2. 目的 1985 年に MIT の Hatton らにより, 逆ミセルにタンパク質の抽出能力があることが示された. 液液抽出操作は, 連続操作が可能でスケールアップが容易なことから, 実用化への期待も高まり,1985 年以降タンパク質の分離場としての逆ミセルに関する研究が盛んに行われてきている.

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ふじきみつねざき
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1 東京理科大学 Ⅰ 部化学研究部 2013 年度輪講書逆ミセルによる変性タンパク質のリフォールディング Masanori.N(3K) 土曜班 1. 背景近年, 遺伝子組換え技術の発展に伴って開発された組換えタンパク質の調製システムは, さまざまな宿主を用いた発現系あるいは無細胞タンパク質合成系により目的の機能をもつタンパク質を大量に調製することが可能であり, 簡便かつ安価であるので, 研究だけでなく工業的にも広く用いられている. ところが, このような生細胞発現システムにおいて, 目的タンパク質が大量に発現してしまうと, 菌体内で非天然型の不活性な凝集体, いわゆる inclusion body の形成が起こり, 可溶性画分として得られないことがしばしばある 1). 一般に,inclusion body を可溶化するためには, 高濃度の強力な変性作用をもつ物質 ( 塩酸グアニジンや尿素など ) が用いられ, そこから可溶化剤 ( 変性剤 ) を除去することにより, タンパク質の折りたたみ反応 ( リフォールディング ) を進める. その方法として, 工業的には希釈法や透析法が広く用いられている. 希釈法の場合は, 可溶化剤の変性作用が働かなくなるまで溶液を大希釈し, それにより変性タンパク質の自発的な折りたたみを促進する手法であるが, 急激な希釈はタンパク質を取り巻く可溶化剤を除去し, 急激に分子間の疎水性相互作用を促進してしまうことがあり, 高効率のリフォールディング操作が行えない場合がある. 加えて, 必要とされる希釈倍率は数十から数百倍であるため, 工業的スケールでリフォールディング操作を行う場合, 莫大な量の溶液を要するだけでなく, その後の濃縮操作が必要となる. 一方, 透析法の場合は, 可溶化剤の濃度をゆっくり低下させることができるが, タンパク質をより長く折りたたみ中間状態に置くこととなり, 折りたたみ中間体から凝集に向かいやすいタンパク質の類は, 添加剤を加えるなどの工夫をしない限り, 再凝集を抑制できないという問題がある 2). 現在, これらの問題に際して, 透析法や希釈法に代替する新たなリフォールディング法の開発が望まれており, ベシクルや逆ミセル, 有機ナノチューブゲル 3) などのナノ集合体内部に変性タンパク質を隔離してリフォールディングを促進する技術開発が行われているが, いまだ工業的規模での実用化の段階には至っていない. ところで, 生体内ではアンフォールドなタンパク質の折りたたみを介助するシャペロニンというタンパク質群が存在し, これがポリペプチド一個体をナノ空間に隔離して, フォールディングのための安全な空間と時間を提供している. そこで土曜班は, リン脂質を用いた逆ミセルの閉鎖的なナノ球状空間に着眼し, シャペロニンの内部環境を模倣した逆ミセルおよび工業的実用性のある高効率なリフォールディング法の開発を試みる. 1

