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てるえちゃわんや
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1 バイオインフォマティクス実習テキストリンク集産総研生命情報工学研究センター広川貴次

2 目次 1. 遺伝子配列アミノ酸配列を取得するホモロジー検索 PCR のプライマーを設計するインターネットを利用したタンパク質立体構造予測複数配列のアラインメント配列解析による標的タンパク質同定統合データベースを用いた標的タンパク質同定タンパク質立体構造に基づく機能推定タンパク質立体構造に基づく酵素活性部位予測

3 1. 遺伝子配列アミノ酸配列を取得する概略代表的な分子生物学データベースの多くはセントラルドグマで記述されるような階層に沿って分類することができます分類は大きく DNA RNA 配列などの塩基配列データベースアミノ酸配列データベースタンパク質立体構造データベースに分けらますがデータベース開発の歴史的背景や管理運営の拠点フォーマットの独自性から塩基配列データベースを見ても3つのデータベース (DDBJ GenBank EMBL) が存在します最近では登録されている遺伝子やタンパク質は同じ階層分類にあるデータベース間ではほとんど重複していますが階層間の登録数には大きな違いがあります特にタンパク質立体構造データベースは原子座標決定に X 線や NMR などの実験技術を用いているため塩基配列やアミノ酸配列に比べると登録数が少ないのが現状です操作 1 GenomeNet を使った配列取得 GenomeNet システムを使って配列情報を取得します例題としてヒト上皮成長因子受容体遺伝子を用います最初にタンパク質アミノ酸配列データベース UniProt で検索しその後 DR 項目を使って GenBank や PDB のエントリーを調べます GenomeNet にアクセスします GenomeNet のホームページ上部にある Search リストからタンパク質アミノ酸配列データベース UniProt をクリックします 3

タイトルを確認して目的の遺伝子を示すエントリーを選択することが重要ですまた UniProt 検索結果は塩基配列データベース EMBL

4 図 UniProt の選択上皮成長因子受容体遺伝子のキーワードである EGFR と生物種を特定するための human を検索フォームに入力します通常限定したキーワードを用いない限り検索結果はいくつかの候補を出力します例えば今回の場合は VEGFR( 血管内皮増殖因子受容体 ) が含まれていますのでタイトルを確認して目的の遺伝子を示すエントリーを選択することが重要ですまた UniProt 検索結果は塩基配列データベース EMBL からタンパク質コード領域をアミノ酸配列に変換した TrEMBL データベースにも検索を実行しています tr: で始まるエントリーは TrEMBL に対する検索結果となります sp: で始まるエントリーは SwissProt に対する検索結果となります EGFR 検索結果 4

5 データベース内容を確認しますここでは検索結果より sp:egfr_human を選択しますデータベースには登録日や配列アノテーション更新日酵素番号や関連論文など記載されていますアミノ酸配列情報はページの最後にあります先頭にある SQ をクリックすると一行目に > で始まるタイトル行と二行目以降にアミノ酸配列の一文字表記が連なったテキストが表示されますこの書式を FASTA 形式と言いますいろいろな解析の基本となる重要な入力形式です図 FASTA 形式データベースの DR 行目を利用して他のデータベース上の関連エントリーを調べることができます塩基配列情報は GenBank や EMBL 立体構造情報は PDB をクリックします関連エントリーは単一でない場合があります塩基配列の場合 mrna としてのエントリーもあれば任意のエクソン領域のエントリーもあります立体構造情報でも実験手法の違いやリガンド結合状態変異体などによって同一遺伝子でも複数のエントリーが存在します各エントリーの記述を確認して利用目的に合ったエントリーを選択することが重要です図他のデータベースへのリンク情報を示す DR 項目 5

操作 2 ゲノム種別配列の取得 NCBI の FTP サイトより例題として枯草菌ゲノムの配列情報を取得しますユーザーインターフェースを使って個々の遺伝子を検索したときと違いここでは枯草菌ゲノムの全配列データの取得を行います Web 経由で NCBI の FTP サイトにアクセスする http://www.ncbi.nlm.nih.

subtilis ( 枯草菌 ) フォルダをクリックします ( 図 9) 図枯草菌データの選択このフォルダには枯草菌ゲノムの様々なデータ存在し拡張子で分類されています代表的な配列データは全塩基配列 (*.fna) 遺伝子コード領域の塩基配列(*.ffn) 遺伝子コード領域のアミノ酸配列 (*.faa) RNA 塩基配列 (*.

