分子標的薬とは ある特定の分子を標的とした治療薬 レセプター ( 受容体 ) シグナル伝達系転写因子など 作用点 ターゲットが明確 がん細胞に直接作用 副作用が限定的 バイオマーカー検査 高額 既存の抗がん剤 アルキル化剤プラチナ製剤ホルモン様物質 抗ホルモン剤代謝拮抗剤など

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1 愛知県臨床検査技師会 病理細胞検査研究班研究会 分子標的薬と臨床検査 三菱化学メディエンス検査開発部脇田淳

2 分子標的薬とは ある特定の分子を標的とした治療薬 レセプター ( 受容体 ) シグナル伝達系転写因子など 作用点 ターゲットが明確 がん細胞に直接作用 副作用が限定的 バイオマーカー検査 高額 既存の抗がん剤 アルキル化剤プラチナ製剤ホルモン様物質 抗ホルモン剤代謝拮抗剤など

3 個別化医療と PGx 個別化医療 = オーダーメイド医療 = テーラーメイド医療 患者の生理的状態や疾患の状態などを考慮して 患者個々に治療法を設定する医療 ( 日本薬学会薬学用語解説より ) PGx( ファーマコゲノミクス ): ゲノム薬理学 Pharmacology( 薬理学 )+Genomics( ゲノム学 ) 薬物応答と関連するDNA 及びRNAの特性の変異に関する 研究 ( 厚生労働省ゲノム薬理学における用語集 ) 対象とする患者群の遺伝情報 個人の違いから最適な治療薬の開発を行う

4 増え続ける分子標的薬 商品名一般名対象疾患 グリベック イマチニブ 慢性骨髄性白血病 KIT(CD117) 陽性消化管間質腫瘍 Ph+ 急性リンパ性白血病 リツキサンリツキシマブ CD20 陽性の B 細胞性非ホジキンリンパ腫 イレッサゲフィチニブ手術不能又は再発非小細胞肺癌 ハーセプチン レミケード トラスツズマブ インフリキシマブ HER2 過剰発現が確認された転移性乳癌 HER2 過剰発現が確認された乳癌における術後化学療法 HER2 過剰発現が確認された治癒切除不能な進行 再発の胃癌 関節リウマチベーチェット病による難治性網膜ぶどう膜炎 乾癬 強直性脊椎炎 クローン病 潰瘍性大腸炎 アービタックスセツキシマブ EGFR 陽性の治癒切除不能な進行 再発の結腸 直腸癌 ネクサバール ソラフェニブ 根治切除不能又は転移性の腎細胞癌切除不能な肝細胞癌

5 コンパニオン診断 (CDx/CoDx) CDx/CoDx:Companion Diagnostics 薬を投与する前に 期待される効果や副作用の程度を予測するために実施する臨床検査 遺伝子変異や遺伝子多型 タンパクの発現などが検査対象となる アメリカ食品医薬品局 (FDA) では 新規医薬品と同時にコンパニオン診断法を開発 承認を受けることを推奨している

6 グリベック ( イマチニブ ) CML/GIST/ALL

7 ヒトの染色体 (G バンド分染法 )

8 グリベックの標的分子は? フィラデルフィア染色体 (Ph) 陽性の慢性骨髄性白血病または急性リンパ性白血病の場合 フィラデルフィア染色体 相互転座

9 9 番と 22 番の染色体転座の結果... フィラデルフィア染色体から健常者には存在しない異常なタンパク質が生成される Bcr-Ablタンパクが何をするかというと ATP 号ATP( 生体内のエネルギー源 ) を使って細胞増殖の信号を発する信Bcr-Abl タンパク 白血病細胞の無秩序な増殖

10 グリベックの作用 Bcr-Ablタンパクが何をするかというと ATP 号ATP( 生体内のエネルギー源 ) を使って細胞増殖の信号を発する信グリベックは ATP と競合して結合を阻害する! ATP ATP 信号白血病細胞の無秩序な増殖 白血病細胞の無秩序な増殖

11 最初のヒト遺伝子検査項目の保険導入 平成 16 年 11 月 11 日適用 Major bcr-abl mrna 核酸増幅検査 ( 区分 D006-3) 1,200 点 TMA 法により測定した場合に限り算定できる (Amp-CML) 体内総白血病細胞量 FISH 法光顕 SB 法 FCM 法 PCR 法 寛解 再発 光顕レベル (microscopic level) 微小残存病変 (MRD) 分子レベル (molecular level) 検出限界未満の白血病細胞 検出不可レベル (molecularly undetectable level) 治療に伴う体内総白血病細胞数の推移と各 MRD 検査法の検出限界 時間