2 2. 目的 1985 年に MIT の Hatton らにより, 逆ミセルにタンパク質の抽出能力があることが示された. 液液抽出操作は, 連続操作が可能でスケールアップが容易なことから, 実用化への期待も高まり,1985 年以降タンパク質の分離場としての逆ミセルに関する研究が盛んに行われてきている. しかしながら, その多くがカチオン性界面活性剤を原料としたものであり, ポリペプチドに対して穏和なアミノ酸残基で覆われたシャペロニン内部の環境を模倣した逆ミセルの研究は数少ない. そこで, 本研究では生体膜原料としての近似度の高い DPPC(Dipalmitoylphosphatidylcholine) および DPPS(Dipalmitoylphosphatidylserine) を用いて, それらの組成比を最適化した逆ミセルの開発と新たな工業的規模でのリフォールディング法の提案を目的とする. 3. 原理 3.1 シャペロニンの構造と作用機構 4),5) Fig.3.1 に大腸菌由来のシャペロニン GroEL/GroES の立体構造を示した.GroEL( 図中の赤, 緑 ) は 7 つのサブユニット ( 分子量 57K) からなる洞穴状のリングが互いに出入り口を背に結合した十四量構造をとっており, リングの内径は約 45A である. 尚, リングが形成する空間は上のリング ( シスリング ) と下のリング ( トランスリング ) の 2 カ所に位置しているが互いに行き来することはできない. 構造は大きく分けると, フォールディング中の基質タンパク質や GroES と相互作用する頂上ドメイン,ATP と結合して加水分解する赤道ドメイン, これらのドメインをつなぐ中間ドメインの 3 つからなる. 一方 GroEL の補佐役となる GroES( 図中の青 ) は分子量 10K のサブユニットの七量体でドーム状の構造をとっており, 複合体では蓋の役割を果たしている. Fig.3.2 に GroEL/GroES の作用機構の概略図を示した. まず変性タンパク質の疎水性領域及び水素結合のドナーやアクセプターが GroEL の頂上ドメインに結合した後,ATP の結合とともに GroES が頂上ドメインに結合してシス型三者複合体を形成する. 次に ATP が加水分解され,GroEL と GroES で囲まれたゆりかご空間に変性タンパク質が放出される. この密室は 50~60K の分子量のタンパク質を収容できるほど大きく, 内壁はタンパク質にやさしい親水性のアミノ酸残基で覆われている. この空間内で変性タンパク質が正しく折り畳まれた後, 新たな ATP がトランスリングに結合し,GroES の蓋が開き, 活性を取り戻したタンパク質が徐放される. 2

次いで, 可溶化剤により変性タンパク質を溶解させた溶液を噴霧し, ナノスケールのミストを油中に滴下して乳化させると, 油中水滴に対して直ちに両親媒性分子はその頭部 ( 親水性セグメント ) を内部に向けて逆ミセルを形成し, ナノオーダーの水滴 (water pool)

3 (A) (B) Fig.3.1 大腸菌のシャペロニン複合体 (GroEL/GroES) の構造 (A) 横から見た図.(B) 上から見た図. 変性タンパク質 GroES ADP ATP ATP ATP ADP ADP ATP ATP ATP Fig.3.2 GroEL/GroES の作用機構 5) 3.2 逆ミセルの製法およびタンパク質の徐放システムまず, サンプル容器内に水平な油水界面を形成させる. このとき, 油相に両親媒性分子を溶解させておくことにより, 油水界面は直ちに両親媒性分子の膜に覆われることとなる. 次いで, 可溶化剤により変性タンパク質を溶解させた溶液を噴霧し, ナノスケールのミストを油中に滴下して乳化させると, 油中水滴に対して直ちに両親媒性分子はその頭部 ( 親水性セグメント ) を内部に向けて逆ミセルを形成し, ナノオーダーの水滴 (water pool) を安定な状態で油中に分散させることができる. やがて Fig.3.3 に示すように重力によって逆ミセルは油水界面に到達し, 界面を越え, 水相へと移行して脂質二重膜のベシクルを形成する 6). このとき, 水相にあらかじめアルブミンが塩析しない程度の金属イオン (Ca 2+ など ) を添加し 3