6 操作 2 ゲノム種別配列の取得 NCBI の FTP サイトより例題として枯草菌ゲノムの配列情報を取得しますユーザーインターフェースを使って個々の遺伝子を検索したときと違いここでは枯草菌ゲノムの全配列データの取得を行います Web 経由で NCBI の FTP サイトにアクセスする上記の NCBI/FTP の Web サイトより Genome Assembly/Annotation Projects をクリックします図 Genome Assembly/Annotation Projects の選択枯草菌ゲノムのフォルダに移動しデータを取得します Bacteria フォルダをクリックします続いて Bacillus subtilis ( 枯草菌 ) フォルダをクリックします ( 図 9) 図枯草菌データの選択このフォルダには枯草菌ゲノムの様々なデータ存在し拡張子で分類されています代表的な配列データは全塩基配列 (*.fna) 遺伝子コード領域の塩基配列(*.ffn) 遺伝子コード領域のアミノ酸配列 (*.faa) RNA 塩基配列 (*.frn) ですそれぞれのファイルは FASTA 形式となっています ffn faa frn ファイルは複数の FASTA 形式が連なった状態になっています必要なファイルをダウンロードして比較ゲノムやプロテオーム解析などに利用しますなお Bacteria フォルダ下の Complete.txt や InProgress.txt にゲノム配列解析完了進行中の生物種情報がまとめられていますので目的とする生物種のゲノム解析進捗状況も確認できます 6

7 図各種配列データ 7

8 2. ホモロジー検索概略進化的に共通な祖先を持つ遺伝子タンパク質間の関係をホモログといいますホモロジー検索とはある任意の配列に対するホモログ配列を塩基配列もしくはアミノ酸配列データベースから配列類似性の尺度に基づいて検索する技術ですホモロジー検索のような配列比較は配列 - 構造 - 機能の関係を調べる基本的な解析の一つで特に構造や機能が未知の遺伝子タンパク質は構造機能既知の配列データベースに対してホモロジー検索を行うことで機能や構造を推定することができます通常問い合わせ配列は塩基配列かアミノ酸配列で表現され問い合わせ先となるデータベースはチュートリアル1で紹介した DNA RNA 塩基配列データベース (DDBJ GenBank EMBL) やタンパク質アミノ酸配列 (UniProt PIR PRF) 立体構造データベース (PDB) になります配列類似性の比較は塩基配列でもアミノ酸配列でも可能ですがアミノ酸配列レベルでの比較が有効とされています DNA 配列に起こりうる変異にはアミノ酸配列に変化を与えないもの (Synonymous) があることや 4つの塩基で表現される塩基配列より20 種のアミノ酸残基によるアミノ酸配列を用いた配列比較の方がより明確に進化的関係を表すことができるからですまた 6フレーム変換を用いることで DNA 配列が問い合わせ配列の場合でもタンパク質アミノ酸配列立体構造データベースに対してホモロジー検索できますただし DNA 配列に非コード領域が含まれていないかなど予め確認が必要です操作 1 BLAST(Web サーバー ) を使った配列検索 NCBI サイトの BLAST を使ってヒト上皮成長因子受容体遺伝子 EGFR のアミノ酸配列を問い合わせとして検索を行います EGFR HUMAN の配列取得はチュートリアル1を参考にするか下記のサイトを参照ください NCBI の BLAST にアクセスしますこの実習ではアミノ酸配列を問い合わせ配列としてタンパク質アミノ酸配列立体構造データベースにホモロジー検索をしますので Protein-protein BLAST (blastp) をクリックします 8

図 blastp の選択ブラウザの編集機能を使って EGFR_HUMAN のアミノ酸配列をコピーし BLAST ページの Search カラムにペーストします Choose database は nr の設定にしておきます nr とは非冗長のアミノ酸配列データベースセットで GenBank CDS translations RefSeq Proteins PDB

9 図 blastp の選択ブラウザの編集機能を使って EGFR_HUMAN のアミノ酸配列をコピーし BLAST ページの Search カラムにペーストします Choose database は nr の設定にしておきます nr とは非冗長のアミノ酸配列データベースセットで GenBank CDS translations RefSeq Proteins PDB SwissProt PIR PRF から集められています BLAST! ボタンをクリックし検索を実行します図 BLAST の実行検索が実行されると最初にタンパク質ドメインの検索結果が出力されます ( これは NCBI サイトの BLAST 独自のオプションですドメイン情報は構造や機能を推定することに活用できます ) BLAST の結果は Format! をクリックすると別ウィンドウ 9

が起動し結果が出力されます図ドメイン検索結果出力の最初では検索でヒットした配列と問い合わせ配列間のアラインメントスコアと領域が視覚的に表現されています ( 図 4) これはクリッカプルマップになっていますので興味のあるヒットを選択するとアラインメント情報へジャンプします図ヒット結果の表示続いてヒットした配列のリストが出力されています Socre や E-value のほか G や

10 が起動し結果が出力されます図ドメイン検索結果出力の最初では検索でヒットした配列と問い合わせ配列間のアラインメントスコアと領域が視覚的に表現されています ( 図 4) これはクリッカプルマップになっていますので興味のあるヒットを選択するとアラインメント情報へジャンプします図ヒット結果の表示続いてヒットした配列のリストが出力されています Socre や E-value のほか G や S といったアイコンがリストの右側に付加されていますこれらは Entrez( 第 2 部 - 1の概説参照 ) の Gene データベースと Structure データベースへのリンクを意味していますリストの先頭箇所をクリックするとヒットした配列の詳細情報を調べることができますまた Score 箇所をクリックすると問い合わせ配列とヒットした配列のアラインメント情報へジャンプします 10

図結果の詳細アラインメント結果は上段に問い合わせ配列下段にヒット配列中段に一致度に関する情報で表現されています中段では上段と下段で文字が一致している場合はその文字が記され一致していない場合は空白となっていますただし文字の不一致でもアミノ酸残基の性質が似ているもの同士であれば +が記されています

