Yeast one-hybrid system niimi@agr.nagoya-u.ac. jp
て い る しか し す べ て のDNA結 合 タンパク 質 が 酵 母 で 転 写 活 性 化 因 子 と して 働 く と は限 らな い この 場 合 に は VPI6やGa14の 転写活 性 化 領 域 と のfusionタ ン パ ク質 を作 る こ と に よって酵母 で転写活 性化 因子 として作用す る よ うな 工 夫 が 必 要 で あ る 以 下 に 述 べ るAの よ う に 個 々 の タ ンパ ク 質 とそ の標 的 配 列 との 相 互 作 用 を解 析 す る場 合 酵 母 の トラ ン ス フ ォ ー メー シ ョ ン法 は 効 率 よ り も 簡 便 さ を 重 視 す る 一 方 B Cの よ うな ス ク リー ニ ン グ の場 合 に は 最 も効 率 図3 One-hybridsystemの の良 い トラ ンス フォー メー シ ョン法 を用 いる3) 実験 例 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ のPax 6相 同 遺 伝 子 で あ る ま た レ ポ ー ター にHISSの よ うな 欠 損選 択 マ ー カ ー を用 い れ ば 一 一枚 の プ レー ト上 で よ り eyelessの 標 的 遺 伝 子 の 検 索 を 試 み た eyelesscdnaをactivatorplasmidに 挿 入 し 多 くの コ ロニ ー の ス ク リー ニ ン グ が 可 能 とな 標 的 と予 想 さ れ た 遺 伝 子 の 断 片(A,B,C,D) をreporterplasmidに る 挿 入 した この2種 の プ ラ ス ミ ドを コ トラ ン ス フ ォ ー メ シ ョ ン し こ こで は これ ま で に行 わ れ た 応 用 例 を 紹 この酵母が ヒスチ ジン ウ ラ シル および ト 介 し そ の 具 体 的 な 例 は 表1に ま とめ た リ プ トフ ァ ン を 欠 く ガ ラ ク トー ス の 選 択 培 地 上 で 生 育 す る か ど う か を 検 定 した そ の 結 果 Eyelessは 標 的 遺 伝 子 の 断 片AとCに A.DNA,合 結 合 す る ことが 示 された タ ン パ ク質 の 構 造 と機 能 の 解 祈 ま ず 最 初 に 大 腸 菌 のLexAが 酵 母 で転 写 因 子 と して 作 用 す る こ とが1984年 に示 され た4) も の と 推 論 さ れ る(図3) そ れ 以 後 こ の 性 質 を利 用 し LexAのDNA この結果 を確 か め る た め ヒス チ ジ ン ウ ラ シ ル お よ び ト リプ 結 合 領 域 と他 の 生 物 で 発 見 され た 転 写 因 子 と トフ ァ ン を 欠 く グ ル コ ス の 選 択 培 地 上 で 増 のfusionタ ンパ ク 質 を 酵 母 で 発 現 させ β-ガ 殖 す る か ど う か を 試 す Activator-plasmidの ラ ク トシ ダ ー ゼ の 活 性 を指 標 に転 写 因子 の機 DNA結 合 タ ンパ ク質 の 発 現 は グ ル コ ー ス に よ 能 ドメ イ ンの 検 索 が 行 わ れ た5 io) これ に よ り抑 制 さ れ る の で こ こ で 増 殖 し た も の は 酵 り 基 本 的 な 転 写 機 構 は 多 くの 生物 種 間 で保 母 の 内 在 性 タ ン パ ク質 が この 配 列 に結 合 す る 存 され て い る こ と が 示 さ れ た こ と に よ りHISSの 発 現 を 引 き 起 こ した と考 え 転 写 因子 のDNA結 合 領 域 の ア ミ ノ酸 に突 然 られ る また ヒ ス チ ジ ン ウ ラ シル お よ び 変 異 を導 入 し ど の ア ミ ノ酸 がDNAの ト リ プ ト フ ァ ン を 欠 き 5-fluoro oreticacid(5- 関 与 す るか の 解 析 も行 わ れ たIU FOA)を 結合 に 添 加 し た ガ ラ ク トー ス の 選 択 培 地 上 また ス テ ロ イ ドホ ル モ ン を培 地 に添 加 す に お い て 増 殖 し た 場 合 も 擬 陽 性 で あ る 5- る こ と に よ り 核 内 レセ プ タ ー で あ る ヒ トの FOAはURA3に エ ス トロゲ ン レセ プ タ ー が 酵 母 に お い て も よ り代 謝 さ れ る と 酵 母 の 生 育 を 阻 害 す る 毒 素 に 変 化 す る た め URA3を ホ ル モ ン の作 用 に よ っ てDNAの も つactivatorplasmidと す る こ とが 示 され たiz) は 関 係 な く増 殖 した と 2種 のDNA結 考 え られ るか らで あ る 結 合 性 を獲 得 合 タ ンパ ク質 を そ れぞ れ異 な る 欠 損 選 択 マ ー カ ー を を も つactivator 応 用例 表1に 示 した よ う に これ ま で に 様 々 な 種 plasmidに イ ン サ ー トした も の と標 的 配 列 が イ ンサ ー トさ れ たreporterplasmidと の3種 の プ ラ 類 の 転 写 因子 が 酵 母 の 中で 働 く こ とが 示 さ れ ス ミ ドを 同時 に 酵 母 に トラ ンス フ ォ ー ム す る 20
4) Brent, R. & Ptashne, M. Nature 312, 612-615, 1) Callaers, P. et. al. Ann. Rev. Neurosci. 20, in press, 1997 2) Mastick, G.S. et. al. Genetics 139, 349-363, 1995 3) Kaiser, C. et. al. ed. Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994 1984 5) Brent, R. & Ptashne, M. Cell 43, 729-736, 1985 6) Hope, I. A. & Struhl, K. Cell 46, 885-894,1986 7) Struhl, K. Cell 50, 841-846,1987 8) Lech, K. et. al. Cell 52,179-184,1988 9) Struhl, K. Nature 332, 649-650,1988 10) Samson, M.-L. et. al. Cell 57,1045-1052,1989 11) Gross, M. K. & Gruss, P. Mol. Cell. Biol.14, 238-254,1994 12) Metzger, D. et. al. Nature 334, 31-36,1988 13) Cabrera, C.V. & Alonso, M.C. BMBO.J. 10, 2965-2973,1991 14) Amati, B. et. al. Nature 359, 423-426,1992 15) Tokino, T. et. al. Hum. Mol. Genet. 3,1537-1542,1994 16) Inouye, C. et. al. DNA Cell Biol. 13, 731-742, 1994
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