クローニングのための遺伝学

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ねんたろうおおはし
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1 1. 遺伝のしくみクローニングのための遺伝学 ( 前編 ) Akifumi Shimizu 遺伝子 (gene DNA 配列 ) は染色体 (chromosome) に乗って遺伝する遺伝子が染色体に座乗する位置は決まっている ( 遺伝子座 locus) 同一遺伝子座に座乗できる遺伝子 ( 対立遺伝子 allele) は複数種が存在しうる染色体は減数分裂時に乗り換える (crossing over) ことがある染色体が乗り換えることで染色体上の対立遺伝子の組み合わせは変化する一対の染色体からなる架空の倍体生物の場合の遺伝の様子をみてみましょう ( 図 1) この生物の体細胞は n= 本の染色体を持ちます子孫へと遺伝情報を伝えるのは卵と精子という特別な細胞 ( 配偶子 ) のみです配偶子は減数分裂をして n=1 本の染色体を持っています ( 半数体一倍体と呼ぶ ) 図 1 ではアルファベットで遺伝子座の種類を下付き数字で対立遺伝子の種類を区別しています減数分裂時には相同染色体の姉妹染色体分体間で乗り換え (Crossing over) が少なくとも一回起こります乗り換えにより遺伝子座の位置は変わりませんが同一染色体上の対立遺伝子の組合せが変わります生じる組合せの頻度は遺伝子座間の位置関係 ( 遺伝距離 ) と関係します図 1 の例では 4つの配偶子のうちつで対立遺伝子の組合せが変わっています ( 新たに A1B1C1D1E1F1GH と ABCDEFG1H1 が生じた ) 図 1 減数分裂のモデル図 (n=) はセントロメア, セントロメアを中心として短い方を短腕 (A~C) 長い方 (D~H) を長腕という a) 普通の細胞 b) 染色体の倍加 c) 乗り換え d)4 個の配偶子へ n = ( 減数分裂中 ) ( 減数分裂中 ) n = 1 P1 P P1 P1 P P P1 P1 P P A 1 A A 1 A 1 A A B 1 B B 1 B 1 B B C 1 C C 1 C 1 C C D 1 D D 1 D 1 D D E 1 E E 1 E 1 E E F 1 F F 1 F 1 F F G 1 G G 1 G G 1 G H 1 H H 1 H H 1 H 実際には配偶子は一度に何種類もつくられます沢山の子孫の対立遺伝子セットを調べることで遺伝子が一緒に伝わる ( 連鎖する ) か伝わらない ( 独立する ) かの頻度を調べその比率をできるようになりますこの比率は遺伝子の染色体上の座乗位置と関係しますイネなど二倍体の自殖性植物の場合両親を交配して得た交雑当代 (F1) を自殖した F 集団を使えば遺伝子座間の位置関係を推定することができます ( 連鎖地図の作成 ) 1

2 . DNA マーカー染色体の乗換えにより遺伝情報がどのように継承されるかを追跡するための便利なツールに DNA マーカーがあります手軽に使える DNA マーカーの1つに SSR マーカーがあります SSR マーカーは GAGAGAGA のように単純な塩基単位の繰り返し (Simple Sequence Repeats, SSR) によって構成される DNA 配列を元にしたマーカーで SSR は真核生物のゲノム中に普遍的に散在していることが知られています SSR の反復数は変異し易いことが知られており反復数の変異を断片長多型として検出することで複数の対立遺伝子を識別することができます SSR マーカーは電気泳動法によって断片長多型を識別するのが一般的です ( 図 ) (GA) 6 6 反復 (GA) 反復 GAGAGAGAGAGA GAGAGAGAGAGAGAGAGAGA CTCTCTCTCTCT CTCTCTCTCTCTCTCTCTCT PCR で増幅 PCR で増幅電気泳動による断片長多型の検出図電気泳動法による SSR 断片長多型の検出例或る SSR マーカーについて断片長が異なる倍体の自殖品種 A と B を考えます品種 A の SSR 断片長を A 型とし品種 B のものを B 型としたとき品種 A と品種 B を交配した F1 個体は A 型 B 型両方の断片長を持つヘテロ遺伝子型になるはずです図 3 は品種 A の SSR 断片長が品種 B の断片長よりも長い場合のバンドパターン別の遺伝子型の振り分け例です遺伝子型は品種 A B F1 を A/A, B/B, A/B のように表記する場合と A, B, H の様に一文字で表記する場合があります

3 図 3 SSR マーカーの断片長多型と遺伝子型の実例他の DNA マーカーとしては SNP(Single Nucleotides Polymorphisms 一塩基多型 ) マーカーがあります SNP マーカーは最小単位の DNA 多型でありもっとも高密度な多型情報を得られます 3