11 図結果の詳細アラインメント結果は上段に問い合わせ配列下段にヒット配列中段に一致度に関する情報で表現されています中段では上段と下段で文字が一致している場合はその文字が記され一致していない場合は空白となっていますただし文字の不一致でもアミノ酸残基の性質が似ているもの同士であれば +が記されています図アラインメントの詳細問い合わせ配列には X でマスクされる領域が存在することがありますこれは BLAST のフィルタリングが働いていることを意味していますこのフィルタリングは Proline-rich 領域などの繰り返し配列を検索前にマスクする機能をもっていますこれにより有意でない一致がスコアに影響を与えないようになっています 11

3.PCR のプライマーを設計する概略遺伝子解析の基盤技術である PCR( ポリメラーゼ連鎖反応 ) においてプライマーの設計は伸長効率が良く特異性が高い PCR を実現するための重要な課題の一つですコンピュータによるプライマー設計ツールとは入力配列 (DNA 配列 ) に対してプライマー長伸長サイズ GC 含量オリゴヌクレオチド融解温度 ( 以下 Tm 値 )

12 3.PCR のプライマーを設計する概略遺伝子解析の基盤技術である PCR( ポリメラーゼ連鎖反応 ) においてプライマーの設計は伸長効率が良く特異性が高い PCR を実現するための重要な課題の一つですコンピュータによるプライマー設計ツールとは入力配列 (DNA 配列 ) に対してプライマー長伸長サイズ GC 含量オリゴヌクレオチド融解温度 ( 以下 Tm 値 ) などのパラメータを調整しながら候補となる最適なプライマーを出力するものですプライマー設計ツールによっては複数配列を入力してマルチプルアラインメント ( 第 2 部 -5) の結果から保存度の高い領域を同定しプライマー設計に利用するものもありますプライマー設計ツールは PCR 以外にも DNA シークエンシングやクローニングにも利用されています設計されたプライマーは BLAST などのホモロジー検索ツールも併用して特異性を調べるのも良いでしょう ( 問い合わせ配列長が短いので検索結果の判断には注意が必要です ) 操作 1 p53 配列の取得チュートリアル 1 を参考に GenomeNet の Search カテゴリから GenBank を選択します検索フォームに癌抑制遺伝子 p53 のデータベース ID である BC を入力し検索しますデータベース中に ORIGIN という配列情報の項目がありますこれをクリックすると塩基配列情報のみ表示されますのでこれをコピーしておきます操作 2 Primer3 による解析 Primer3 の Web サイトにアクセスします操作 1 で取得した入力配列はヒト由来であるため Misprinting Library (repeat library) から HUMAN に設定しますつづいて操作 1 でコピーした p53 の配列を入力フォームにペーストします図配列の入力 Primer3 のパラメータは適宜デフォルト設定値を参考にして調整しますここではデフォルト値のまま実行しますもし結果を見てより多くの候補プライマーをリストアップしたい場合には各パラメータの上限下限値の調整の他 Product Size 12

13 Range に新たなサイズ範囲の追加や Number of Return の値を高く設定して再実行します図パラメータ設定領域検索結果として Primer3 の出力のヘッダにはタイトルが表示されます ( タイトル名は FASTA 形式の > 行の内容やパラメーラ項目の Sequence ID に入力した情報が反映されます ) 続いて検索結果として候補プライマーから選ばれた最適なプライマーの結果が Tm 値などの情報とともに表示されます図検索結果これはパラメータ設定時に指定した Opt 値に近いものや Product Size Range の優先順位が反映されていますさらにプライマー箇所は入力配列上に >>>>>> 13

14 や <<<<<< で示されていますその他の候補プライマーは ADDITIONAL OLIGOS 項目に列挙されています検索結果の末尾には Statistics 項目がありどのパラメータ項目でプライマーが除外されたかが確認できますのでこの情報を参考しパラメータ調整を行ってもよいでしょう図検索結果詳細 14

15 4. インターネットを利用したタンパク質立体構造予測概略タンパク質立体構造予測とは立体構造未知のタンパク質に対して配列情報から計算機的手法により立体構造を予測するもので最近では予測精度の向上や便利なウェブツールが公開されていることからタンパク質立体構造予測を利用するバイオ実験研究者も増えてきています代表的なタンパク質立体構造予測法として構造既知のタンパク質 ( 鋳型タンパク質 ) との配列相同性 (30% 以上 ) に基づいて予測するホモロジー ( 比較 ) モデリング法が挙げられます一般に配列相同性が高ければ予測される構造の信頼度も高くなりますここではインターネットを利用して比較的簡単に利用できる SWISS-MODEL を紹介します構造構築後の極小化計算などが簡易に行われているため例えば折りたたみ構造の確認や部位特異的変異箇所の解析など厳密なモデルを必要としない解析に向いています (First Approach Mode の場合 ) 操作 1 SWISS-MODEL へのアクセス SWISS-MODEL の Web サイトにアクセスします画面左側にある Menu の First Approach Mode をクリックします図 SWISS-MODEL のトップページとメニューの選択操作 2 配列の入力と実行予測結果の送付先となる電子メールアドレスプロジェクトタイトル ( 実行名のような 15