4 ておくと, イオンは油水界面にある両親媒性分子の頭部に結合した状態となるため, 逆ミセルからベシクルへの転移と同時に, イオンによる表面電荷反発と立体反発の協同効果によるベシクルの破壊が生じる. これにより, 逆ミセル内の waterpool に封入したタンパク質の徐放を達成することができるだけでなく, 破壊されたベシクルを構成していた両親媒性分子が油水界面に再生されることが期待される 7). P il P Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ P Ca 2+ Ca 2+ Water Ca 2+ Fig.3.3 ベシクル膜の破壊とタンパク質の放出 Ca 2+ Ca 相転移を利用した内包物の高効率徐放 8) リン脂質を水和水以上の過剰濃度の水に混合すると, 脂質二分子膜を基本単位とする分子集合体ができる. このとき, 構成単位中の炭化水素基は分子間力によって, 横方向に互いに平行に並び, 副格子とよばれる凝集構造を形成する. このような分子集合体を温度変化させることにより, 異なるいくつかの会合状態の間に相転移現象が見出された. その代表例を Fig.3.4 に模式化する. 分子モデルで頭部が極性基, 尾部が疎水基にあたる.L c 相, L β 相,P β 相はゲル相で, 炭化水素鎖は結晶上になっており, 各々特定のパッキング構造をとっている.L α 相は 2 分子層の液晶相で, 極性基は平面上にパッキングし, 液体状の炭化水素基が水相から隔絶した疎水環境を満たしている. L c L β ' P β ' L α Fig.3.4 脂質の代表的なリオトロピック液晶多形 4

5 Fig. 3.5 に DPPC を水に分散した後,0 から 4 の温度範囲に 2 カ月保持して形成した L c 相から, 液晶状態の L α 相までの転移過程の DSC ピーク,X 線回折によるラメラ間隔と短面間隔, そして炭化水素基の副格子の変化を示す.L c L β を副転移 (sub-transition),l β P β を前転移 (pre-transition),p β L α を主転移 (main-transition) といい, 転移温度をそれぞれ T s, T p,t m とする. Fig.3.5 DPPC のゲル液晶多形転移と熱的構造的変化 8) 一般的に炭化水素鎖の主鎖の回転によって鎖がゆらぎ, 秩序性が低くなった P β 相から急激にベシクルの膜透過性は高まる. これを利用して, 本実験では 3.2 で述べたタンパク質の徐放システムに加え, ベシクル形成後, 水相の温度条件を T m 以上に設定することで二分子膜の破壊と徐放性の向上を試みる. 3.4 タンパク誤差法 9) アルブミンはブロムクレゾールグリーン (BCG), ブロムクレゾールパープル (BCP) などの ph 指示薬と特異的に結合し, 溶液の ph 変化がないにもかかわらず, 色調が変化する現象 ( タンパク誤差 ) を起こす. これらの ph 指示薬は溶液の真の ph 値よりも高い ph 値を示すが, この ph のずれが溶液中に含まれるアルブミンの量に比例することを利用したものがタンパク誤差法であり, ヒト血清アルブミン (HAS) の定量に広く臨床応用されている. BCG 法はアルブミン以外にグロブリンとも反応してしまうため, 特異性に問題があるこ 5

6 とが指摘されている. 一方,BCP 法は感度がやや BCG 法よりも劣ることや試薬が不安定であるなどの問題点もあるが, 特異性の面では BCG 法よりも優れている. 本研究では試料にアルブミンのほか, グロブリンも含まれるため,Fig.3.6 の反応を利用した BCP 法を採用して比色定量を行う. H H H Br S Br Albumin ph8.8 Br S 3 - Br NH 3 + Bromocresol purple: BCP (yellow) (blue) Albumin Fig.3.6 BCP 法によるアルブミンの測定 4. 実験方法 4.1 使用する器具 10mL メスフラスコ,100 ml メスフラスコ, ビーカー, バイオプシー瓶, プラスチックセル, パスツールピペット,10mL ホールピペット,5mL ホールピペット, 駒込ピペット, 安全ピペッター 4.2 試薬軽質流動パラフィン, 卵白 ( オボアルブミン, オボグロブリンなど ), 塩酸グアニジン ( 可溶化剤 ),2 メルカプトエタノール ( 還元剤 ), フェリシアン化カリウム ( 酸化剤 ),BCP(Albumin Assay Kit 指示薬 ), DPPC (Dipalmitoylphosphatidylcholine), DPPS(Dipalmitoylphosphatidylserine), 塩化カルシウム, グリセリン 6