12 Major bcr/abl mrna 核酸増幅検査 (Amp-CML) 9 番 22 番 染色体転座 フィラデルフィア染色体 この領域を増幅して定量値を報告する

13 Major bcr/abl mrna 核酸増幅検査 (Amp-CML) 診療報酬の区分と点数 Major bcr/abl mrna のコピー数の定量値は 治療効果の確認や再発の発見 移植時の前処理効果の確認などにおいて 補助的情報となる

14 保険導入が進むヒト遺伝子検査 平成 18 年 4 月 1 日適用 悪性腫瘍遺伝子検査( 区分 D004-13) 2,000 点 ( 略 ) 固形腫瘍の腫瘍細胞を検体とし PCR 法 SSCP 法 RFLP 法等を用いて 悪性腫瘍の詳細な診断及び治療法の選択を目的として悪性腫瘍患者本人に対して行った 肺癌におけるEGFR 遺伝子検査又は K-ras 遺伝子検査 膵癌におけるK-ras 遺伝子検査 悪性骨軟部組織腫瘍におけるEWS-Fli1 遺伝子検査 TLS-CHOP 遺伝子検査又は SYT-SSX 遺伝子検査 消化管間葉系腫瘍におけるc-kit 遺伝子検査 家族性非ポリポージス大腸癌におけるマイクロサテライト不安定性検査又は悪性黒色腫センチネルリンパ節生検に係る遺伝子検査について 患者 1 人につき1 回に限り算定する 悪性腫瘍遺伝子検査を算定するに当たっては その目的 結果及び選択した治療法を診療報酬明細書の摘要欄に記載すること

15 EGFR 検査 イレッサ ( ゲフィチニブ ) 非小細胞肺癌

16 肺癌の分子標的治療薬 2001 年以降 肺がん による死亡率が第一位となる 肺がんの中でも 非小細胞肺癌 は高い割合を占める EGFR 高発現 がん化促進 非小細胞肺癌治療薬 イレッサ アストラゼネカ社 一般名 Gefitinib( ゲフィチニブ ) 対象 手術不能又は再発非小細胞肺癌 EGFR を標的とした分子標的治療薬 (EGFR チロシンキナーゼ阻害薬 ) 著効例 重篤な副作用 間質性肺炎 死亡例

17 正常細胞とがん細胞の違い がん細胞では細胞膜上の受容体 ( レセプター過剰に発現していることがある ) が 核 核 正常細胞 がん細胞

18 受容体から核へ信号が伝わる 細胞内シグナル伝達系 核 核 通常の細胞分裂 増殖 過剰な細胞分裂 癌化

19 EGFR を介した細胞内シグナル伝達 EGF R R EGF EGFEGF EGFR: 上皮成長因子受容体 K K SOS RAS PI3K GRB2 RAF AKT MEK 細胞生存 mtor 核 ERK 細胞増殖 2013/7/5 癌化 無秩序な増殖

20 イレッサがなぜ効くか EGF イレッサ R R AKT PI3K K K SOS GRB2 RAS 遺伝子変異あり RAF MEK 細胞生存 mtor 核 ERK 細胞増殖 2013/7/5 増殖抑制 細胞死誘導

21 イレッサの効果に関する重要な発見 2004 年権威ある雑誌に重要な論文が掲載された 非小細胞肺癌には EGFR 遺伝子に変異をもつものがある EGFR 遺伝子に変異のある肺癌にはゲフィチニブが著効する

22 EGFR 遺伝子変異と患者背景 EGFR 遺伝子変異とゲフィチニブ奏効率 変異頻度 (%) 腺 癌非非腺腺癌癌 EGFR 遺伝子変異と患者背景 腺癌 24 性男男性性 女性 22 喫喫煙組織型性別喫煙歴 女軽非/ 喫非煙喫煙 EGFR 変異 (+) 著効 EGFR 変異 (-) 著効 愛知県がんセンター % % 東北大学 % 前向き試験 埼玉医科大学 % 前向き試験 EGFR 変異陽性例は奏効率が高い ( 約 80%)