もの ) を入力しますそして対象タンパク質のアミノ酸配列 ( 一文字表記 ) を入力 ( ペースト ) します入力が完了したら Submit Modelling Request をクリックします図入力項目しばらくすると予測結果が表示されます問い合わせ配列のどの部分が構造予測できたを示す図に続いて鋳型となったタンパク質の情報が表示されます図の場合は

16 もの ) を入力しますそして対象タンパク質のアミノ酸配列 ( 一文字表記 ) を入力 ( ペースト ) します入力が完了したら Submit Modelling Request をクリックします図入力項目しばらくすると予測結果が表示されます問い合わせ配列のどの部分が構造予測できたを示す図に続いて鋳型となったタンパク質の情報が表示されます図の場合は PDB-ID で 1qtq というエントリーの A 鎖を鋳型としたことになります構造予測が終了した知らせやアクセスのためのパスワードなどは入力項目で入力した電子メールアドレス宛にメールが届きます図 1 予測結果画面操作 3 予測構造のダウンロード鋳型タンパク質の情報の下に display model や download model という項目があります 16

PDB 形式でデータをダウンロードする場合には download model 行にある as pdb をクリックしデータを保存します図予測構造のダウンロード予測結果のページには構造予測に用いた入力配列と鋳型タンパク質間のアラインメントも表示されていますこの情報は鋳型タンパク質で機能部位が明らかな場合予測したタンパク質のどの部位に対応するのか

17 PDB 形式でデータをダウンロードする場合には download model 行にある as pdb をクリックしデータを保存します図予測構造のダウンロード予測結果のページには構造予測に用いた入力配列と鋳型タンパク質間のアラインメントも表示されていますこの情報は鋳型タンパク質で機能部位が明らかな場合予測したタンパク質のどの部位に対応するのかまたアラインメント情報にさかのぼって予測構造を修正したい場合などに必要となりますホモロジーモデリングで予測した構造の精度は鋳型タンパク質との配列相同性に依存してきます SwissModel_TraceLog ファイルを確認して予測した構造が鋳型タンパク質とどのくらいの配列相同性に基づいて構築されたものかをきちんと把握しましょう例えば予測したタンパク質構造と低分子の相互作用解析などを目的とする場合は約 90% 以上の配列相同性に基づいたホモロジーモデリングにより得られた構造が必要だといわれています操作 4 予測構造の評価 SWISS-MODEL サーバーでは予測した構造に対する評価を行うことができます Anolea/Gromos/Verify3D の 3 種類の評価法を選択することができます以下 Verify3D を用いた予測構造の評価を行います Verify3D では解像度の高い代表的な結晶構造データセットに基づく統計的な解析から天然構造に見られる残基毎のタンパク質内部への埋没度合いと周りをとりまく極性環境非共有結合のパターン等を指標化し実際の予測構造がその指標にどれだけ則しているかによって予測構造の質を評価することができますデフォルトで on になっている anolea を off に変更後 verify3d を on にして show ボタンをクリックします図 Verify3D の選択解析結果は残基番号 ( 横軸 ) と 3D-1D プロファイルスコア ( 縦軸 ) のプロットが表 17

示されます 3D-1D プロファイルは値が高い領域ほど統計的な天然構造の折りたたみ環境 ( アミノ酸残基の内部構造への埋没度合いと周りの極性環境 ) に近いことを示していますプロファイル値が 0 以下については折りたたみ状態が適切ではないことを示唆しています図 Verify3D の解析プロット縦軸のプロファイル値が 0 を下回っている場合は対応する位置の SWISS-MODEL

18 示されます 3D-1D プロファイルは値が高い領域ほど統計的な天然構造の折りたたみ環境 ( アミノ酸残基の内部構造への埋没度合いと周りの極性環境 ) に近いことを示していますプロファイル値が 0 以下については折りたたみ状態が適切ではないことを示唆しています図 Verify3D の解析プロット縦軸のプロファイル値が 0 を下回っている場合は対応する位置の SWISS-MODEL の出力ファイルの中の鋳型タンパク質とのアラインメントを修正し再度モデル構築を行うことで改善されることがあります他の改善策として分子力学分子動力学計算を用いて最適化構造を構築する方法もありますが計算機資源が必要なことや専門的な知識も必要とするため中上級者向けとなります操作 5 Workspace の活用 SWISS-MODEL では一度解析を行った際に電子メールアドレスをユーザー名とした Workspace と呼ばれるアカウントのようなものが作成されます過去のジョブの表示や次回の構造予測などは Workspace へログインして行うことができますログインのためのパスワードは最初に解析した際にメールで連絡がありますので大切に保存してくださいログインはモデリングページのヘッダ部分から行えます 18

