柿渋由来ゲルを用いたカフェンの選択的除去

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けいざぶろうふじつぐ
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1 H.24 年度前期雑誌会 1 Critical Factors of Vanillin Assay for catechins and Proanthocyanidins カテキンとプロアントシアニジンに対するバニリン試験の決定因子著者 : Baoshan Sun, Jorge M. Ricardo-da-Silva, and Isabel Spranger 雑誌 : J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 紹介者 : 秋元美桜 (M2) 紹介日 :

2 I n t r o d u c t i o n 2 プロアントシアニジン (PA) 自然界に広く存在する天然高分子構成ユニットはflavan-3-ol( カテキン類 ) 植物由来食品で栄養や感覚刺激特性に関して重要な役割を担う様々な生理活性を有する ( 抗動脈硬化作用抗酸化作用 ) カテキン類 (flavan-3-ol) B H H A C (+)-Catechin [(+)-C] ( )-Epicatechin [( )-EC] H R 1 4 R 2 Flavan-3-ol PA 含有量の評価 3 subunit B H Folin-Ciocalteu 法 R 1 n A C 6 3 塩酸 -Bu 分解 R C バニリン試験 H 8 R 1 G: Galloyl R 2 R 1 = H or R 2 = H or G

3 I n t r o d u c t i o n 3 PA 含有量の評価法 Folin-Ciocalteu 法フェノール性基の還元力に基づく試験法特異性が低いそれぞれの基は感度が異なる Folin-Ciocalteu 試薬 3H 2 P W 3 5Mo 3 10H 2 3H 2 P W 3 4Mo 3 10H 2 フェノール性化合物 e - Basic condition 有色化合物 λ max 750 nm 塩酸 -Bu 分解熱酸溶液中で PA をアントシアニジン (λ max 550 nm) へ分解 PA に非常に特異的完全に分解せず収率は PA の重合度と構造の影響を受ける副反応としてポリマー (λ max 450 nm) の生成が起こる H R 1 H R 1 アントシアニジン λ max 550 nm H R 2 R 1 HCl / butanol Fe 3+ heat + R 2 R 2 R 1 = H or R 2 = H or galloyl H R 2 R 1

4 I n t r o d u c t i o n 4 バニリン試験芳香族アルデヒドバニリンとの反応により有色化合物 (λ max 500 nm) を得る H + H H + H meta- 配向ジフェノール Catechin Vanillin Vanillin adduct λ max 500 nm (Hagerman, 2002) Flavanol( モノマーおよび多量体 ) meta- 配向のヒドロキシ基を持つ dihydrochalcone (Sarkar and Howarth, 1978) 感度特異性簡便さの点で優れている再現性の欠如が示唆されている研究目的反応に影響するファクター正確性と再現性について確かめる適切な反応条件を提案

5 E x p e r i m e n t a l 5 H Catechin + H Vanillin H + Me H Vanillin adduct λ max 500 nm 試料または標準物質 (120 mg/l Me 溶液 ) カテキン類 PA Grape seed より抽出 H H 1 (+)-Catechin [(+)-C] 2 ( )-Epicatechin [( )-EC] 3 PAオリゴマー 4 PAポリマー重合度 : 2 ~ 重合度 : >12-15 試薬 a: バニリン / Me 試薬 b: HCl or H 2 S 4 / Me FACTRS 試料溶液 1 ml 120 mg/l 試薬 a 2.5 ml %(w/v) ( % (w/v)) 試薬 b 2.5 ml 9.0 N ( N) 5-35 ºC 0-30 分 UV-Vis analysis バニリン濃度酸の種類と濃度反応温度反応時間含水量妨害物質

6 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 6 1-1) 酸濃度の依存性 ((+)-C) Figure 1. Standard curves of (+)-catechin for vanillin assay established at various HCl concentrations. Each point is a mean of three replicate measurements ± SD. Figure 2. Standard curves of (+)-catechin for vanillin assay established at various H 2 S 4 concentrations. Each point is a mean of three replicate measurements ± SD. 良い線形性 (R 2 > 0.998) 酸の規定度が増加するにしたがい A 500 が増加 A 500 (HCl) << A 500 (H 2 S 4 ) 酸触媒的な働き目的としている反応の進行バニリンの自己反応 PA の分解酸濃度は高いほど応答は良いが極端に高濃度は避けるべきである

7 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 7 1-2) 酸濃度の依存性 (PA) Figure 3. Standard curves of purified oligomeric PA for vanillin assay established at various HCl concentrations. Each point is a mean of three replicate measurements ±SD. Figure 4. Standard curves of purified oligomeric PA for vanillin assay established at various H 2 S 4 concentrations. Each point is a mean of three replicate measurements ±SD. R van/cat と比べ酸濃度による影響は小さい ( 直線の傾き変化 ) R van/cat と比べ酸の種類による影響は小さい (Fig.3, 4 の吸光度変化 ) A 500 (HCl) < A 500 (H 2 S 4 ) Butler ら (1982) は反応感度と再現性の改善のため溶媒をメタノールから氷酢酸に変更溶液中の酸性度