23 検査の位置付け 肺癌の分子標的薬の使用に先立って実施する検査 EGFR 遺伝子変異解析 遺伝子変異が検出されればEGFR-TKI ( イレッサ / タルセバ ) の投与対象となる 関連する臨床検査 D004-2 悪性腫瘍組織検査 1. 悪性腫瘍遺伝子検査 : 肺癌におけるEGFR 遺伝子検査実施料 2,100 点 2006 年 4 月新設 2007 年 6 月疑義解釈回答 悪性腫瘍遺伝子検査は 固形腫瘍の腫瘍細胞を検体とし PCR 法 SSCP 法 RFLP 法等を用いて 悪性腫瘍の詳細な診断及び治療法の選択を目的として悪性腫瘍患者本人に対して行った場合に限り 患者 1 人につき 1 回に限り算定する 肺癌または大腸癌における EGFR 遺伝子検査又は K-ras 遺伝子検査 ( 平成 22 年 4 月改訂 ) 膵癌における K-ras 遺伝子検査 悪性骨軟部組織腫瘍における EWS-Fli1 遺伝子検査 TSL-CHOP 遺伝子検査又は SYT-SSX 遺伝子検査 消化管間葉系腫瘍における c-kit 遺伝子検査 家族性非ポリポージス大腸癌におけるマイクロサテライト不安定性検査

24 EGFR 遺伝子検査のタイミング 投薬前に遺伝子検査を実施 耐性遺伝子変異 EGFR exon 20 EGFR exon 18,exon 19,exon 21 感受性遺伝子変異 変異あり 変異なし 効果期待大 効果期待小 投薬 耐性 << 感受性 ( 保険算定条件 ) 2012 年算定条件改訂

25 KRAS 検査 アービタックス ( セツキシマブ ) ベクティビックス ( パニツムマブ ) 結腸 直腸癌

26 結腸 直腸癌の分子標的薬 2008 年 9 月に発売開始された新規抗悪性腫瘍剤効能又は効果 : EGFR 陽性の治癒切除不能な進行 再発の結腸 直腸癌 2010 年 6 月に発売開始された新規抗悪性腫瘍剤効能 効果 : KRAS 遺伝子野生型の治癒切除不能な進行 再発の結腸 直腸癌

27 モノクローナル抗体が分子標的治療薬に 核 核 がん細胞にはレセプターが過剰に発現している レセプターにリガンドが結合すると過剰なシグナルが核に伝達される リガンドとはレセプターに結合する物質例 )EGF と EGFR の関係

28 モノクローナル抗体の作用 EGF 抗 EGFR モノクローナル抗体 核 核 がん細胞の EGFR に EGF が結合すると過剰なシグナルが核に伝わる 抗 EGFR 抗体が先にレセプターに結合すると EGF は結合できない 核にシグナルが伝わらない 増殖抑制 細胞死誘導

29 添付文書記載事項の違い ( 効能 効果 注意事項 ) アービタックス ( セツキシマブ ) ベクティビックス ( パニツムマブ ) EGFR 陽性が投与対象 KRAS 遺伝子検査で適応患者を選択することを推奨 KRAS 遺伝子野生型が投与対象 その他 検査の特記事項はなし KRAS 遺伝子検査の実施は必須と考えられる!

30 KRAS 遺伝子検査の意義 新規承認された抗悪性腫瘍剤はいずれも結腸 直腸癌細胞の EGFR を標的としている なぜ KRAS 遺伝子を調べる必要があるのか? 野生型と変異型はどう違う?

31 細胞内シグナル伝達系における RAS KRAS 遺伝子は細胞内に存在する RAS タンパクの設計図 EGF R R K K SOS RAS PI3K GRB2 RAF AKT MEK 細胞生存 mtor 核 ERK 細胞増殖 遺伝子が正常ならば正常な RAS タンパクができる

32 KRAS 遺伝子に変異が生じると... ブレーキが壊れた状態になる! 転移 R R K K EGFR の関与なく強力なシグナルが核に伝わる 変異型 KRAS 遺伝子からは変異型 RAS タンパクが生成 抗悪性腫瘍剤の効果は期待できない 血管新生 無秩序な増殖 核 アポトーシス阻害