7 P CH 2 CH 2 N + CH 2 CH - P - NH 3 + C - CH 2 CH CH 2 CH 2 CH CH 2 Fig.3.7 DPPC( 左図 ) 及び DPPS( 右図 ) の構造 4.3 実験操作変性タンパク質溶液の作製 1) 10mL メスフラスコに表面変性が起きない程度に撹拌した卵白を約 16g 加え, イオン交換水でメスアップし, よく振り混ぜ, 溶解させる. この溶液の半分を 5mL ホールピペットで 100 ml メスフラスコに取り, 後で加える可溶化剤と還元剤の液量分を考慮して, イオン交換水で 100 倍に希釈する. これを駒込ピペットでバイオプシー瓶に取り,Albumin Assay Kit の BCP 試験液を適量加えて撹拌し, 吸光度 A 1 を測定する. 2) 残り半分の溶液にホールピペットで 8M の塩酸グアニジンを 75.0mL( 最終濃度が 6M となるように設定 ), 0.5M の 2 メルカプトエタノール 20.0mL( 最終濃度が 0.3M となるように設定 ) を加えて, タンパク質を完全変性させ, 可溶化する. 3) 可溶化した変性タンパク質の懸濁液を駒込ピペットでバイオプシー瓶に取り,BCP 試験液を適量加えて撹拌した後, 吸光度 A 2 を測定する逆ミセルの作製 1) 軽質流動パラフィン 10mL に PC:PS の比が 3:7,4:6,5:5,6:4,7:3(mol 比 ) となるように各々のリン脂質を溶解し, 脂質溶液を調製する. 7

8 2) イオン交換水 5.0mL をホールピペットで正確に取ったバイオプシー瓶を用意し, これに塩化カルシウムを所定量加えて溶解した後,1) で調製した脂質溶液を各々 5mL 静かに滴下し, 水平な油水界面を形成させ, しばらく静置する. 3) の懸濁液を 0.50mL, 酸化剤として所定濃度のフェリシアン化カリウムを 0.50mL 噴霧し,2) の油中に滴下して乳化させ, 油相中に逆ミセルを形成する. 4) 逆ミセルが界面に達するまでしばらく静置し, ベシクルの自発的な形成を待つ. 5) 試料の入ったバイオプシー瓶を 45±5 の温水に浸し, 所定時間静置する. その後, 水相を静かに撹拌し, 駒込ピペットで水相のみをビーカーに移して,BCP 試験液を適量加え, 吸光度 A 3 を測定する. 5. 評価方法逆ミセルの性能評価は組成比の異なる PC/PS 逆ミセル間で式 5.1 のように定式化したリフォールディング率 P を比較することにより行う. v n 3 n 1 2 V P= d (n 1 n 2 ) v 100 (5.1) n 1 /mol: 変性処理前の試料中の活性タンパク質の mol 数 n 2 /mol: 変性処理後に試料中に残余した活性タンパク質の mol 数 n 3 /mol: ベシクルから徐放された活性タンパク質の mol 数 /ml: 変性処理後の試料の容積 v 1 /ml: 噴霧した変性タンパク質の容積まずは評価方法の正当性について,Fig.5.1 の概念図をもとに検討しておく. 試料の Alb-BCP 複合体の吸光度を A, 濃度を c, モル吸光係数を ε とすると,A=εc の関係から試料溶液に含まれる活性タンパク質の mol 数 n は各試料の容積を V として, 式 5.2 のように表される. n=cv= A ε V (5.2) 変性処理前後の試料の吸光度を各々 A 1,A 2 とすると, 式 5.2 から変性処理前の試料溶液中に存在する活性タンパク質の mol 数 n 1 は,A 1 /ε となる. また, 変性処理前後の溶液の量は実験計画において等しく設定したため, 変性処理後の試料の中に存在する活性タ 8