8 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 8 2) 反応時間 Figure 5. Effect of reaction time on A 500 of vanillin reaction with (+)-catechin. (+)-Catechin concentration = 120 mg/l. Each point is a mean of three replicate measurements ±SD. Figure 6. Effect of reaction time on A 500 of vanillin reaction with purified oligomeric PA. Purified oligomeric PA concentration = 120 mg/l. Each point is a mean of three replicate measurements ±SD. 反応は速く A 500 は反応時間に因らずほぼ安定極大値が見られる ( 反応は遅く退色もしやすい ) 酸濃度 : 高いほど値が安定反応時間 : 分反応時間 : A 500 が極大値をとる時間酸濃度 : 高いほど良い

9 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 9 3) 反応温度 PA 温度に依存しない反応温度 : R.T. (+)-C A 500 は温度に依存する反応温度 : ºC に固定反応溶液をさらに異なる温度で 10min インキュベーションしたとき A 500 が異なる値を与え温度と A 500 の関係は Fig. 7 と一致反応は 5-35 ºC の範囲で可逆的参考 ) バニリン反応の可逆性 (Dalby and Shuman, 1978) Figure 7. Effect of reaction temperature on A 500 of vanillin reaction with (+)-catechin and purified oligomeric PA. Concentrations: (+)-catechin = 120 mg/l; purified oligomeric PA = 120 mg/l. Each point is a mean of three replicate measurements ±SD.

10 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 10 4) 水分水分量の増加に伴い A 500 が著しく減少溶媒 : 無水メタノール 3%(v/v) 水 (+)-C: 56 59% 減少 PA: 33 38% 減少 Levasseur の理論 (Cabannes, 1953) 有機溶媒中の実質的な ph は溶液中の水の量に強く依存 H 2 S 4 と HCl が同じ規定度の場合 A 500 (H 2 S 4 ) > A 500 (HCl) Figure 8. Effect of water content in reaction medium on A 500 of vanillin reaction with (+)-catechin and purified oligomeric PA. Concentrations: (+)-catechin =120 mg/l; purified oligomeric PA = 120 mg/l. Each point is a mean of three replicate measurements ±SD. H 2 S 4 ( 市販 ) 純度 96 98% 水 2-4% HCl( 市販 ) 純度 35 37% 水 63 65% 大量の水を含む低い吸光度の原因しかしながらカテキンと PA で影響が異なることは説明できない

11 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 11 5) バニリン濃度反応を完全に進行させるためにバニリンは試料に対して過剰量が必要 > 1 %(w/v) でそれ以上増加しない高濃度で自己縮合反応の可能性 (Broadhurst and Jones, 1978) %(w/v) が推奨される参考 ) Figure 9. Effect of vanillin concentration in reagent a on A500 of vanillin reaction with (+)-catechin and purified oligomeric PA. Concentrations: (+)-catechin = 120 mg/l; purified oligomeric PA = 120 mg/l. Each point is a mean of three replicate measurements ±SD. 試薬 a (1 %(w/v), 2.5mL) 10 g / L 2.5mL 27.4mM g / mol 6.0 ml カテキン溶液 (120 mg/l, 1.0 ml) 120mg / L 1.0 ml mM g / mol 6.0 ml 397 倍

12 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 12 6) 標準化合物 Figure 2. Standard curves of (+)-catechin for vanillin assay established at various H 2 S 4 concentrations. Each point is a mean of three replicate measurements ± SD. Figure 4. Standard curves of purified oligomeric PA for vanillin assay established at various H 2 S 4 concentrations. Each point is a mean of three replicate measurements ±SD. カテキンと PA ではバニリンとの反応性が異なるカテキンを標準として用いると PA の定量が正確に行えない

13 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 13 6) 標準化合物サンプル試験 Grape seed のメタノール抽出物からあらかじめカテキン類を除去したサンプル 2 種 (PA オリゴマーを豊富に含む ) それぞれの検量線を用いて計算した PA 濃度 (PA オリゴマー換算濃度カテキン換算濃度 )