33 保険導入が進むヒト遺伝子検査 平成 18 年 4 月 1 日適用 悪性腫瘍遺伝子検査( 区分 D004-13) 2,000 点 ( 略 ) 固形腫瘍の腫瘍細胞を検体とし PCR 法 SSCP 法 RFLP 法等を用いて 悪性腫瘍の詳細な診断及び治療法の選択を目的として悪性腫瘍患者本人に対して行った 肺癌におけるEGFR 遺伝子検査又は K-ras 遺伝子検査 膵癌におけるK-ras 遺伝子検査 悪性骨軟部組織腫瘍におけるEWS-Fli1 遺伝子検査 TLS-CHOP 遺伝子検査又は SYT-SSX 遺伝子検査 消化管間葉系腫瘍におけるc-kit 遺伝子検査 家族性非ポリポージス大腸癌におけるマイクロサテライト不安定性検査又は悪性黒色腫センチネルリンパ節生検に係る遺伝子検査について 患者 1 人につき1 回に限り算定する 悪性腫瘍遺伝子検査を算定するに当たっては その目的 結果及び選択した治療法を診療報酬明細書の摘要欄に記載すること 平成 22 年 4 月 D004-2 新規 ; 悪性腫瘍組織検査へ区分変更大腸癌におけるK-ras 遺伝子検査追加

34 HER2 検査 ハーセプチン ( トラスツズマブ ) 乳癌 胃癌

35 乳癌 胃癌の分子標的薬 ハーセプチン ( トラスツズマブ ) 2001 年 4 月承認 HER2 過剰発現が確認された転移性乳癌 2008 年 2 月追加適用 HER2 過剰発現が確認された乳癌における術後補助化学療法 2011 年 3 月効能追加 HER2 過剰発現が確認された治癒切除不能な進行 再発の胃癌 HER2 陽性乳癌に特異的に効果を示す世界初のヒト化モノクローナル抗体薬胃癌における初めての分子標的治療薬

36 ハーセプチンの作用 : ADCC 活性の惹起 ハーセプチン ( 抗体薬 ) HER2 核 2013/7/5

37 ハーセプチンの作用 : ADCC の惹起 単球 NK 細胞 HER2 核 単球 2013/7/5

38 ハーセプチンの作用 : ADCC の惹起 ADCC: 抗体依存性細胞傷害作用 核 2013/7/5

39 関連する検査 HER2 検査 : HER2 過剰発現の診断検査 (HER2 タンパクまたは HER2 遺伝子 )

40 ここまでのまとめ 治療薬対象疾患バイオマーカー検査検査の意義 グリベック ( イマチニブ ) CML GIST ALL Amp-CML ( 染色体検査 ) モニタリング イレッサ ( ゲフィチニブ ) 非小細胞肺癌 EGFR 遺伝子検査 感受性の判定耐性の確認 アービタックス ( セツキシマブ ) ベクティビックス 結腸 直腸癌 KRAS 遺伝子検査 (EGFRタンパク) 感受性の判定 ( パニツムマブ ) ハーセプチン ( トラスツズマブ ) 乳癌 胃癌 HER2 検査感受性の判定

41 ALK 検査 ザーコリ ( クリゾチニブ ) 非小細胞肺癌

42 添付文書

43 EML4-ALK 融合遺伝子の発見 Nature 448, , 年自治医科大学の間野博行教授らが 肺腺がんの臨床検体から新規の肺がん原因遺伝子を発見

44 融合遺伝子の発生 2 番染色体の特定領域が逆位で再結合した遺伝子 ALK 遺伝子は細胞増殖の際に利用される酵素の遺伝子 逆位再結合によりつくられた融合蛋白は恒常的に増殖シグナルを核に伝達して細胞が増殖 癌化する 本融合遺伝子は非小細胞性肺がん患者のおよそ4~7% 程度に認められるとされている

45 EML4-ALK 融合遺伝子のパターン Nature 448, , 2007

46 海外第 Ⅰ 相試験標的病変の最大腫瘍縮小率EML4-ALK 融合遺伝子陽性患者における ALK 阻害剤の治療効果

47 肺がんの分子標的薬 ( 保険診療 ) EGFR 遺伝子変異解析 EGFR チロシンキナーゼ阻害剤イレッサ ( ゲフィチニブ ); アストラゼネカタルセバ ( エルロチニブ ); 中外製薬 ALK 阻害剤ザーコリ ( クリゾチニブ ); ファイザー EGFR 遺伝子変異陽性 EGFR 遺伝子変異陰性 ALK 融合遺伝子陽性 イレッサまたはタルセバ ザーコリ