9 ンパク質の mol 数 n 2 は, 同様にして A 2 /ε となる. よって変性処理後の試料中に存在する変性タンパク質の mol 数は n 1 -n 2 で表され, それを噴霧した溶液中に存在する mol 数に換算すると,(n 1 -n 2 ) v 1 / となる. すなわち, これが water pool に取り込まれた変性タンパク質の mol 数であり, リフォールディング率の分母に相当するものとなる. 活性タンパク質変性タンパク質 n 1 n 2 一部吸光度測定一部吸光度測定 (n 1 n 2 ) v 1 n 1 = ε A 1 変性処理逆ミセルの作製 v 1 n 2 = ε A 2 n 2 Vd 溶液の容積 v 1 Fig.5.1 実験操作の過程における試料の推移一方, リフォールディング率の分子にあたる部分は次のようにして求める. 水相の溶液を一部採取して,BCP 試験液を加え,Alb-BCP 複合体の吸光度 A 3 を求めた後, 式 5.2 からベシクルから徐放された活性タンパク質の mol 数 n 3 を計算すると,A 3 (V w +v 1 +v 2 ) /ε となる. ここで,V w ははじめに加えた水相の容積,v 2 は噴霧した酸化剤の容積を表す. この mol 数にはベシクルに取り込まれる前にもともと活性だったタンパク質の mol 数も含まれている. この mol 数は Fig.5.1 からも明らかなように n 2 v 1 / であるから,n 3 -n 2 v 1 / に相当する量が逆ミセルによって活性を回復したタンパク質の mol 数となる. 上記に記したことから式 5.1 は P= A 3(V w + v 1 + v 2 ) A 2 v 1 (A 1 A 2 )v (5.3) A 1 : 変性処理前の活性タンパク質の吸光度 A 2 : 変性処理後に残余した活性タンパク質の吸光度 A 3 : ベシクルから徐放された活性タンパク質の吸光度 v 1 /ml: 噴霧した変性タンパク質の容積 v 2 /ml: 噴霧した酸化剤の容積 V w /ml: はじめに加えた水相の容積 9

10 と変形できるため, 以上の 5 つのパラメータからリフォールディング率を定量化することができる. 引用文献 1) 蛋白質科学会アーカイブ HP, 投稿, 蛋白質リフォールディング : 段階透析法, 取得 2) 社団法人化学工学会バイオ部会, バイオプロダクションものつくりのためのバイオテクノロジー, コロナ社,2006,p ) 独立行政法人産業技術総合研究所 HP, 投稿, 変性したタンパク質の活性を回復させる有機ナノチューブゲル, 取得 4) 元島史尋, 吉田賢右, 蛋白質の揺籃シャペロニンの構造生物学, 共立出版, 蛋白質核酸酵素, 43 2,1998,p ) 河田康志, シャペロニンの作用機構の最前線, 日本農芸化学会, 日本農芸化学会誌, 78 6,2004,p ) 山田彩子, 濱田勉, 吉川研一, 細胞サイズリポソームの新しい作製法とその応用, 日本生物物理学会, 生物物理, 49 5,2009,p ) 公益財団法人山田科学振興財団 HP, ソフトマターのセミミクロスケール構造の自己組織化, 取得 8) 佐藤清隆, 小林雅通, 脂質の構造とダイナミックス, 共立出版,1992,p.8,9, ) 中束美明, バイオケモメトリクス- 計算の実際, 培風館,2004,p

ルディング操作を行う場合, 莫大な量の溶液を要するだけでなく, その後の濃縮操作が必要となる. 一方, 透析法の場合は, 可溶化剤の濃度をゆっくり低下させることができるが, タンパク質をより長く折りたたみ中間状態に置くこととなり, 折りたたみ中間体から凝集に向かいやすいタンパク質の類は, 添加剤を加

ルディング操作を行う場合, 莫大な量の溶液を要するだけでなく, その後の濃縮操作が必要となる. 一方, 透析法の場合は, 可溶化剤の濃度をゆっくり低下させることができるが, タンパク質をより長く折りたたみ中間状態に置くこととなり, 折りたたみ中間体から凝集に向かいやすいタンパク質の類は, 添加剤を加東京理科大学 Ⅰ 部化学研究部 2013 年度実験計画書逆ミセルによる変性タンパク質のリフォールディング土曜班 Masanori.N(3K) 1. 要旨細胞膜の主成分であるホスファチジルコリンを両親媒性分子として使用した逆ミセルを形成し, その空間を変性タンパク質の折り畳みの場として利用したリフォールディング法の開発を試みた. モデルタンパク質としては卵由来のアルブミンを使用し, これを塩酸グアニジン