4 3. マーカーの連鎖例としてイネの染色体 4 に座乗する SSR マーカー (RM5 と RM41) の連鎖を見てみましょう品種 G 品種 K の自殖 F 86 系統について遺伝子型を調べたところ表 1 のようになりました各マーカーの遺伝子型は品種 G ホモ型 (GG), 品種 K ホモ型 (KK) ヘテロ型 (GK) の 3 種類で種の組み合わせは 3 種類 3 種類の 9 種類になります ( 表 1) 表 1 RM5 RM41 86 GG GG 4 GG GK 4 GG KK 0 GK GG 4 GK GK 31 GK KK 3 KK GG 0 KK GK 7 KK KK 13 このマーカー間の組換え価を計算してみますマーカー間の組換え価が r であると仮定すると RM5 と RM41 について品種 G と品種 K を交配した雑種当代 F1 個体の遺伝構成は次のようになるはずです F 1 組換え価 r RM5 G K r RM41 G K この F1 を自殖して F 分離集団をつくりますこのとき F1 からできる配偶子は RM5 と RM41 について 4 種類に分類でき非組換え型配偶子組換え型配偶子頻度 (1-r )/ r / G K G K G K K G の頻度で非組換え型と組換え型の配偶子が生じます卵配偶子 (4 種類 ) と花粉配偶子 (4 種類 ) の組合わせで 16 組が生じ共優性マーカーの遺伝子型を調べることによって F 個体の分離は次に示す 9 種類に分別できます 4

5 F 1 GG-GG (1-r ) /4 GG-GK (1-r )r /4 3 GG-KK r /4 RM5 G G RM5 G G G G RM5 G G RM41 G G RM41 G K K G RM41 K K GK-GG (1-r )r /4 RM5 G K K G RM41 G G G G GK-GK (1-r ) /4+r /4 RM5 G K K G G K K G RM41 G K K G K G G K GK-KK (1-r )r /4 RM5 G K K G RM41 K K K K KK-GG r /4 8 KK-GK (1-r )r /4 9 KK-KK (1-r ) /4 RM5 K K RM5 K K K K RM5 K K RM41 G G RM41 G K K G RM41 K K それぞれ配偶子の頻度に応じて 9 種類の遺伝子型クラスの期待頻度が記されています ( 自分で紙に書き出して組み合わせ数がこの通りになることを確認しよう!!) RM5 と RM41 で実際に観測できたデータ数と上図モデルの結果をまとめてみると次のようになります表 5

6 組換え価 r のマーカーで実際に観測される遺伝子型の個数は確率関数としてあらわすことができます 9 面のサイコロを振って ( 各面が表になる確率が fa~fi で与えられている ) 出る目の数を計測し (a~i) 観測値の出る確率を考えるのですその確率関数は多項分布の形であらわされ (N=a+b+c+d+e+f+g+h+i) N! P( r) = a! b! c! d! e! f! g! h! i! a b c d e f g h ( f ) ( f ) ( f ) ( f ) ( f ) ( f ) ( f ) ( f ) ( f ) i a b のようになります! 記号は階乗を表し N!=N (N-1) 1 です期待頻度の重複を考慮すると上式はもう少し簡単になって N! a+ i b+ d + f + h c+ g P( r) = ( f ) ( ) ( ) ( ) e a f b f c f e 式 1 a! b! c! d! e! f! g! h! i! のようになります多項分布は高校の数学で習う二項分布の拡張版です二項分布はコインの表裏などつの背反な事象を表す確率関数で N 回コインを投げて表が出る回数が k 回 ( 裏の出る数は N-k 回 ) であり表になる確率が r のとき N P r =! ( ) k!( N k)! 1 c d k N k ( r) ( r) のように表せますもし多項分布の意味がすんなりと理解できなくても考え込まないようにしましょう式 1 を見直してください a~i N はただの観測値の数です fa,fb,fc,fe も変数はたった一つ r の関数です r は 0.0~0.5 までの値をとります Excel のシート上で a~i を記入しておき (RM5-RM41 の場合の値は表を参照 ) ある r に対する P(r) を Excel の式で計算させ r の値を 0.001~0.500 まで刻みで計算させると次のようになります e f g h i 図組換え価の推定 P(r ) RM5-RM41 の組換え価 r r を様々に変化させる中で P(r) が一番大きくなる r は a~i の遺伝子型を観察したときの尤 ( もっと ) もらしい r であるといえます最も尤もらしい P(r) の値を与える r の推定値 rˆ を最尤 ( さいゆう ) 推定量といい最尤推定量によるモデルパラメター ( この場合の r) の推定方法 6

