEN7). a b Figure A case in which results from DISH and FISH were inconsistent (Case No. ) a: FISH results were indicative of a signal ratio of.5 and HER gene non-amplification (orange: HER, green: CEN7). b: DISH results were indicative of a signal ratio of.75 and HER gene amplification (black: HER, red: CEN7). 次に DISH 法が FISH 法より過小評価になった症 DISH 法ではより多くのシグナルが核内に存在すれ 例については Mansfield ら の報告のなかでは 二 ば 互いのシグナルが重なり判定しづらくなること つの要因を推察している 一つめの要因として を挙げている 特に 赤色の CEP7 シグナル数増加 FISH 法では蛍光顕微鏡フィルターを変えることに が著しい場合は 互いのシグナルが重なり黒色の よってそれぞれのシグナルを個々に評価できるが HER シグナルが正確にカウントしづらく実際より 8) 57 6
DISH 8 n = 7 r =.598 y = -.8 +.x 7 6 p<. 5 FISH Figure Scatter diagram of HER gene/cep7 signal ratios by DISH and FISH method There was a considerably correlation between the two. FISH, fluorescence in situ Hybridization; DISH, dual color in situ hybridization. 少なくカウントされた可能性がある 二つめの要因 は FISH 法に比較し 光学顕微鏡下で観察可能であ として HER 遺伝子増幅症例では CEP7 が共増幅 る点や 長期保存が可能であること 機械で自動染 coamplify する症例があり 共増幅する症例では 色できるなどの多くの利点もあるが 測定者間での HER/CEP7 比は過小に判定されることが挙げられ バラツキもあり その結果判定には注意が必要で る また CEP7 は 7 番染色体の適切な内部標準 ある ではなく 8 ), ) FISH 法では CEP7 に替わる 7 番 染色体上の別の領域でのプローブでの確認を推奨す 今後 明瞭なシグナルを得るための技術的改善や 判定の標準化などが課題である る報告がある DISH 法においても 背景の非特異 ) 的沈着を防ぐ工夫や観察や判定の容易なプローブの 検討などの技術面での改善が望まれる また HER FISH 検査は 判定法や判定者間に差 があり その標準化が課題とされ 結果の判定は複 数の熟練者で行うことが推奨されている ) 今回の 検討では DISH 法において 名の測定者間で 判 定結果に相違は確認されなかったが 測定値におい ては約 7%の症例で変動係数は %を超え 判定者 間にバラツキがみられた 複数検者での測定や目合 わせ アトラス作製などによる判定の標準化なども 必要と考える IV 結 語 乳癌での DISH 法による HER 遺伝子増幅検出 6 58 文献 ) Slamon DJ et al. : Human breast cancer : correlation of relapse and survival with amplification of the HER-/neu oncogene, Science 987 ; 5 : 77 8. ) Ross JS, Fletcher JA : The HER-/neu oncogene in breast cancer : prognostic factor, predictive factor and target for therapy, Stem Cells 998 ; 6 : 8. ) Nitta H et al. : Development of aut omated brightfield double in situ hybridization (BDISH) application for HER gene and chromosome 7 centromere (CEN 7) for breast carcinomas and an assay performance comparison to manual dual color HER fluorescence in situ hybridization (FISH), Diagn Pathol 8 ; :. ) Wolff AC et al. : American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor testing in breast cancer, J Clin Oncol 7 ; 5() : 8 5. 5) Horii R et al. Comparison of dual-color in-situ hybridization and fluorescence in-situ hybridization in HER gene amplification in breast cancer, Breast Cancer Jan. [Epub ahead of print]. 6) Schiavon BN et al. : Evaluation of reliability of FISH versus
brightfield dual-probe in situ hybridization (BDISH) for frontline assessment of HER status in breast cancer samples in a community setting: influence of poor tissue preservation, Am J Surg Pathol ; 6() : 89 96. 7) Kim MA et al. : In situ analysis of HER mrna in gastric carcinoma: comparison with fluorescence in situ hybridization, dual-color silver in situ hybridization, and immunohistochemistry, Hum Pathol ; () : 87 9. 8) Mansfield AS et al. : Comparison of fluorescence in situ hybridization (FISH) and dual-ish (DISH) in the determination of HER status in breast cancer, Am J Clin Pathol ; 9() : 5. 9) Kiyose S et al. : Chromogenic in situ hybridization (CISH) to detect HER gene amplification in breast and gastric cancer: comparison with immunohistochemistry (IHC) and fluorescence in situ hybridization (FISH), Pathol Int ; 6() : 78 7. ) Tse CH et al. : Determining true HER gene status in breast cancers with polysomy by using alternative chromosome 7 reference genes: implications for anti-her targeted therapy, J Clin Oncol ; 9() : 68 7. Technical Article Detection of HER gene amplification in breast cancer using dualcolor in situ hybridization method in comparison with fluorescence in situ hybridization Kyoko TANAKA ) Takeshi NASHIKAWA ) Hisae KOSEKI ) Kohei MORITA ) Maiko TAKEDA ) Tokiko NAKAI ) Takahiko KASAI ) Chiho OHBAYASHI ) ) Pathology Section, Nara Medical University Hospital (8, Shijo-cho, Kashihara-shi, Nara 6-85, Japan) ) Department of Diagnostic Pathology, Nara Medical University School of Medicine ) Department of Pathology and Oncology, University of Occupational and Environmental Health, Kitakyushu, Japan Summary We examined the usefulness of the dual-color in situ hybridization (DISH) method for HER gene amplification in breast cancer. We studied 7 cases of invasive breast cancer that scored + by the HER immunohistochemistry (IHC) method. We investigated the occurrence of HER gene amplification by fluorescence in situ hybridization (FISH) and DISH methods, and compared the results obtained. Four investigators carried out the determinations by the HER DISH method and the results were compared. Comparison of the results obtained by the four investigators using the DISH method showed that cases (7%) revealed a small dispersion in the HER gene/cep7 signal ratios among the investigators, but the difference in the determined results was not confirmed in any of the cases. The FISH and DISH methods for HER gene diagnosis showed uniformity in cases (78%). Inconsistencies were prevalent in 6 cases (%). The HER gene/cep7 signal ratio obtained by the DISH method significantly correlated with the result of the FISH method. Key words: Breast cancer, DISH, FISH, HER gene amplification (Received: December 7, ; Accepted: March 6, ) 59 6