19 図 Workspace へのログインページ 19

20 5. 複数配列のアラインメント概略配列アラインメントはホモロジー検索のように2つの DNA RNA もしくはタンパク質間で配列類似性 ( ペアワイズアラインメント ) を調べる目的だけではなく例えば特定の遺伝子ファミリーについて複数配列間のアラインメントを行うこと ( マルチプルアラインメント ) で共通に保存されている配列領域を発見することもできますこのような配列領域は配列モチーフと呼ばれ機能や構造について重要な知見を与えますまた遺伝子の系統樹を作成する時にもマルチプルアラインメント結果が利用されています複数配列をアラインメントする場合にも動的計画法が基本となりますが多次元の動的計画法が計算量の問題から現実的に困難であるためペアワイズアラインメントを積み上げ式に実行するようなツリーベース法や反復改善法などの手法が用いられています操作 1 Clustal X によるマルチプルアラインメントの実行ローカルマシンで実行できる Clustal X を用いたマルチプルアラインメントの実行方法を紹介しますここでは Windows 版を例に紹介しますが Macintosh 版でも同様の手順となります以下のサイトから Clustal X を取得しますバージョンやプラットフォームを確認後ファイル (zip ファイル ) をダウンロードしますここでは Windows 環境で稼動する clustalx1.8.msw.zip をダウンロードし WinZip など ( ファイル圧縮解凍ソフトウェア ) を利用して解凍しますファイルの解凍先のフォルダ名には日本語が含まれないように注意してください解凍後は複数のファイルが展開されますがその中に clustalx.exe という実行形式のファイルがありますこのファイルをクリック ( もしくはコマンドプロンプトからの実行 ) すると Clustal X が起動します File メニューから Load Sequences を選択しますここではチュートリアル用に ClustalX パッケージに用意されている globin.pep を入力ファイルに指定します Clustal X では多くの入力形式に対応していますが各自で入力ファイルを用意する場合には FASTA 形式が最もよく利用されています (globin.pep は NBRF/PIR 形式と呼ばれる FASTA 形式に似たファイル形式で記述されています ) 20

21 図 Clustal X の起動とファイルの読み込み globin.pep を読み込むとアラインメントされていない7つのタンパク質配列が含まれていることがわかりますマルチプルアラインメントの実行は Alignment メニューから Do Complete Alignment を選択します出力ファイル名を確認後 ALIGN ボタンをクリックすると計算が実行されます Clustal X ではアラインメント結果の他に各アラインメント位置における保存性を反映させたスコアがウィンドウの下部にグラフ表示されます図アラインメントの実行と結果 21

6. 配列解析による標的タンパク質同定概略タンパク質配列の機能を推定する場合 BLAST のような配列相同性に基づく方法の他にモチーフ検索や膜タンパク質予測局在予測などがありますこれらは配列相同性検索などでは判断することが困難な場合に非常に役に立ちます例えばモチーフ検索結果でキナーゼによく存在する機能モチーフが見つかれば対象とする配列がキナーゼドメインである可能性が示唆されますし

22 6. 配列解析による標的タンパク質同定概略タンパク質配列の機能を推定する場合 BLAST のような配列相同性に基づく方法の他にモチーフ検索や膜タンパク質予測局在予測などがありますこれらは配列相同性検索などでは判断することが困難な場合に非常に役に立ちます例えばモチーフ検索結果でキナーゼによく存在する機能モチーフが見つかれば対象とする配列がキナーゼドメインである可能性が示唆されますし結果として抗がん剤標的タンパク質と考えることができるかもしれませんまたシグナルペプチド予測の結果シグナルペプチドが推定された場合分泌タンパク質だと考えることができます膜タンパク質予測では G タンパク質共役型受容体やイオンチャネルなど創薬標的タンパク質に関連した考察ができます局在予測では核移行やミトコンドリア局在なども予測結果から生物学的な機能を推定することも可能です本チュートリアルでは標的タンパク質同定を目的にモチーフ検索として InterPro シグナルペプチド予測に SignalP 膜タンパク質予測に TMHMM 局在予測に PSORT を用いて実習を行います操作 1 InterPro を用いたモチーフ検索 InterPro の Web サイトへアクセスします問い合わせ配列を入力するページに移動します InterProScan をクリックします図 InterPro トップページ解析を行いたい配列データ ( アミノ酸一文字表記の文字列 ) を InterPro の配列入力フ 22

その内訳となる各モチーフデータベースの検索結果が ID 配列上のモチーフ位置のグラフィックスおよびモチーフ名で表示されます図モチーフ検索結果表示画面

23 ォームにコピー & ペースト入力し Submit Job をクリックします ( 本チュートリアルではヒトの Early growth response protein の配列を用いています ) 図配列入力画面検索結果は InterPro 上のモチーフ ID とその内訳となる各モチーフデータベースの検索結果が ID 配列上のモチーフ位置のグラフィックスおよびモチーフ名で表示されます図モチーフ検索結果表示画面モチーフ箇所を示す場所にマウスポインタを合わせると残基番号が表示されますまた PD***** や PF***** といった各モチーフ ID をクリックするとそのモチーフの詳細情 23

報を確認できます図モチーフ詳細画面へのリンク操作 2 SignalP を用いたシグナルペプチド予測 SignalP の Web サイトへアクセスします http://www.cbs.dtu.