48 ALK 遺伝子検査の手引き 2011 年 12 月 1 日付日本肺癌学会ホームページにて開示

49 手引きに示された診断アルゴリズム 一つの検査が陽性であっても 2 つ以上の方法により融合遺伝子の存在を確認することが望まれる

50 検査方法の違い 特徴 それぞれの方法に一長一短あり

51 免疫染色結果の比較 抗検出法 体 当社採用 5A4/iAEP の組み合わせ

52 ALK-IHC 染色例 ( 陽性 ) H.E. x1.25 IHC x1.25

53 ALK-IHC 染色例 ( 陰性 )

54 コントロールスライド Positive Control x400 Negative Control x400

55 FISH 法検出様式 Abbott 社 Break apart rearrangement probe を採用 ALK 遺伝子の切断領域両端を赤と緑の蛍光色素で標識 正常な場合は赤と緑のシグナルが近接するため 黄色のシグナルが検出される 転座が生じるとシグナルが分離し 赤と緑のシグナルが検出される

56 組織 FISH 検体の処理 脱パラ 抗原賦活化 ( 加熱 ) コーティングスライド APS( アミノシラン ) プラチナ PLL( ポリリジン ) MAS 酵素処理

57 組織 FISH 検体の処理 プローブ滴下 ハイブリ 封入

58 アボットジャパン ALK-FISH プローブキット

59 ALK-FISH 検出例 陰性 陽性

60 プローブキット添付文書の内容 ( 抜粋 )

61 報告書見本 (ALK-FISH) 検査所見キットの判定基準に準拠した結果を表記 写真付き代表的な間期核の写真とシグナルを表記します

62 中医協総 -3 資料 ( ) ALK 融合遺伝子標本作製は ALK 阻害剤の投与の適応を判断することを目的として FISH 法により遺伝子増幅標本作製を行った場合に 当該薬剤の投与方針の決定までの間に 1 回を限度として算定する

63 検体品質管理マニュアル推奨条件 遺伝子関連検査を病原体遺伝子検査体細胞遺伝子検査遺伝学的検査 ( 生殖細胞系列遺伝子検査 ) に大別し それぞれ検体保存と運搬検体取扱い検体採取を詳細に解説したマニュアル

64 検体品質管理マニュアル推奨条件 ( 抜粋 ) ホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロック 推奨固定液 10% 中性緩衝ホルマリン ( 核酸断片化の進行が遅延する ) 固定時間の目安 手術材料 : 室温で 18~36 時間 生検材料 : 室温で 3~6 時間程度 参考情報 10% ホルマリンは室温で 1 時間に 1mm 程度浸透するとの報告あり 薄切後 10 日間まで RNA の質的劣化は認められないとの報告あり

65 検体品質管理マニュアル推奨条件 ( 抜粋 ) 胸水 腹水 心嚢液 膵液 気管支肺胞洗浄液 (BALF) 尿 ( 沈渣 ) 喀痰 採取後の保管 処理時間 冷蔵 (2~8 ) 遺伝子発現定量 : 検体採取後直ち (2 時間以内 ) に RNA を抽出 遺伝子変異解析 : 高分子 DNA が必要な場合 24 時間以内 必要としない場合 3 日以内に DNA 抽出 長期保管方法 胸水 腹水 心嚢液 膵液 気管支肺胞洗浄液 (BALF) 遠心分離 (760G 室温 10 分間 ) 後 沈渣をPBSにて洗浄する 再度遠心分離し上清廃棄 沈渣のみを超低温 (-70 ) で保存 尿 ( 沈渣 ) 喀痰 遠心分離 (6,000G 室温 2 分間 ) 後 上清廃棄 沈渣のみ超低温で保存 超低温 (-70 ) で保存

66 最後に 個別化医療の実現に向けた治療薬の開発が続く 分子標的薬が主流に コンパニオン診断 (CDx/CoDx) という概念が定着 治療薬と診断薬の同時承認 バイオマーカーを検査して治療方針を決定 検査手法は遺伝子 染色体 病理 細免検査 遺伝子はPCR 法またはRT-PCR 法 染色体はISH 法 (FISH DISH CISH) 病理は免疫染色 遺伝子検査を前提とした検体採取 保管が必要 病理検査室の役割はとても大きくなっています

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