大型海藻からの希少糖およびマリンポリフェノールの生産 三重大学大学院生物資源学研究科 助教三宅英雄
背景 : 新たな生物資源としての 褐藻類 褐藻類は, 水圏の中で最も物量の多いバイオマス褐藻類 1500 種の中で,64 種が利用 ( 多くは未利用 ) 褐藻類の構成多糖の中ではアルギン酸が最も多く含まれる食用での生産がほとんどない非可食性の褐藻類を養殖し利用することにより更なる発展が望める ( 食品やバイオリファイナリーなどの新産業の確立 ) 1
の取り組み シュガー プラットフォーム セルロースヘミセルロース グルコース, ガラクトース, キシロース, フコース, ラムノース, リボース, アラビノース マンニトール ブタノール コハク酸 乳酸 有機酸 非可食性大型藻類 ( 褐藻 緑藻 紅藻 ) アルギン酸 アルギン酸単糖 硫酸化多糖 硫酸化オリゴ糖 単糖 フェノール プラットフォーム ポリフェノール バイオプラスチック バイオジェット燃料 バイオマス 前処理 糖化 発酵 養殖によるバイオマスの確保 有用ポリフェノールの抽出 ( 機能性成分 樹脂原料 ) 希少糖やオリゴ糖の生産 付加価値の高い物質の生産 地域に適した海藻の育種細菌類を用いた海藻の分解と発酵付加価値の高い物質の生産 海藻バイオリファイナリーの基盤技術の開発 みえブランドの創出 2
世界初の非食用用途での海藻養殖 クロメ養殖の取り組み ( 熊本県水産研究センター, 天草漁協 五和支所との共同研究 ) クロメの収穫 ( 約 9 か月の沖出し ) 熊本県天草市 クロメの養殖現場 天草漁協 五和支所 乾燥 ( 一日半 ) クロメ乾燥チップ 企業とのコラボによる商品化 海藻養殖の技術開発ならびに用途開発に成功! フロロタンニン抽出液 ( 化粧品用 ) クロメ石鹸 3
藻類の種苗とライブラリーの開発 1. アラメ属 カジメ属褐藻類から作出した種苗 2. アオサ類の無菌培養株 これらは全て養殖用の種苗として活用できる 4
Falsirhodobacter sp. Alg1 のアルギン酸代謝経路 エンド型アルギン酸リアーゼ (AlyFRA) アルギン酸 エキソ型アルギン酸リアーゼ (AlyFRB) 非酵素的にピラノース環が開裂 不飽和オリゴ糖 ピルビン酸へ 不飽和単糖 ある種の微生物は解糖系とよく似た ED 経路を持つ 希少糖 Entner Doudoroff (ED) 経路 5
Falsirhodobacter sp. Alg1 由来の新規アルギン酸リアーゼ AlyFRA (PL-7) 0 484 aa F5/8 type C domain Signal peptide Alginate lyase superfamily 52.4 kda 切断様式エンド型分子量 52.4 kda AlyFRB (PL-15) 0 Heparinase Ⅱ/Ⅲ like domain 785 aa 89.1 kda 切断様式エキソ型分子量 89.1 kda (kda) 116 66 45 M A AlyFRA B AlyFRB 収量 ( 培地 1L 当たり ) ralyfra:4.7 mg ralyfrb:10.0 mg 多糖リアーゼのファミリー 15(PL15) はエキソ型アルギン酸リアーゼであり,DEH を生産する報告例として本酵素 (AlyFRB) 以外に 1 件のみである AlyFRB は, 機能未知の領域を多く含む新規エキソ型アルギン酸リアーゼである純度の高い組換え酵素を得ることに成功し, 大量生産することが可能 6
AlyFRA,AlyFRB の特徴 グルコースに相当する位置にスポットを検出 Glu + Mal AlyFRB P1 P2 Glu Mal P3 AlyFRA AlyFRA+AlyFRB 反応条件 : 基質 1 %(w/v) アルギン酸 Na, 反応時間 3 日間, 反応温度 37 TLC 展開溶媒 : ブタノール : 酢酸 : 水 =2:1:1 検出 :DPA 試薬 Glu:Glucose, Mal: Maltose P1:FRB の反応液, P2:FRA の反応液, P3: FRA+FRB の反応液 7
LC-MS を用いた DEH の検出 AlyFRA,AlyFRB, アルギン酸を用いた反応液の解析 50000 DEH 高純度の DEH が生じていることが分かる トータルイオンクロマトグラム ( 全てのイオンの総和 ) 30000 10000 0 8000 6000 4000 2000 0 2.5 5 7.5 10.0 12.5 15 17.5 DEH 選択的イオンモニタリングモード (m/z 175) ( 特定の質量のイオンを検出 ) 2.5 5 7.5 10.0 12.5 15 17.5 Time (min) Time (min) 他の糖化技術と比べての優位性 ( その 1) AlyFRA,AlyFRB, アルギン酸を用いた反応液には純度 95% 以上の DEH を生成することができる 8