24 報を確認できます図モチーフ詳細画面へのリンク操作 2 SignalP を用いたシグナルペプチド予測 SignalP の Web サイトへアクセスしますトップページに配列入力フォームがありますのでそこに IntePro の時と同様に解析したいタンパク質のアミノ酸配列をコピー & ペーストにて入力します ( 本チュートリアルではヒトの Secretogranin-5 の配列を用いています ) 図 SignalP のトップ画面解析するタンパク質の生物種に応じて Organism group のパラメータを選択しますその他のパラメータは特に変更する必要はございません Submit ボタンをクリックして解析を実行します計算結果はニューラルネットワーク (SignalP-NN result) と HMM(SignalP-HMM result) のそれぞれの解析についてグラフィックス及びテキスト形式で出力されます 24

25 図ニューラルネットワークによる解析結果ニューラルネットワークでは既知のシグナルペプチドを持つタンパク質のデータセットで学習されたネットワークに基づいて 3 つのスコアでシグナルペプチドの可能性を判断します C score S score Y score はそれぞれ切断部位シグナルペプチド領域 S score を考慮した切断部位のスコアを表していますこれらのスコアをまとめた結果がテキストとして出力されます HMM の結果では切断部位 (Cleavage prob.) N 末端領域 (n-region prob.) 疎水的領域(h-region prob.) そして疎水性領域から切断部位までの領域 (c-region prob.) になりやすい確率をそれぞれスコア化しています SignalP-NN と SignalP-HMM の両者が同じ予測結果を示すことが理想となります操作 3 PSORT による局在予測 PSORT の Web ページへアクセスします解析したい配列の生物種によって各 PSORT(WoLF PSORT, PSORT II, PSORT, ipsort, PSORT-B) を選択します本チュートリアルではグ Importin alpha-1 subunit を例に PSORTT II を使って解析を行います 25

26 図 PSORT バージョンの選択解析したい配列 ( 一文字表記 ) をアミノ酸配列入力フォームにコピー & ペーストで入力し Submit ボタンをクリックします図配列情報の入力 PSORT では複数の解析プログラムの解析結果よりシグナルペプチドや局在を予測します Importin alpha-1 subunit の解析結果ではシグナルペプチドおよび膜貫通領域を持たないことがわかりますまた局在予測についてはミトコンドリア局在シグナル解析等を考慮しながら最終的な局在可能性を出力します今回の解析では細胞質 (cytoplasmic) および核 (nuclear) への局在の可能性が高いと予測されています 26

27 図局在予測結果 27

7. 統合データベースを用いた標的タンパク質同定概略標的タンパク質同定にはチュートリアル 2 で紹介した配列情報解析に基づいて同定する他に統合化データベースを用いた方法があります近年の統合データベースは配列 - 構造といったタンパク質の階層性のリンクだけではなく関連したリガンド情報やパスウェイ情報まで網羅したデータベースとなっていますこのような統合データベースには KEGG や

28 7. 統合データベースを用いた標的タンパク質同定概略標的タンパク質同定にはチュートリアル 2 で紹介した配列情報解析に基づいて同定する他に統合化データベースを用いた方法があります近年の統合データベースは配列 - 構造といったタンパク質の階層性のリンクだけではなく関連したリガンド情報やパスウェイ情報まで網羅したデータベースとなっていますこのような統合データベースには KEGG や DrugBank が有名です特に DrugBank は KEGG の内容も包括しておりまたリガンドについても医薬品としての情報リソースまで関連付けがされていますので創薬標的タンパク質で利用しやくなっています操作 1 DrugBank を利用した化合物遺伝子情報検索 DrugBank の Web サイトにアクセスしますトップページにあるキーワード検索入力フォームを利用して検索を行いますキーワードにインフルエンザ治療薬の一つである tamiflu を入力し Search ボタンをクリックします図 DrugBank のトップページ検索結果一般名 Oseltamivir Phosphate として化合物がヒットします詳細を確認するために DrugBank の Accession No である APRD01148 をクリックします 28

図キーワード tamiflu の検索結果詳細データでは Oseltamivir Phosphate の構造式や KEGG や PubChem など他の化合物データベースとのリンク薬理活性等の情報が記載されています図リガンド分子構造情報化合物情報に続いて Oseltamivir Phosphate が標的とするタンパク質の情報 (Drug Target 1)

29 図キーワード tamiflu の検索結果詳細データでは Oseltamivir Phosphate の構造式や KEGG や PubChem など他の化合物データベースとのリンク薬理活性等の情報が記載されています図リガンド分子構造情報化合物情報に続いて Oseltamivir Phosphate が標的とするタンパク質の情報 (Drug Target 1) が記載されています化合物によって複数の標的タンパク質が存在する場合には Drug Target 2, 3 と続きますここでは標的タンパク質の一次配列機能 ( 学術的記載や GeneOntology 分類 Pfam モチーフなど ) DNA 配列染色体位置などが列挙されていますまた標的タンパク質によっては Pathway マップへのリンクも含まれています 29

Nutraceutical Drugs, Experimental Drugs, All が選択可能となっています本チュートリアルでは初期設定のまま検索を実行します Show Similar

30 図標的タンパク質情報操作 2 Tamiflu をクエリーとした類似化合物検索 Tamiflu の検索結果のページの上部に Show Similar Structure(s) ボタンがありますこれにより化合物構造を基とした類似構造検索が可能です検索対象は初期設定では Approved Drug( 認可済医薬品 ) となっていますが Small Molecule Drugs, Biotech Drugs, Nutraceutical Drugs, Experimental Drugs, All が選択可能となっています本チュートリアルでは初期設定のまま検索を実行します Show Similar Structure(s) ボタンをクリックします図類似化合物の検索検索の結果 9 個の類似化合物がヒットし類似性スコアによってソートされています ( この結果はデータベースの更新に伴い変化する可能性があります ) 30

