はじめに液体クロマトグラフィーには表面多孔質粒子の LC カラムが広く使用されていますこれらのカラムは全多孔質粒子カラムの同等製品と比べて低圧で高効率ですこれは主に物質移動距離がより短くカラムに充填されている粒子のサイズ分布がきわめて狭いためですカラムの効率が高いほど分析を高速化で

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みちしげたみや
5 years ago
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1 アプリケーションノート食品 / 飲料品検査発酵モニタリング農薬バイオ燃料代替エネルギー Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z カラムによる糖の分析著者 Anne Mack and Ta-Chen Wei Agilent Technologies, Inc. 概要 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z カラムを用いてグラジエントとイソクラティック溶出における 11 種類の糖化合物を分離しました ph および温度がグルコースのアノマー分離に与える影響について調べました高 ph と低温を組み合わせることがピーク形状とカラム寿命の両方に対する最適なソリューションであるという結果が得られました最終の分離では水酸化アンモニウムを 35 C で使用しました

2 はじめに液体クロマトグラフィーには表面多孔質粒子の LC カラムが広く使用されていますこれらのカラムは全多孔質粒子カラムの同等製品と比べて低圧で高効率ですこれは主に物質移動距離がより短くカラムに充填されている粒子のサイズ分布がきわめて狭いためですカラムの効率が高いほど分析を高速化できるだけでなく分離能と感度が向上しより信頼性の高い結果が得られます今日まで表面多孔質粒子は主に逆相分離に重点を置いて使用されてきました表面多孔性粒子技術が成熟したため親水性相互作用液体クロマトグラフィー (HILIC) のようなケミストリとクロマトグラフィー手法向けのアプリケーションが使用できるようになっています HILIC は極性対象化合物の分析に最適ですがこの化合物は逆相モードで保持および分離するのが困難な場合がありますこのアプリケーションノートでは Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 2.7 μm カラムの UHPLC 性能とグラジエントとイソクラティック溶出による 11 種類の糖化合物の分離能力について説明します InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z では堅ロールとデータ処理には Agilent OpenLab 牢なハイブリッド粒子に結合された新しい両ソフトウェアを使用しました表 1 に使用し性イオン型固定相を使用しますこの相は最たクロマトグラフィーメソッドを示しますすべ大 C および最大 ph 12 まで安定していての化合物は個別の標準として注入しましたますまたこの相は幅広い極性にわたる分表 2 に濃度とサンプル溶媒を示します析対象物を分離できます HILIC-Z 相が持つ分析した 11 種類の糖化合物は Sigma- これらの特徴は分析困難な高 ph 分離に最適 Aldrich から購入しましたギ酸アンモニウムであり堅牢な 1 つのソリューションを提供しギ酸酢酸アンモニウムおよび水酸化アンモますニウムも Sigma-Aldrich から入手しました実験方法この研究では Agilent 1260 Infinity バイナリ LC と Agilent G4218A を使用しましたシステムでの分散を最小限にするためにすべての接続キャピラリーの長さを短くし内径を 0.12 mm にしましたシステムのコント表 2. サンプル前処理および注入量糖溶媒組成注入量 (μl) キシロース CH 3 O (9:1) 0.1 アラビノース CH 3 O (9:1) 0.1 フルクトース CH 3 O (9:1) 0.1 マンノース CH 3 O (9:1) 0.2 グルコース CH 3 O (9:1) 0.4 ガラクトース CH 3 O (9:1) 0.4 スクロース CH 3 O (9:1) 0.5 マルトース CH 3 O (9:1) 1.0 ラクトース CH 3 O (9:1) 1.5 マルトトリオース CH 3 O (9:1) 3.0 ラフィノース CH 3 O (9:1) 7.0 アセトニトリルは Honeywell (Burdick and Jackson) 製のものです水は Milli-Q システム (Millipore 社 ) で精製し 0.2 µm フィルタでろ過した分子量 18 のものを使用しました表 1. メソッドパラメータメソッド A B の組成水 (ml/min) カラムカラム温度 ( C) 設定 mm ギ酸アンモニウム図 1 水溶液 ph 4.5 mm 酢酸アンモニウム水溶液 ph 7.0 アセトニトリル 12 分で 95~ %B 3 分間再平衡 0.4 他社製 HILIC カラムまたは 30 Hz 0.6 % 水酸化アンモニウム水溶液図 2 図 % 水酸化アンモニウム水溶液 mm 酢酸アンモニウム水溶液 ph % 水酸化アンモニウム水溶液 35 アセトニトリル 90 % B イソクラティック Hz Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 0.3 % 水酸化アンモニウム 6 分で 85~60 %B 0.4 アセトニトリル溶液 3 分間再平衡 (p/n ) Hz 図 % 水酸化アンモニウム水溶液 0.3 % 水酸化アンモニウムアセトニトリル溶液 % B イソクラティック Hz 2