7 を最尤法といいますマーカー間の真の組換え価は神様しか知らないので人間が組換え価の情報を得るには実際にマーカー遺伝子型の分離を観測し観測データから組換え価を推定するしかないことに注意してください最尤法の使用方法をより単純な確率モデル ( 二項分布 ) で説明しましょうコインは表裏が均等にできていれば表がでる確率は 0.5 であると考えます今コインの表面の重さを裏面より 10% 重くしてみました表の出る確率はいくらになるでしょうか? この場合実際にそのコインを投げて表裏を計測し観察値から予測をします 50 回コインを投げて表は 30 回出たとします表の出る確率を r として計測値のようになる確率を考えてみると 50! P( r) = r 30!0! ( r) 30 ( 1 ) 0 となり r を様々に変化させて P(r) を見ることがでます表 3 表裏 r P(r ) 表 3 では r=0.60 のときに P(r) が最大なので表面を 10% 重くした改造コインの場合の表面の出る確率は r=0.60 になったと考えるのが最も尤もらしいです r=0.6 とみなすモデルは r=0.5 のままであるとするよりも.7 倍 (P(0.6)/P(0.5)) 尤もらしいです最尤推定量の計算は P(r) を最大にする r を求めればよく前頁の図 [ 組換え価の推定 ] のグラフを見れば分かるように P(r) の傾きが 0 になるところつまり P (r) =0 のところになります以上の P(r) のように観測データは既知として固定し P(r) を r だけの関数と考えるときこの関数を尤度と呼びます今まで P(r) としてきたものは正確には L(r) と書くべきでものでした尤度 L(r) を最大にする r は対数尤度で考えると便利です RM5-RM41 の組換え価に話を戻すと式 1(p6) から尤度は L( r) = 定数 a+ i b+ d + f + h ( r) r( r) r c + g 1 1 ( 1 r + r ) e となり対数尤度は log L ( r) = log定数 + (a + i + b + d + f + h)log(1 r) + (c + g + b + d + f + h)log r + elog(r r + 1) になります対数尤度の傾きか 0 になる r が尤度を最大にする最尤推定量になるので 4 7

(a + i + b + d + f + h) (c + g + b + d + f + h) (4r ) e log = + + 1 r r r r + 1 ( L ( r) ) が 0 になる r を計算しますこの等式は r の三次式になるので結局は 0 r 0.5 の中で logl(r) が最大になる値を探すことになります RM5-RM41 の観測データの場合 Excel で 0.

8 (a + i + b + d + f + h) (c + g + b + d + f + h) (4r ) e log = r r r r + 1 ( L ( r) ) が 0 になる r を計算しますこの等式は r の三次式になるので結局は 0 r 0.5 の中で logl(r) が最大になる値を探すことになります RM5-RM41 の観測データの場合 Excel で刻みで r を変化させると r=0.11 で log L(r) が最大になりました L(0.11) と L(0.5) の比を常用対数 log10 であらわしたものを特に LOD(logarithm of odds) スコアとよび LOD スコアが閾値以上であるとつのマーカーは連鎖していると考えることができます (L(0.5) はマーカーが独立の場合の尤度なので独立モデルとの差が大きく連鎖していると考える ) RM5-RM41 の場合の LOD スコアは 17.6 になり連鎖の可能性は非常に高いです ( 共優性マーカー同士の場合 LOD が 3.0 以上なら連鎖しているといえる ) 4. 連鎖地図マーカー間の連鎖の計算方法が分かれば調査した全マーカーについてペアをつくり (N マーカーなら N (N-1)/ 回の計算量になる ) 各々の連鎖を調べることができます単純なデータの場合はペア間の連鎖が閾値以上 ( たとえば LOD3 r<0.3) のものは同一連鎖群とみなしてマーカーを群分けすることができます理想的にはこのときの群の数が染色体の数になります群内のマーカーの順序はさまざまな統計手法を用いて計算します ( 詳しい計算は後述 ) 計算は専用のソフトウェアを使うのが一般的です例 : イネの連鎖地図の一部 8

< 染色体地図 : 細胞学的地図 > 組換え価を用いることで連鎖地図を書くことができるしかしこの連鎖地図はあくまで仮想的なものであって実際の染色体と比較すると遺伝子座の順序は一致するが距離は一致しないそこで実際の染色体上での遺伝子の位置を示す細胞学的地図が作られた図 : 連鎖地図と細胞学

< 染色体地図 : 細胞学的地図 > 組換え価を用いることで連鎖地図を書くことができるしかしこの連鎖地図はあくまで仮想的なものであって実際の染色体と比較すると遺伝子座の順序は一致するが距離は一致しないそこで実際の染色体上での遺伝子の位置を示す細胞学的地図が作られた図 : 連鎖地図と細胞学グループ A- : 染色体地図とは染色体地図とは染色体上での遺伝子の配置を示したものである連鎖地図と細胞学的地図の 2 種類がある < 染色体地図 : 連鎖地図 ) > 染色体地図 : 染色体上の遺伝子座 ( または遺伝子 ) の位置関係を示した地図ある遺伝子座がどの染色体上にあるのかその染色体のどの位置にあるのかこれらを明らかにすれば染色体地図が書ける A C F R 14% 12% 4%