をクリックします図 ChemQuery メニューの選択 ChemQuery ではスケッチツールを使って分子構造を構築します右のパレットから原子を選択しマウスの右ボタンを使って描画します

31 図 Tamiflu の類似構造検索結果それぞれのヒットの詳細は ACCESSION CODE カラムの DRUGCARD ボタンをクリックすると確認できます操作 2 化合物構造による検索操作 1では tamiflu という物質名称で検索を行いましたが DrugBank ではブラウザ上で化合物の構造式を直接スケッチして検索することができますメニュー項目の ChemQuery をクリックします図 ChemQuery メニューの選択 ChemQuery ではスケッチツールを使って分子構造を構築します右のパレットから原子を選択しマウスの右ボタンを使って描画します結合次数は結合線をクリックすると単結合から変更可能な結合まで簡単に修正できます上のパレットの左から三番目にある Template ボタンをクリックすると環状構造など頻繁に利用される部分構造が用意されています 31

図スケッチ機能による問い合わせ化合物の構築分子構造のスケッチが終了しましたら CLICK TO CONVERT TO MOL FILE ボタンをクリックし続いて CLICK TO SUBMIT QUERY をクリックすると検索が実行します操作 3 標的タンパク質の配列情報に基づく検索操作 1 2では化合物情報に基づいた検索を行いました DrugBank では

32 図スケッチ機能による問い合わせ化合物の構築分子構造のスケッチが終了しましたら CLICK TO CONVERT TO MOL FILE ボタンをクリックし続いて CLICK TO SUBMIT QUERY をクリックすると検索が実行します操作 3 標的タンパク質の配列情報に基づく検索操作 1 2では化合物情報に基づいた検索を行いました DrugBank では標的タンパク質の配列の相同性を用いて DrguBank にエントリーされている標的タンパク質と関連化合物の情報を検索することができますメニュー項目の SeqSearch をクリックしますページにはアミノ酸配列入力フォームがありますので検索したい配列をコピー & ペーストで入力します相同性検索には BLAST が用いられます図 DrugBank の BLAST 検索ページ 32

33 検索結果は通常の BLAST 出力と同等ですが各ヒットタンパク質に DrugBank の Accession No がついていますのでその Accession No をクリックすると詳細情報を確認できます図 DrugBank の BLAST 出力結果 33

8. タンパク質立体構造に基づく機能推定概略構造ゲノミクスの進展によって配列と立体構造がわかっているが機能が未知のタンパク質に遭遇することが増えてきていますタンパク質の表面形状は機能を予測する最も有用な情報の一つになります CASTp はタンパク質立体構造データ (PDB 形式 ) を入力情報に活性ポケット候補部位を検索し

34 8. タンパク質立体構造に基づく機能推定概略構造ゲノミクスの進展によって配列と立体構造がわかっているが機能が未知のタンパク質に遭遇することが増えてきていますタンパク質の表面形状は機能を予測する最も有用な情報の一つになります CASTp はタンパク質立体構造データ (PDB 形式 ) を入力情報に活性ポケット候補部位を検索しポケットの体積や周辺残基の情報をグラフィックスを使いながら解析できる Web サイトです CASTp などによる活性ポケット候補探索は創薬におけるドッキング計算のドッキング部位入力情報としても活用できますまた活性ポケットの体積情報を利用した化合物サイズの簡単なスクリーニング処理にも応用できます操作 1 CASTp を用いた活性ポケット候補部位探索 CASTp の Web ページへアクセスします CASTp では PDB-ID(4 文字 ) で検索するのが一般的な利用方法となりますトップページに PDB-ID を入力する Query フォームがあります本チュートリアルでは HIV プロテアーゼを代表して 1hte という PDB-ID を持つタンパク質を入力情報とします Query フォームに 1hte を入力後 Search ボタンをクリックします図 CASTp のトップページ検索結果は中央に 1hte の立体構造左側に候補ポケットリスト右側に PDB ファ 34

同時に左下のエリアに選択したポケット周辺に存在する残基リストが表示されますこの残基リストは配列ウィンドウのアノテーションと同調しています図候補ポケットの表示操作 2

35 イルに記載されているアノテーション情報下側の配列ウィンドウで構成されています図 CASTp 解析ページ候補ポケットの観察には表面積 (Area) や体積 (Vol) を参考に興味のあるポケット ID のチェックボックスにチェックを入れますその結果ポケットの該当箇所が中央部のタンパク質立体構造のグラフィックスにアノテーションされます同時に左下のエリアに選択したポケット周辺に存在する残基リストが表示されますこの残基リストは配列ウィンドウのアノテーションと同調しています図候補ポケットの表示操作 2 自前のタンパク質構造を入力とした CASTp 解析方法操作 1のように解析対象のタンパク質が PDB に登録されていない場合 ( たとえばモデリングによりタンパク質立体構造を予測した結果を PDB ファイル形式で保有してい 35