14 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 14 吸光度 A500 は試料濃度 [C] および酸濃度 [H + ] に依存しているので A 500 カテキン : A f ([ C][ H ]) [C] : 試料濃度 (mg/l) [H + ] : 試薬 b 中の硫酸濃度 (5-25 %(v/v), N) PA: (1) 0.02[ C] cat[ H ] ( R 0.989, n 20) 500 A [ C] pro([ H ] ) ( R 0.995, n 20) (2) (3) 一方同じ濃度のカテキンと PA オリゴマーが同じ A 500 を与える酸濃度 [H + ]* を計算すると [ C] cat [ C] pro, A500 A500 d A d A [ C] cat[ H ]* [ C] pro([ H ]* ) [ H ]* ([ H ]* ) [ H ]* % より (7) (8) (9) カテキンとPAが同じ濃度ときすなわち [ C] cat [ C] pro [ C] のとき酸濃度依存性はカテキン : PA: 式 (4) (5) より d A d [ H d A d [ H d A d [ H 0.02[ C] ] [ C] ] 500 ] d A d [ 500 H 3.48 ] (4) (5) (6) カテキンの反応は PA の反応の 3.5 倍酸濃度の影響を受けやすい硫酸濃度を 10.6%(ca. 3.6 N) に設定するとカテキンと PA を同等に扱うことが出来る PA 含有量を過大に見積もる ; 3.3%(v/v) HCl (Price et al., 1978) PA 含有量を小さく見積もる ; 46.7%(v/v) H 2 S 4 (Scalbert et al., 1989, Scalbert., 1992) 2 つの矛盾する主張は A 500 の酸濃度の依存性によって説明できるもしくは塩酸中の水の影響その一方で呈色の安定性と感度の観点よりあらかじめサンプル中のカテキン類とPAを分離し別々に高濃度のH 2 S 4 を用いて定量することがしばしば必要になる

15 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 15 7) 妨害物質アスコルビン酸アスコルビン酸塩 - 2H 反応を妨害酸化力の強い H 2 S 4 と反応していると考えられる非常に酸化を受けやすいアントシアニジン ( nm に吸収 ) バニリンとは反応しないが吸収帯が重なる適切なブランクを用いることで対処可能 H フェノール酸 H H H H H H H ケイ皮酸 p- ヒドロキシ安息香酸カフェ酸没食子酸 p- クマル酸シリング酸非フラバノール H H H ケルセチンケンペロールミリセチンバニリンとは反応しない反応の妨害もしない

16 C o n c l u s i o n 16 バニリン試験 (1) 試料中のPAからカテキンの分離しそれぞれに対し定量を行う (2) 溶媒には無水メタノールを用いる (3) H 2 S 4 濃度を Nにしその濃度を厳重にコントロールする (4) 検量線の作成に試料と同種のPAを標準品に用いる (5) 妨害物質を除去し適切なブランクを使用する (6) カテキン量の推定において反応温度を制御し反応時間は15 分に固定する PA 量の推定では反応は室温で行い A 500 が最大となる時間を反応時間とする

18 H A H C A B B C H A H H C B H H H A C H B 18 (4 8) (4 6) (2 7, 4 8) B-type proanthocyanidin A-type proanthocyanidin Structure of dimeric proanthocyanidins H H H H H + H + H H + H + oxidation Anthocyanidin Catechin dimer (Proanthocyanidin) Hypothetical reaction mechanism explaining the acid-catalyzed cleavage of proanthocyanidins H Catechin

19 H + H H H H H H + H -H 2 H 19 Hypothetical reaction mechanism explaining the reaction of vanillin with (+)-catechin H H H H H + H + H xidation H + H H + H H

20 Charge distribution of (+)-catechin 20 DFT B3LYP Mulliken

21 Y (Absorbance) Y (Absorbance) λ max 499 nm 試料 : μg/ml (+)-catechin monohydrate 硫酸バニリン添加室温 15 分反応 25 ppm (+)-catechin 50 ppm (+)-catechin 100 ppm (+)-catechin Wavelength (nm) λ max 504 nm 試料 : μg/ml FDPT(110830) 硫酸バニリン添加室温 15 分反応 25 ppm FDPT 50 ppm FDPT 100 ppm FDPT Wavelength (nm)

22 Absorbance Absorbance λ max 539 nm cf.) Acid-butanol assay 試料 : μg/ml FDPT(110830) 硫酸添加バニリン不添加室温 15 分反応 0 ppm FDPT (control) 25 ppm FDPT (control) 50 ppm FDPT (control) 100 ppm FDPT (control) 100 ppm FDPT (control) 4 day Wavelength (nm) Acid-butanol assay 0.8 室温における酸分解速度は遅い硫酸バニリン試験においてアントシアニジンは生成しない FDPT 0.6 N HCl / 1-butanol, Fe 3+ Heat at 100ºC, 50 min Wavelength (nm)

23 23 H H H H H H H H H H H H

24 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 24

スライド 1

スライド 1 Detection of bound phenolic acids: prevention by ascorbic acid and ethylenediaminetetraacetic acid of degradation of phenolic acids during alkaline hydrolysis ( 結合フェノール酸の検出 : アルカリ加水分解中のアスコルビン酸と EDTA によるフェノール酸の劣化防止