3 結果と考察糖は多数の化合物でアノマー分離が発生するため HPLC で分析するのが困難な場合があります図 1 はグルコースのアノマー分離が高 ph 高温またはそれらの組み合わせのいずれかで制御できることを示していますシリカベースの LC カラムの場合これらの条件は厳しいものでありカラム寿命に悪影響を与える可能性があります H 2 O, 35 C ph 4.5, 35 C ph 4.5, C PW = ph ph 7.0, 40 C PW = ph 7.0, C PW = ph ~10.8, 35 C PW = A) 変動 B) CH 3 CN グラジエント 12 分で 95~ %B 温度 Varies 変動カラム 2.1 mm 他社製の HILIC カラム温度図 1. ph および温度がグルコースのアノマー分離に与える影響 3

4 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 粒子はハイブリッド粒子への独自の両性イオン結合から生成されており高 ph で安定性が増します図 2 では糖分析に適したメソッド条件の下で Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z カラムの寿命を評価しています高 ph と低温を組み合わせることにより 14,000 までのカラム容量において性能は低下していません高温を中程度の ph と組み合わせても狭いピーク幅と低い背圧が達成されますがこれらの条件ではカラムの劣化が加速されてしまいます InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z カラムでは高 ph と低温を組み合わせることにより糖分析用のより堅牢なメソッドが実現します図 3 はグラジエント溶出と高 ph を用いて InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z カラムで 11 種類の糖を分離した結果を示していますすべての化合物においてピーク形状は優れており水酸化アンモニウム (ph ~ 10.8) と 35 C のカラム温度を用いたアノマー分離は適切に制御されていました 2 つの重要なペアであるキシロース / アラビノースおよびグルコース / ガラクトースはベースライン分離されていませんでしたがこれらの分離はカラムと分析時間をともに長くすることにより改善される可能性があります図 4 は糖ではイソクラティック分離も使用できることを示しています図 3 はグラジエント分析とほぼ同じ時間でイソクラティック分離が達成されたことを示していますただし溶出時間が早い化合物では十分に良好な分離能が達成されず溶出時間が遅い化合物では十分に高い感度が達成されていませんこのように小さな問題は存在しますがグラジェント溶出が使用できない糖分析においてイソクラティック分離は適切に機能しています RI 検出器のフローセルは高 -ph では使用できません RI 検出が必要な場合は中程度の ph と高温を組み合わせて使用しますその他すべてのメソッドパラメータを一定に保つことにより類似した選択性が実現すると推測されます A 高 ph (~10.8) 低温 (35 C) B 中程度 ph (7.0) 高温 ( C) 120 フルクトース 120 フルクトース 115 グルコーススクロース 115 グルコーススクロース 110 マルトース 110 マルトースリテンションタイム (%) リテンションタイム (%) ,000 4,000 6,000 8,000 10,000 12,000 14, ,000 4,000 6,000 8,000 1,0000 1,2000 1,4000 カラム容量カラム容量 A) 0.3 % 水酸化アンモニウム B) CH 3 CN グラジエント 90 %B 温度 35 C A) mm 酢酸アンモニウム ph 7.0 B) CH 3 CN イソクラティック 90 %B 温度 C 図 2. 高 ph 対高温の糖分析における 2.7 µm Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z LC カラムの寿命の比較 4

5 mv A) 0.3 % 水酸化アンモニウム H 2 O 溶液 B) 0.3 % 水酸化アンモニウム CH 3 CN 溶液グラジエント 6 分で 85~60 %B 温度 35 C キシロース 2. アラビノース 3. フルクトース 4. マンノース 5. グルコース 6. ガラクトース 7. スクロース 8. マルトース 9. ラクトース 10. マルトトリオース 11. ラフィノース分図 3. Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z LC カラムにおける 11 種類の糖化合物のグラジエント分離 mv A) 0.3 % 水酸化アンモニウム H 2 O 溶液 B) 0.3 % 水酸化アンモニウム CH 3 CN 溶液イソクラティック %B 温度 35 C 1. キシロース 2. アラビノース 3. フルクトース 4. マンノース 5. グルコース 6. ガラクトース 7. スクロースマルトース 9. ラクトース 10. マルトトリオース 11. ラフィノース分図 4. Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z LC カラムにおける 11 種類の糖化合物のイソクラティック分離 5

6 結論 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z カラムは糖の分離に最適ですこのカラムはすべての化合物において良好な分離能とピーク形状を達成し高 ph 条件下において優れた寿命を有しますホームページカストマコンタクトセンタ本製品は一般的な実験用途での使用を想定しており医薬品医療機器等法に基づく登録を行っておりません本文書に記載の情報説明製品仕様等は予告なしに変更されることがありますアジレントテクノロジー株式会社 Agilent Technologies, Inc Printed in Japan, January 30, JAJP

細辛 (Asari Radix Et Rhizoma) 中のアサリニンの測定 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C µm カラムアプリケーションノート製薬著者 Rongjie Fu Agilent Technologies Shanghai

細辛 (Asari Radix Et Rhizoma) 中のアサリニンの測定 Agilent InfinityLab Poroshell 2 EC-C8.9 µm カラムアプリケーションノート製薬著者 Rongjie Fu Agilent Technologies Shanghai 概要細辛 (Asari Radix Et Rhizoma) 中の活性化合物アサリニンをサブ 2 µm の Agilent