生成物の収率 AlyFRA AlyFRB 生成物収率 (%) + - アルギン酸オリゴ糖 76.6 - ++ DEH 31.7 + + DEH 84.3 + ++ DEH 86.5 + +++ DEH 86.8 AlyFRA or/and AlyFRB -: 0 mg/ml, +:0.20 mg/ml, ++:0.40 mg/ml, +++:0.60 mg/ml, 基質 1.0 %(w/v) アルギン酸 Na, 37, 3 日 他の糖化技術と比べての優位性 ( その 2) 少なくとも 84% 以上の収率で DEH を生成することができる 9
希少糖としての DEH アルギン酸オリゴ糖は販売されているいるが 単糖である DEH は販売されていない DEH は, アルギン酸代謝経路を持つアルギン酸資化性微生物のみ生成される アルギン酸資化性微生物から中間生成物である DEH のみを取り出すのは困難であり, 希少性が極めて高い DEH は,FDA の GRAS 物質にリストアップされているアルギン酸からのみ得られる単糖であり, 安全性が高いと考えられる DEH は陸上植物の代表的な構成糖であるグルコースと同じような位置づけであり, 将来 DEH を大量生産することができれば大型藻類を用いてバイオリファイナリーを行うことができる 10
マリンポリフェノール 11 アラメ属 カジメ属褐藻類は, フロロタンニン類と呼ばれるポリフェノール類を生産 H H Eckol H H H Fucofuroeckol A H H Phlorofucofuroeckol A H H H Dieckol H H H H 8,8 -Bieckol H Phloroglucinol 基本となる化合物フロログルシノール
マリンポリフェノールの単離と生理能の解析 サンプル Phloroglucinol RAC (mol TE/ mol)* 2.57 ± 0.14 フロロタンニン類 Eckol Fucofuroeckol A Phlorofucofuroeckol A Dieckol 8,8 -Bieckol 4.97 ± 0.36 9.82 ± 0.70 8.97 ± 0.89 10.22 ± 0.85 8.62 ± 0.92 既存の抗酸化物質よりも高い抗酸化能 抗酸化物質ビタミン C( L-Ascorbic acid) カテキン類 (EGCG) ブドウ ポリフェノール (Resveratrol) 0.76 ± 0.24 4.65 ± 0.80 7.18 ± 0.24 *The data is expressed as the mean ± standard deviation from three independent measurements. Food Nutr. Sci., 4, 78-82 (2013). 12
従来技術とその問題点 DEH アルギン酸資化性微生物から中間生成物である DEH のみを取り出すのは困難であり, 広く利用されるまでには至っていない マリンポリフェノールこれまで, ポリフェノール類の利用については, カテキン等, 陸上植物に含まれる化合物が対象となっており, 海藻をはじめとする水生植物由来の化合物の例はほとんど無い 13
新技術の特徴 従来技術との比較 DEH AlyFRA,AlyFRB, アルギン酸を用いた反応液には純度 95% 以上, 少なくとも 84% 以上の収率で DEH を生成することができる マリンポリフェノール多彩な生理機能を持つ新規ポリフェノール類を含水アルコールで容易に抽出できる 抗酸化性をはじめ生理機能を解析すると, 陸上植物の活性を凌駕することが多い 14
想定される用途 DEH 機能性食品 ( プレバイオティクス効果 ) DEH を原料とした新素材や燃料 ( バイオリファイナリー ) マリンポリフェノール機能性食品 ( 抗酸化性, 抗アレルギー性 ) 化粧品 ( 抗酸化性, 抗アレルギー性 ) 15
実用化に向けた課題 DEH 組換え体における大量生産は可能 食品として利用するには Native な菌 (Falsirhodobacter sp. Alg1) の大量培養が必要 新規化合物として様々な試験が必要 マリンポリフェノール抽出および単離する方法は確立済み 大量生産するためには褐藻類の養殖が必要 16
企業への期待 様々なスクリーニング技術を持つ企業との共同研究を希望 食品, 医薬品, 化粧品, 素材への展開を考えている企業には, 本技術の導入が有効と思われる 17
本技術に関する知的財産権 発明の名称 : アルギン酸リアーゼ及び当該酵素を用いる不飽和ウロン酸単糖の製造方法 出願番号 :PCT/JP2017/013871 出願人 : 三重大学 発明者 : 柴田敏行 三宅英雄 田中礼士 村瀬祥光 モリテツシ 竹山春子 高橋真美 18
お問い合わせ先 国立大学法人三重大学 地域イノベーション推進機構 知的財産統括室 TEL FAX e-mail 059-231-5495 059-231-9743 chizai-mip@crc.mie-u.ac.jp 19