る場合 ) でも CASTp ではデータファイルをサーバー上で Upload して解析を行うことができますトップページの左側のメニューから Calculation Request を選択します図 Calculation Request ページへのリンク Calculation Request でも

36 る場合 ) でも CASTp ではデータファイルをサーバー上で Upload して解析を行うことができますトップページの左側のメニューから Calculation Request を選択します図 Calculation Request ページへのリンク Calculation Request でも PDB-ID を指定することが出来ますその下にファイルを Upload する項目あります解析したい立体構造データを PC などに用意して参照ボタンで PC 内のデータを選択します指定後 Submit ボタンでポケット候補探索が実行されます結果は操作 1と同様な形式で出力されます図構造データのアップロード 36

37 9. タンパク質立体構造に基づく酵素活性部位予測概略タンパク質の機能には配列の相同性や構造のフォールドが異なるが共通した酵素活性機能を有しているものがありますこのような場合配列相同性や配列情報に基づくモチーフ立体構造予測だけでは機能予測が困難です一方で酵素のように酵素活性部位の構造について研究が進んでいる分野では細かな活性部位に関する情報のデータベース化が進んでおります Catalytic Site Atlas は酵素活性部位に関するデータベースと解析ツールが備わった Web サイトです特にタンパク質立体構造情報を入力情報として与えれば JESS と呼ばれる酵素活性部位テンプレートの検索を行うことができますこれにより全体の折りたたみ構造や全体の配列相同性に依存なく活性部位を予測することができます Catalytic Site Atlas は CASTp と同様タンパク質立体構造情報に基づく機能予測手法の一つとして広く利用されています操作 1 Catalytic Site Atlas を用いたタンパク質立体構造に基づく酵素活性部位検索 Catalytic Site Atlas の Web ページへアクセスしますトップページからさらに webserver をクリックして解析のページに移動します図 Catalytic Site Atlas のトップページ操作 2 データの読み込みと解析の実行 Catalytic Site Atlas では既知の PDB に対して PDB-ID 等を検索情報に酵素活性部位を検索するモードと PDB に登録されていないタンパク質立体構造データに対して 37

アミノ酸側鎖のα 位および β 位の炭素原子座標に基づいて行いますので入力構造が予測構造や側鎖配座の精度があまり高くない場合に選択します後者は酵素活性に関与する原子の座標に基づくものです図解析データのアップロード

38 既知の酵素活性部位テンプレートを用いて類似部位がないかを検索するモードの2つがあります前者の場合には PDB-ID を後者の場合には参照ボタンより自前の PC にある立体構造データ (PDB 形式 ) をアップロードし Submit Settings ボタンをクリックして検索を実行します検索の条件には Alpha and Beta carbon templates と Functional atom templates があります前者の方はアミノ酸側鎖のα 位および β 位の炭素原子座標に基づいて行いますので入力構造が予測構造や側鎖配座の精度があまり高くない場合に選択します後者は酵素活性に関与する原子の座標に基づくものです図解析データのアップロードデータが無事 Upload されたことが確認できるページに変わります続いて酵素活性部位テンプレート検索プログラム JESS を実行します Run JESS をクリックします図テンプレート検索プログラム JESS の実行操作 3 解析結果表示 38

E-value の値には注意しておきましょうまたこの値は Assessment 項目に反映されています Highly probable や Possible を信頼できる結果と考えてよいでしょう図テンプレート検索結果

39 解析結果は Summary テーブルで出力されます例えば図の場合 trna synthetase (PDB-ID: 1qtq) の持つ酵素活性部位に類似した部分構造が入力データ中に見つかったことを示していますヒットした結果はその結果の統計的有意性 (E-value) によって順位付けされています酵素活性部位のような部分構造の検索では実際の活性部位とは関係のないランダムに起こりうるヒット ( 負の答え ) との識別が非常に重要となりますよって E-value の値には注意しておきましょうまたこの値は Assessment 項目に反映されています Highly probable や Possible を信頼できる結果と考えてよいでしょう図テンプレート検索結果 Detail をクリックするとヒットした酵素活性部位の Template 残基と対応する残基を知ることができます図ヒットした活性部位の詳細情報また CSA entry for template 項目の酵素活性部位テンプレート情報 (1qtq) をクリッ 39

40 クすると酵素機能の情報やこのテンプレートを有している主なタンパク質の情報を知ることができますページの後半部分では酵素活性部位テンプレートの座標値と配列相同性の関係や感度予測精度等のデータも表示されています図テンプレートの詳細情報 40

国際塩基配列データベース n DNA のデータベース GenBank ( アメリカ :Na,onal Center for Biotechnology Informa,on, NCBI が運営 ) EMBL ( ヨーロッパ : 欧州生命情報学研究所が運営 ) DDBJ ( 日本 : 国立遺伝研内の日

生物情報工学 BioInforma*cs 3 遺伝子データベース 16/06/09 1 国際塩基配列データベース n DNA のデータベース GenBank ( アメリカ :Na,onal Center for Biotechnology Informa,on, NCBI が運営 ) EMBL ( ヨーロッパ : 欧州生命情報学研究所が運営 ) DDBJ ( 日本 : 国立遺伝研内の日本 DNA データバンクが運営